专利名称：锰氧化微生物的分离、筛选方法金属作为一种重要的材料在现代工业和日常生活中占据了极为重要的地位，但是也正是因为金属的广泛使用造成了现在日趋严重的水体和土壤的重金属污染。重金属污染的治理已经刻不容缓。以锰为例，它不仅在现代工业领域扮演着极其重要的角色，而且也是一种维持机体正常代谢的重要微量元素。在工业上，锰矿石广泛应用于冶金、化工、玻璃、陶瓷等产业中。但锰元素作为一种重金属元素，过多得摄入会严重危害机体的健康，我国生活饮用水卫生标准规定锰含量不超过0. lmg/L,国家最低排放标准为ang/L。我国很多地区 (尤其是锰矿石开采和锰矿石加工周边地区)至今仍无法严格达到这一国家标准，亟待采取合理的方法来治理水土中的锰污染。本发明以锰金属污染为出发点，就转化可溶性有毒的Mn(II)为不溶性无毒的 Mn(III)和Mn(IV)过程中氧化微生物发挥的重要作用为契机，研究了氧化微生物的分离和鉴别的方法。
本发明的目的，是提供一种锰的氧化微生物的筛选和分离方法，该方法可以将土壤中的重金属锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低土壤中的重金属锰离子的含量，利于降低重金属锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。本发明的目的是这样实现的锰氧化微生物的分离、筛选的方法有以下步骤1)取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均勻涂布在固体PYCM培养基平板上；幻在25 恒温下培养1 2天，挑取单菌落划线纯化，在固体PYCM培养基中25 培养，得到锰氧化微生物待选菌株，在温度为4°C条件下保藏；3)步骤幻所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，光通量为630Lm，摇床转速为150-230r/min，温度为25_30°C，培养2_4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物。培养基中将锰离子浓度降低的为锰氧化微生物，其中将锰离子浓度降得最低的为锰氧化微生物优势菌株。步骤3)所述摇床转速较好的为200r/min.步骤3)所述温度较好的为30°C。所述固体PYCM培养基的成分和组成为蛋白胨0. 8g ；酵母膏0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；K2HPO4 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NaNO3 0. 2g ；CaCl2 0. Ig ；NH4HCO3 0. Ig ；力口水 lOOOmL，调pH值为6. 8 7. 2，固体培养基则加琼脂1. 8%。所述液体PYCM培养基的成分和组成为蛋白胨0. 8g ；酵母膏0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；K2HPO4 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NaNO3 0. 2g ；CaCl2 0. Ig ；NH4HCO3 0. Ig ；力口水 IOOOmL, il pH 值为 6. 8 7. 2。本发明方法有以下优点(1)分离自锰矿区软锰矿石表面的细菌群体中的细菌，可以将Mn(II)氧化为更高价态的 Mn(III)禾Π Mn (IV)。(2)锰矿区软锰矿石表面的细菌群体中的细菌在正常状态下其锰氧化能力较强。本发明所述方法可以将土壤中的重金属锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低土壤中的重金属锰离子的含量，使土壤中锰离子浓度降低65%，采用本发明方法可以降低能重金属锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不仅限于这些例子。 图1为I型和II型锰氧化微生物菌种，其中，a为I型锰氧化微生物菌种，b为II 型锰氧化微生物菌种；图2为锰标准曲线图。
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(7) DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 (8)数字生物显微镜(最大放大倍数1000倍)(9) DNP-9162型电热恒温培养箱(10) AL204型电子天平(Il)SHZ-D(III)循环水式真空泵(12) Sff-CJ-IF型洁净工作台二 .锰氧化微生物待选菌株的分离纯化和保藏1.刮取软锰矿石表面物质(取自重庆市秀山县孝溪乡细沙村锰矿地区的软锰矿石)，加入去离子水后搅拌即成原菌液。再在洁净工作台上用涂布法将菌液均勻涂布在平板培养基表面，取用3个平板，每个平板涂布不同的菌液量，以此代替梯度稀释。之后便可将其放置于恒温培养箱内保持培养1 2天。2.纯化。经过2-3天的培养，分离用培养皿中会长出多种形态的菌落，用接种针挑出其中的一种特定的菌株并将其划线培养在另一空白PYCM培养皿上，严格操作，选取明显无污染菌落，为防止失败每种菌要有重复，以要保证每一个培养皿中都只含有一种菌株。操作完成后将这些培养皿放置于恒温培养箱内保持培养。3.菌种保藏。 将纯化培养基中已经长出的菌株用接种针挑出，划线培养于PYCM斜面试管中(恒温培养箱，28°C )。待斜面试管中长出菌落后便将这批试管转入4°C冰箱中保藏。4 染色。(1)涂片取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体(无菌操作)与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约Icm的均勻薄层。(2)干燥涂布后，待其自然干燥。(3)固定将已干燥的涂片标本向上，在微火上通过3至4次进行固定。固定的作用为杀死细菌；使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。
(4)染色在涂片处滴加草酸铵结晶紫溶液1至2滴，使其布满涂菌部分，染色lmin。(5)冲洗斜置载片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清。(6)吸干用吸水纸轻轻吸去载片上的水分，干燥后镜检。(7)镜检将染色的标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍镜转开，滴加一小滴液体石蜡于涂片处，用油镜进行观察。
5革兰氏染色(1)制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不宜过厚)、干燥和固定。(2)初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1至aiiin后倾去染液，水洗至流出水无色。(3)媒染先用革氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖lmin，倾去碘液，水洗至流出水无色。(4)脱色将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色(一般20 至30s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。(5)复染将玻片上残留水用吸水纸吸去，用蕃红复染液染色aiiin，水洗，吸去残水晾干。(6)镜检油镜观察。通过上述方法分离出I型和II型两种不同的锰氧化微生物菌种(参见图1)，这两种菌种的特征如下表表1初筛菌落形态特征


本发明公开了一种锰氧化微生物的分离、筛选的方法，有以下步骤取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均匀涂布在固态PYCM培养基平板上；25～28℃恒温下培养1～2天，挑取单菌落划线纯化，固体PYCM培养基25～28℃培养，得到锰氧化微生物待选菌株，在温度为4℃条件下保藏；所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，光通量为630Lm，摇床转速为150-230r/min，温度为25-30℃，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物。该方法可以将土壤中的锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低锰离子的含量，利于降低锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。