专利名称：可阻碍幽门螺旋杆菌生长的朝鲜泡菜乳酸菌群及以此防止胃肠紊乱的高功能食品的制作方法 胃肠道疾病是世界上发生范围最广的疾病，其治疗药物形成了最大的单一市场(抗溃疡药物158亿美元(1999))。1983年，微生物学家Marchall和Warren首先在B-型胃炎患者的胃黏膜活组织检查中发现了鳞藓菌(ichthyosis bacteria)，培养该细菌发现它是一种弯曲菌属(campylobacter genus)相关的新菌种，从那以后，围绕幽门螺旋杆菌和上消化道疾病(如胃炎和胃溃疡)的相关研究越来越活跃。幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，周围带有由纤细的膜形成的鞭毛，能够分泌大量脲酶并且通过排泄物～口的途径传播，由于它在1994年被世界卫生组织(WHO)确认为致癌物质，因此吸引了全球范围的关注。已知幽门螺旋杆菌的致病机制是细菌通过食品进入到胃内腔，凭借高速游动的鞭毛穿透胃黏膜，并且分泌大量脲酶，使黏膜的pH值升高到碱性状态。幽门螺旋杆菌寄生在胃上皮细胞上层和胃黏膜细胞之间的区域，引起反常的胃泌激素分泌，进而导致胃酸大量产生，最终形成炎症和溃疡。因此，据最新提供的报道，幽门螺旋杆菌是引起胃腺癌的重要因素，WHO将幽门螺旋杆菌认定为I型致癌物质。据报导，幽门螺旋杆菌感染在发展中国家特别流行，包括韩国。据Paek等的报导，将近80％或更多的韩国人有感染幽门螺旋杆菌的嫌疑(Paek Seungchul等，Korean Microbial Society Paper，2545-52，1990)。因此，迫切需要开发一种能治疗和预防幽门螺旋杆菌感染的方法。使用抗生素进行化学治疗是现今最常用的治疗微生物感染疾病的方法，该方法虽然在短期有效，但令人忧虑的是可能产生微生物的抗药菌株。另外，Rauws等将铋制剂(bismuth preparations)、阿莫西林(amoxicillin)和甲硝哒唑(metronidazole)三种抗菌药同时给药，进行针对幽门螺旋杆菌的抗菌治疗，获得较好的效果(Rauws EAJ，Langenberg W，Houthoff JH，Zanen HC和Tytgat GHJ，Gastroenterol，9433-40，1988)。Borody等将铋制剂、四环素(tetracycline)和甲硝哒唑同时施加于胃溃疡患者，其报导的有效率为80％左右(Borody T，Lenne J和Moore-Jones D，Gastroenterol，98A24，1990)，因此施加这三种抗生素成为最常用的治疗幽门螺旋杆菌感染的方法。然而，其各种副作用也有报导，比如腹泻、反流性食管炎(reflux oesophagitis)、对正常肠内菌的抑制，以及由于持续的抗生素治疗产生了抗药菌株。最近，乳酸细菌发酵材料在预防和治疗胃肠疾病中的功能吸引了越来越多的关注，而且许多针对益生的乳酸杆菌的研究也正在进行，该细菌能够抑制人致病菌的生长。乳酸细菌是发酵产物，它们能产生与细菌素相关的抗生原料以及乳酸、醋酸和过氧化氢。Marie-HelenCoconier等培养了一种人嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株LB，在体外能够产生抗幽门螺旋杆菌的抗生素，并且在体外已证实其培养物上清液能抑制幽门螺旋杆菌附着到人的胃肠细胞，还能在小鼠体内防止脲酶活化和抑制猫幽门螺旋杆菌(H.felis)感染(Marie-HelenCoconier等，Environ.Microbiol，11月，4573-4580，1998)。另外，Yuji Aida M.T.等已经证实，在口服过唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的无菌鼠中，幽门螺旋杆菌感染被抑制，美国专利No.5,578,392中描述了约氏乳杆菌(L.johnsonii)抑制幽门螺旋杆菌附着到胃肠细胞的功能。
另外，根据Canducci等所用处方，使用灭活的人嗜酸乳杆菌的培养液，同时使用抗生素raveprazol、克拉霉素(clarithromycin)和阿莫西林进行治疗，结果增加了幽门螺旋杆菌的杀灭率(Canducci F.等，Aliment Pharmacol.Ther，141625-1629，2000)。
同样，韩国专利申请号为1999-0040387的专利公布了一种幽门螺旋杆菌抗体，以及包含乳球菌属(Lactococcus sp.)HY 49、酪乳杆菌(Lactobacillus Casei)HY 2782、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)HY 8001等的食品都显示了抑制幽门螺旋杆菌的功能。
因此，需要能够预防幽门螺旋杆菌附着到胃肠道并且抑制其生长的材料和方法，并且研制出包含这些材料的食品和药品。


本发明的目的是提供一种保护胃肠道的高功能朝鲜泡菜乳酸细菌，它能抑制幽门螺旋杆菌的生长并抑制其附着到胃肠道，朝鲜泡菜乳酸细菌是从朝鲜泡菜中分离获得的，是韩国人的乳酸细菌主要供应源，赋予传统食品有益的功能。
本发明的另一个目的在于提供一种保护胃肠道的高功能的食品，包含能有效预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的朝鲜泡菜乳酸细菌。
本发明的另一个目的在于提供一种保护胃肠道的高功能朝鲜泡菜，包含能有效预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的朝鲜泡菜乳酸细菌。
本发明的另一个目的在于提供一种能够预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡药物，包含朝鲜泡菜乳酸细菌。
为了达到这些目的，本发明提供了能抑制幽门螺旋杆菌生长并抑制其附着到胃肠道的朝鲜泡菜乳酸细菌。
本发明还提供了一种包含朝鲜泡菜乳酸细菌的保护胃肠道的高功能食品，能抑制幽门螺旋杆菌生长，并且能够有效预防和治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡。
本发明还提供了一种包含朝鲜泡菜乳酸细菌的保护胃肠道的高功能朝鲜泡菜，能抑制幽门螺旋杆菌的生长，并且能够有效预防和治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡。
本发明还提供了一种能够预防和治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的药物，包含能够抑制幽门螺旋杆菌生长的朝鲜泡菜乳酸细菌。

下面将对本发明进行详细解释。
由于朝鲜泡菜的成分是卷心菜和萝卜等，并且包含了许多乳酸细菌，因此泡菜具有很多有用的功能，包括抗突变和抗癌等。朝鲜泡菜发酵中涉及的微生物包括胚芽乳杆菌(L.plantarum)、短乳杆菌(L.brevis)、乳球菌属(Lactococcus)、嗜柠檬酸明串球菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)等，随着发酵阶段的不同，形成的总微生物区系中菌的种类和组分比例也不同。
在对抑制幽门螺旋杆菌生长的朝鲜泡菜乳酸细菌的研究中，本发明的发明人证实，在泡菜发酵过程涉及的微生物中，抑制幽门螺旋杆菌生长的朝鲜泡菜乳酸细菌同时还抑制其附着到胃肠道，从而完善了本发明。
本发明提供了抑制幽门螺旋杆菌生长并抑制其附着到胃肠道的朝鲜泡菜乳酸细菌。
朝鲜泡菜乳酸细菌优选的分离和鉴定条件为以常规方法发酵泡菜，在1～40℃贮藏90天或其pH值到达约3.0；更优选的条件为在1～25℃熟化90天，或30～40℃熟化30天。
乳酸细菌是这样分离得到的从常规方法制作的泡菜中提取样品，在MRS琼脂培养基上培养，选择到588个能抑制幽门螺旋杆菌生长的泡菜乳酸细菌，接着选择能够抑制幽门螺旋杆菌附着到胃肠道的泡菜乳酸细菌。
泡菜乳酸细菌优选在泡菜发酵过程产生的乳酸细菌中寻找，嗜柠檬酸明串球菌属和乳杆菌属种，更优选的，它们选自由嗜柠檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳杆菌EUG6017(KCCM-10273)、乳杆菌EUG4066(KCCM-10270)、乳杆菌EUG4048(KCCM-10271)和乳杆菌EUG6404(KCCM-10272)所组成的组中的一种或多种。
从朝鲜泡菜中分离获得的嗜柠檬酸明串球菌属种或乳杆菌属种能抑制寄生在胃黏膜组织中的幽门螺旋杆菌生长，并抑制其附着到胃肠道，对于杀灭幽门螺旋杆菌以及预防再感染非常有效。
同时，这里发挥功能的乳酸细菌并非来源于人的肠内或牛奶发酵产物，而是来自于朝鲜泡菜，它是韩国人的主要乳酸细菌供应源。只要将细菌加入到传统的朝鲜泡菜和其他食品中即可获得该功能，而功能性乳酸细菌供给来源也可多样化。所以，本发明也提供了一种保护胃肠道的高功能食品，包含从朝鲜泡菜中获得的嗜柠檬酸明串球菌属种或乳杆菌属种，它能有效预防和治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡。
包含泡菜乳酸细菌并能够抑制幽门螺旋杆菌生长和附着到胃肠道的功能性食品可以是发酵剂如培养液，或可是冻干乳酸细菌粉添加到各种食品中，如饮料、发酵牛奶、豆腐、发酵的大豆酱(soybean paste)、研磨发酵的大豆获得的豆酱汤(bean-paste soup)、果子冻等。并且，在乳酸细菌的功能不被抑制的前提下，这些食品的制备方式不受限制，而且根据营养需要和消费者的喜好等，还可以加入其他常用的食品添加成分。
本发明还提供了一种保护胃肠道的高功能泡菜，包含从泡菜中获得的嗜柠檬酸明串球菌属种或乳杆菌属种，能有效预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡。
含有能抑制幽门螺旋杆菌生长和附着到胃肠道的泡菜乳酸细菌的朝鲜泡菜，可以在制备时向泡菜作料中加入泡菜乳酸细菌培养液或冻干的乳酸细菌粉作为发酵剂，而且优选加入冻干的乳酸细菌粉以保持泡菜品质。
包含泡菜乳酸细菌的具有胃肠道保护高功能的朝鲜泡菜的制备条件如温度、pH值、工艺方法等在乳酸细菌功能不被抑制的条件下不受特别限制，而且根据营养需要和消费者的喜好等，还可以加入其他常用的食品添加成分。
本发明还提供了一种用于预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的药物，包含从泡菜中获得的嗜柠檬酸明串球菌属种或乳杆菌属种。该药物可以制备成凝胶、悬浮液、喷雾剂、片剂或液剂。
本发明将在下面提供的实施例中作进一步的详细描述，然而，以下的实施例仅用于说明本发明，不是对本发明的限制。
实施例实施例1分离能够抑制幽门螺旋杆菌生长的泡菜乳酸细菌为了在体外从泡菜乳酸细菌中选出能够抑制幽门螺旋杆菌生长的乳酸细菌，先将泡菜乳酸细菌分离出来，再从中挑选出能够抑制幽门螺旋杆菌的乳酸细菌。
(泡菜乳酸细菌的分离)使用常规的方法制备朝鲜泡菜，从分别贮藏在1℃、4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下的朝鲜泡菜中以每24小时或48小时的间隔取出样品，持续90天或到pH到达约3.0时(其中1～25℃条件下熟化90天，30～40℃条件下熟化30天)。将从泡菜中提取的样品在MRS琼脂培养基上，37℃培养72小时。
(抑制幽门螺旋杆菌生长的乳酸细菌的分离)将幽门螺旋杆菌悬浮液涂布在含10％马血清的布鲁氏琼脂上并干燥5分钟，然后用牙签转移法(tooth-picking method)，将培养在MRS琼脂培养基上的近48,000个乳酸细菌的菌落转移到涂布有幽门螺旋杆菌悬浮液的布鲁氏菌琼脂上，在10％CO2分压下37℃培养72小时，选出588个形成透明环的乳酸细菌菌落。
实施例2挑选能够抑制幽门螺旋杆菌附着到细胞系的乳酸细菌(初次挑选)针对实施例1选出的588种能够在体外抑制幽门螺旋杆菌生长的泡菜乳酸细菌，研究它们抑制幽门螺旋杆菌附着到Kato III胃癌细胞的活性，选出具有抑制能力的乳酸细菌。
幽门螺旋杆菌#26695分离自一个患有胃炎和胃溃疡的韩国人的胃中，是从Kyungsang大学药学院获得的；人Kato III胃癌细胞是从韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)获得的。
首先，通过测定呈色脲酶反应液(一种测定幽门螺旋杆菌数量的指示剂)在625nm的吸光度(A625)，得出幽门螺旋杆菌附着到细胞上的个数，选择能使附着的幽门螺旋杆菌数降低到106或更低的乳酸细菌，结果获得如表1所示70种乳酸细菌(如果A625的值是1.7或更低，则幽门螺旋杆菌计数为106或更低)。

表1
(第二次挑选)在初次实验里选出了70个菌株，进行重复试验并且同时选择具有高的抑制幽门螺旋杆菌附着活性的菌株。在这些乳酸细菌中，选择到35个能使幽门螺旋杆菌附着数降低到约105或更低的菌株，见表2。


表2(第三次挑选)从二次挑选中获得的35个乳酸细菌，再次进行重复试验，选出22个菌株，显示在表3中。

表3实施例3菌株的鉴定根据BIOLOG试剂盒和Bergey手册，对实施例1和2挑选到的22个乳酸细菌菌株进行鉴定的结果显示在表4中。

注链球杆菌(Streptobacillus)，球杆菌(Coccobacillus)，短棒杆菌(Short rod)，长棒杆菌(Long rod)表4如表4所示，一种嗜柠檬酸明串球菌类菌株被BIOLOG系统鉴定出，并且21种乳杆菌类菌株被Bergey手册提供的方法鉴定出，它们都具有抑制幽门螺旋杆菌附着到细胞的特性。
(四次挑选)将三次挑选获得的22个菌株进行第三次重复试验，选出9个具有高抑制活性的菌株。本阶段的挑选不是根据抑制活性高低的顺序来进行，而是根据细菌的形态来进行划分和选择，选择结果见表5。

表5(末次挑选)将前述挑出的9个乳酸菌株进行第四次重复试验，每种形态的细菌各选出1个，最后挑出5个菌株，显示在表6中。

表6如表6所示，最后选出的5个菌株中，嗜柠檬酸明串球菌属种的菌株被命名为嗜柠檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)，4种乳杆菌属种的菌株分别被命名为乳杆菌EUG6017(KCCM-10273)，乳杆菌EUG4066(KCCM-10270)，乳杆菌EUG4048(KCCM-10271)，以及乳酸菌EUG6404(KCCM-10272)。这5个菌株在2001年5月16日以上述名称保藏于韩国微生物保藏中心(Korean MicrobialPreservation Center)。
实施例4通过泡菜乳酸细菌培养肉汤测定对幽门螺旋杆菌的生长抑制从实施例3中选出的嗜柠檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳杆菌EUG6017(KCCM-10273)、乳杆菌EUG4066(KCCM-10270)、乳杆菌EUG4048(KCCM-10271)以及乳杆菌EUG6404(KCCM-10272)分别在37℃，MRS液体培养基中培养48小时，然后离心获得上清。
制备25ml的添加10％马血清布鲁氏菌琼脂培养基的琼脂平板，干燥，其上涂布0.5ml幽门螺旋杆菌悬浮液(1×108CFU/mL)，干燥5分钟。
培养基用灭菌的软木锥打孔，将每种菌株的100μl的离心上清液引入，并且在10％CO2分压下，37℃培养72小时，测定它们形成的透明环的尺寸。使用MRS液体培养基取代上清液作为对照。乳酸细菌在体外对幽门螺旋杆菌的生长抑制结果显示在表7中。

表7如表7所示，从实施例3中分离得到的5种朝鲜泡菜乳酸细菌上清液的培养结果显示，产生的透明环的半径在2.5mm到4.5mm之间，表明本发明的朝鲜泡菜乳酸细菌具有突出的抑制幽门螺旋杆菌生长的活性。
实施例5对幽门螺旋杆菌附着到胃癌细胞的抑制人Kato III胃癌细胞在37℃，10％CO2条件下，在含10％FBS的RPMI1640培养基上培养。幽门螺旋杆菌在37℃、10％CO2条件下，在含10％马血清的布鲁氏菌琼脂培养基上培养48小时，然后收集菌落并悬浮在盐水中。将0.5ml的1×106Kato III悬浮液和0.25ml乳酸细菌培养液在37℃下反应30分钟，反应的同时缓慢摇动。将MRS液体培养基取代培养液作为对照。
将0.25ml的幽门螺旋杆菌悬浮液(1×108CFU/mL)加入上述反应液，继续反应90分钟，然后用盐水洗涤三次，每次用1000rpm离心5分钟。接着通过脲酶实验来测定附着到Kato III上的幽门螺旋杆菌数量。
脲酶能够分解尿素而产生氨，产生的氨可使用苯酚/硝普盐和碱性次氯酸盐来定量。如果脲酶存在，反应液体从无色转变为亮蓝色，通过测定625nm的吸光度来测定脲酶的活性。幽门螺旋杆菌的数量则依据脲酶活性来计算，当幽门螺旋杆菌数量为104～107时，本实验的标准曲线显示为线性区域。
实施例3获得的5种泡菜乳酸细菌抑制幽门螺旋杆菌附着到人胃癌细胞的活性显示在表8中。

表8从表8可以证实，实施例3获得的5种泡菜乳酸细菌仅仅使少量的幽门螺旋杆菌附着到Kato III人胃癌细胞上，表明本发明的5种从泡菜中获得的乳酸细菌能够抑制幽门螺旋杆菌附着到胃肠道。
实施例6保护胃肠道的高功能泡菜的制备将实施例3获得的嗜柠檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳杆菌EUG6017(KCCM-10273)、乳杆菌EUG4066(KCCM-10270)、乳杆菌EUG4048(KCCM-10271)以及乳杆菌EUG6404(KCCM-10272)进行冻干并制成粉状，将一种或多种菌株混合，然后以每千克朝鲜泡菜含106-1011，较适宜为1010，的细菌与泡菜作料混合，然后通过常规的方法制备保护胃肠道的高功能朝鲜泡菜。
本发明的泡菜乳酸细菌能够抑制寄生在胃黏膜组织的幽门螺旋杆菌附着到胃肠道，并且抑制其生长，因此对于杀灭幽门螺旋杆菌和预防再感染非常有效。另外，包含泡菜乳酸细菌的能够保护胃肠道的朝鲜泡菜对于预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡非常有效。
另外，乳酸细菌并非来源于人的体内或牛奶发酵产物，带有所需功能的乳酸细菌而是来源于朝鲜泡菜，朝鲜泡菜是韩国人的主要乳酸细菌供给来源。因此，所述的功能可以添加到传统食品朝鲜泡菜中以及其他食品中，使功能性的乳酸细菌供给来源更加多样化。

关于微生物保藏的说明(细则13之二)



PCT/RO/134表(1992年7月)

关于微生物保藏的说明(细则13之二)



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本发明涉及抑制幽门螺旋杆菌生长的朝鲜泡菜乳酸细菌和包含这些细菌的食品，特别涉及一种包含能抑制幽门螺旋杆菌附着到胃肠道并抑制其生长的朝鲜泡菜乳酸细菌的保护胃肠道的高功能食品。本发明的朝鲜泡菜乳酸细菌能抑制寄生在胃黏膜组织的幽门螺旋杆菌附着到胃肠道，并抑制其生长，因此对于杀灭幽门螺旋杆菌以及预防再感染非常有效。另外，包含朝鲜泡菜乳酸细菌的保护胃肠道的高功能食品对于预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡非常有效。