专利名称：一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵方法及其制备的制剂和应用的制作方法在我国，抗生素作为饲料添加剂使用已有几十年的历史，其促进了动物生产性能的充分发挥，预防了病菌的感染，对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献。但近年来研究表明，抗生素普遍使用亦给人类带来了难以克服的弊端，如引起的内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏、畜禽产品及环境中的药物残留等问题。微生态制剂作为一种新型的抗生素替代品，具有无毒副作用、无耐药性、无残留、 显著减少畜禽有害气体排放等诸多优点，得到了养殖业的肯定，尤其乳酸菌类和芽孢杆菌类。但乳酸菌类抗逆性差，无法耐受饲料加工制粒过程中的高温，同时在常温运输和保藏过程中失活较快。芽孢杆菌类虽具有可以耐受高温、胃酸、胆碱的芽孢，但是不具备乳酸菌所具有的定殖肠道、维持肠道内正常的生态平衡和调节肠道PH等功能。作为一种畜禽用微生态制剂，凝结芽孢杆菌既产乳酸又产芽孢，集乳酸菌类和芽孢菌类微生态制剂的优点于一身，具备其它微生态制剂无可比拟的饲喂功效。首先，凝结芽孢杆菌具备乳酸菌类微生态制剂的特点，可在肠道内定殖，补充有益菌群，调整消化道内环境和微生物区系平衡，在小肠壁形成生物屏障，预防和治疗消化机能紊乱和消化道感染，并可分泌乳酸等酸性物质，调节肠道PH、促进肠道的蠕动，提高消化、吸收功能；其次，凝结芽孢杆菌亦可形成芽孢，具备芽孢菌类微生态制剂的特点，能很好的耐受饲料加工过程中的高温、肠道胃酸、胆碱等，并大大降低运输保藏过程中的失活现象，同时在消化道中能产生多种消化酶、丰富的维生素和未知生长因子等，可起到辅助消化、促进生长的作用。众多研究结果表明凝结芽孢杆菌可促进动物机体的消化吸收、改善动物机体免疫功能、提高动物抗病能力等作用，从而促进动物的生长，降低其死亡率、淘汰率和料肉比。突出的饲喂功能和良好的加工性能，使得凝结芽孢杆菌必将成为饲料微生态制剂行业中不可替代的重要成员O目前，凝结芽孢杆菌在畜禽添加剂方面的应用报道日益增多，但有关其产业化方面的报道相对较少。分析其原因，主要是凝结芽孢杆菌在产业化过程中液体发酵水平低，发酵液经吸附、干燥和粉碎等后处理工艺后，菌体量损失率较高，造成终产品菌体量较低，直接影响了凝结芽孢杆菌菌剂的使用效果，因此，研究出一种高密度凝结芽孢杆菌菌剂的生产方法将会为我国的畜禽养殖业和绿色生态农业带来无限生机。发明内容本发明的目的是提供一种畜禽用高密度凝结芽孢杆菌菌剂及其制备的方法和应用。—种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵的方法，所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)菌种保藏编号CICC No. 20138 (购自中国工业微生物菌种保藏中心)，具体包括以下步骤1)液体发酵所述的菌株的斜面种子经过摇瓶种子培养后接入到发酵罐液体发酵培养，液体发酵培养基配制淀粉9. 0-12. 0g，鱼粉18. 0-22. Og (粉碎至60目)，磷酸氢二钾2. 0-3. 2g， 一水硫酸锰0. 10-0. 30g,七水硫酸镁0. 60-0. 90g,碳酸钙0. 10-0. 30g、氯化钠0. 15-0. 40g 和硝酸钠 0. 10-0. 30g，水加至 IOOOmL,初始 pH = 6. 5-7. 2 ；
发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60%，种子液按照培养基体积的 3-5%接种，发酵罐发酵参数为温度35-40°C、转速220-280r. mirT1、通气量12. 0-14. 0L. miiT1，发酵时间为33-39h ；
本发明所述所用斜面种子活化培养基，摇瓶种子培养基和发酵罐培养基使用前均经过温热灭菌(12rc，30mins)。
2)固体发酵
按培养基25-33%的重量接入液体发酵种子液至固体发酵培养基，发酵温度 34-360C，发酵室内相对湿度控制不低于75%，连续发酵45-51h，定期翻勻一次(一般每隔 12小时)，其中发酵34-3 后，调控温度为38-42°C，同时通风辅助干燥；
固体发酵培养基由麦麸构成，培养基含水量38-42%，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
步骤1)液体发酵完成后菌体量达54. 5-62. OX IO8Cfu. mlL—1。
步骤2)固体发酵完成后菌体量达108. 5-127. OX IO8Cfu. g—1，芽孢率达 71. 3-74. 4%。
步骤2)中麦麸制成培养基之前粉碎为30-50目，80°C条件下间歇干热处理l_3h。
一种畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂是由上述的方法发酵制备而成的产物粉碎得到的。
菌制剂终产品菌体量达102. 4-115. 5 X IO8Cfu. g_1，芽孢率达72. 7-77. 2%0
所述的粉碎采用粉碎机，转速为20000-30000r. mirT1，粉碎时间为7_13s，粉碎目数不低于60目。
所述的畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂用于制备家畜增重和预防腹泻的制剂。具体可将所述的菌制剂添加到饲料中，喂饲家畜(一般使用对象为猪，尤其是断奶仔猪)。在饲料中添加浓度为0. 05wt%。
本发明的有益效果在于，通过液固两步连续变温发酵兼干燥的技术方案大大提升了菌体量(127. OX IO8Cfu. g—1)，菌体量为液体发酵菌体量(62. OX IO8Cfu. πιΓ1)的2. 05 倍，同时通过固体发酵后期变温调控兼干燥的技术方案，使芽孢率从对照的63. 7%提高到 74.4%，加之固体发酵兼干燥全过程是低温进行，能耗小，增强了本发明在畜禽养殖行业的竞争力。

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
(1)液体发酵
a)斜面种子活化将原始种子接种至试管普通营养琼脂斜面培养基，37°C过夜培养Mh。普通营养琼脂斜面培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水加至1L， pH = 6. 5-7. 2)；
b)摇瓶种子培养基将斜面种子接种一环至三环到普通营养肉汤培养基，37°C、 200r. miiT1过夜培养Mh ；普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水加至 1L, pH = 6. 5-7. 2)；
c)将上述种子液按照培养基体积的4%接种到20L发酵罐进行液体培养，培养基体积为发酵罐体积的50% ；
发酵培养基配制淀粉10. 6g. L—1，鱼粉20. 2g. L—1，磷酸氢二钾2. 72g. Γ1, 一水硫酸锰0. 169g. L-1，七水硫酸镁0. 739g. L-1，碳酸钙0. 20g. L—1、氯化钠0. 234g. L-1和硝酸钠 0. 17g. L—1，溶剂为水，初始pH = 7. 0 ；
发酵按培养基体积的4%接种，接种至发酵罐发酵培养基，调控发酵罐发酵参数为温度37°C、转速250r. mirT1、通气量13. 3L. mirT1，待发酵时间为36h，发酵结束，对发酵液进行取样，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测含菌量，重复三次，菌体量达62. 0 X IO8Cfu. mL-1。检测培养基葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂18g，盐溶液IOmL (ImL盐溶液中含有七水硫酸镁5mg，一水硫酸锰lmg，碳酸钙ang，氯化钠5mg)
本实施例所述所用斜面种子活化培养基，摇瓶种子培养基和发酵罐培养基使用前均经过高温灭菌，实施例2和3相同。
(2)固体发酵
a)培养基配置麦麸(粉碎为40目左右，80°C间歇干热处理2h)，含水量40%，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
b)发酵按培养基重量的30%接液体发酵种子液至固体发酵培养基，温度维持在 350C，发酵室内相对湿度控制在75 %以上，连续发酵48h，后1 进行通风干燥，待干燥结束，取样10g，检测菌体量和芽孢量，重复三次，菌体量和芽孢量分别为115.5X108cfu. g-1 和73. 5X IO8Cfu. g—1。菌体量检测方法和检测培养基同实施例1 (1)。芽孢量检测方法取 IOg样品，置90mL无菌水中，80°C水浴热处理lOmins，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测芽孢量，芽孢量检测培养基同实施例1 (1)。
(3)固体发酵后期不同温度调控
实施例1( 固体发酵后期(发酵3 后)，分别按30°C、4(TC和45°C进行固体发酵兼干燥变温处理，以不变温度35°C发酵为对照，待发酵兼干燥结束后，分别取不同变温处理的样品10g，检测菌体量和芽孢量，计算芽孢率，重复三次，检测方法同实施例1( ；结果表明固体发酵后期(发酵3 后)，变温调控为40°C和45°C时，芽孢率分别为74. 4%和 75.9%，优于对照芽孢率63. 7% ；固体发酵后期(发酵3 后)变温调控为40°C时，菌体量和芽孢量均最高，分别为127. OX IO8Cfu. g-1和94. 5. 0X 108cfu. g-1。因此，固体发酵后期 (发酵3 后)选择40°C进行变温调控。
表1固体发酵后期变温调控对菌剂菌体量和芽孢率的影响


本发明公布了一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵方法及其制备的制剂和应用。凝结芽孢杆菌菌种保藏编号CICC No.20138。首先对凝结芽孢杆菌进行液体发酵，然后进行固体变温连续发酵，固体发酵后期进行通风，继续发酵兼干燥，干燥结束，获得凝结芽孢杆菌制剂初产品，经进一步粉碎过筛，获得高密度凝结芽孢杆菌菌剂终产品，终产品菌体数可达115.5×108cfu.g-1，芽孢率可达77.2％，本产品对仔猪有增重和预防腹泻的作用，使用添加浓度为0.05wt％。该菌剂菌体数远高于市场上同类菌剂菌体数(20×108cfu.g-1)，在畜禽养殖行业中具有广阔的市场竞争力。