专利名称：分离及培养大胚龄人神经干细胞原代细胞的方法神经干细胞具有广阔的临床应用前景，细胞替代治疗可以治疗帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神经退行性疾病以及脑卒中、脑外伤等引起的神经功能缺失，神经干细胞作为基因治疗的载体，可以治疗帕金森氏病、粘多糖病和颅内肿瘤等。但是， 神经干细胞的研究目前尚处于初期阶段，有许多问题还没有得到解决，如神经干细胞如何在体内和体外定向分化为我们需要的某种特定的神经细胞，体外分离得到的神经干细胞与体内的是否有差异等等，这些都需要进一步的研究。神经干细胞的发现和研究是近十年来神经生物学领域最重要的进展之一，近年来不断有实验发现人胚脑和其它哺乳类动物一样存在具有自我更新和广泛分化潜能的神经干细胞，如何快速有效地分离培养出人胚神经干细胞并长期传代扩增是进一步研究神经干细胞的前提条件。由于胚龄越大，神经干细胞越难分离培养，以往学者[1，2]常用小胚龄胚胎(7 9周)分离培养神经干细胞，而大胚龄胚胎神经干细胞的分离和培养的研究则较少。
本发明应用高、低密度培养法从13周龄人胚胎大脑皮层中分离和培养出神经干细胞，并用免疫荧光法予以鉴定。具体的，本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法步骤包括Sl 原代细胞的分离培养取13周水囊引产的新无菌条件下分离出大脑皮层组织，剥除脑分成小块后在PBS液中漂洗三次洗去血细胞，用细吸管轻柔吹打至组织碎块完全散开，离心洗涤后吹打制成悬液，经200目尼龙滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含 B27(l 50) (GibcoBRL)和 EGF(Serotec) 20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ml 的 DMEM/ F12(l D(GibcoBRL)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为IXlO7/ ml，将原代细胞短暂贴壁2次去除成纤维细胞，分别种植于未包被的25cm2培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37°C，5% C02条件下静置培养。培养方法分为悬浮细胞培养法和贴壁培养细胞法，悬浮细胞培养法7天后首次换液时重新计数活细胞，以1 X 105/ml密度分瓶继续培养。我们采用的贴壁细胞培养法与通常贴壁细胞培养法有所不同，每次换液时吸取上悬液离心后加新鲜培养基种入新的培养瓶，原瓶中仅保留贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。S2 神经干细胞的传代培养原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养。采用严格无菌操作，在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大克隆球(大于350 500 μ m)切成数块，小克隆球(小于100 μ m)不作处理继续培养。根据克隆球生长情况7 10天传代一次，方法同前。3S3.单细胞定点动态观察克隆形成在贴壁细胞培养法中挑选散在的出现明显增大具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录。当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用自制玻璃微管(内径约250 500 μ m) 逐个吸出克隆球进行分化试验。S4.诱导分化培养将以上获得的来自单细胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清终止后分别种植于直径315cm预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用有血清培养基DM EM/ F12+5% Fcs进行分化培养。S5.免疫荧光法检测将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿，用无血清培养基贴壁培养12小时后行免疫荧光检测。经分化培养后的细胞分别于2、7和14天行免疫荧光检测。每个培养皿用油性记号笔画五个圈，分别用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白对照行免疫荧光染色，二抗为FITC荧光二抗。神经干细胞传代时， 培养基中加入Brdu (5 μ mol/L)，连续传代两次后种入包被的小培养皿，贴壁培养12小时后行免疫荧光检测。本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代细胞悬浮培养法，可以快速形成克隆球，克隆球开始形成时间比维持低密度培养明显提前，并且生长迅速。而一旦进入有丝分裂期形成克隆球，则必须及时降低密度， 以避免高密度的抑制作用。通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法步骤流程图；图2所示为本发明的分离培养大胚龄人神经干细胞的原代细胞的步骤流程图。

在传代培养中，我们发现克隆球相当紧密，吸管机械吹打不能将克隆球分散，用胰酶消化虽能制成单细胞悬液，但有大量细胞死亡或出现分化，传代比较困难。用机械法将大克隆球分割成数块，小克隆球继续培养，可以长期传代培养。三、单细胞克隆结果极强折光性细胞经标记后定点动态观察，能清楚地观察从单个细胞逐渐分裂增殖形成克隆球，无其它细胞吸附聚集现象，克隆球用微管吸出分离后活力仍很旺盛。四、诱导分化结果在DMEM/F12+5%FcS有血清培养基中培养，12小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状，2周后有部分细胞出现逐渐衰退和死亡。五、免疫荧光检测结果贴壁的克隆球呈Nestin抗原阳性，同时NSE、GFAP和CNP免疫荧光染色均呈阴性。 分化细胞在不同时间点均检测到NSE、GFAP和CNP阳性细胞，Nestin免疫荧光染色在7天时可见部分阳性细胞，2周后几乎未找到Nestin阳性细胞。Brdu标记表明克隆的大部分细胞为Brdu阳性细胞。由于人们对神经干细胞的认识还不够全面和深入，目前神经干细胞尚无准确的定义，一般认为神经干细胞终身具有自我更新能力和多分化潜能，能通过对称和不对称分裂进行增殖，损伤或疾病能刺激干细胞分化。本发明在实验中分离纯化的干细胞能够不断分裂增殖，并通过定点动态观察，可以完整地记录从单个细胞分裂增殖形成克隆球的经过，应用Brdu标记可以进一步说明神经干细胞的分裂增殖能力；来自单个细胞的克隆球进行诱导分化后同时行神经元特异性抗原(NSE)、胶质细胞特异性抗原(GFAP)和少突胶质细胞特异性抗原(CNP)免疫荧光检测，均有阳性表达，其中GFA P阳性细胞最多，说明具有多分化潜能；目前人们将神经干细胞表达的一种中间丝蛋白-神经巢蛋白(Nestin)作为神经干细胞的特征性生物学标记，我们分离出的神经干细胞检测均呈Nestin阳性表达，并发现分化过程中，表达逐渐减少和消失。本发明中，我们应用先高密度(lX107ml)后降低密度(lX105/ml)的原代细胞悬浮培养法，1周后即可以形成克隆球，克隆球开始形成时间比维持1X IO5Ail密度培养O周时开始形成克隆球)明显提前，并且生长迅速。可能是体外培养的神经干细胞要进入有丝分裂期需要有其它细胞的相互作用，一旦进入有丝分裂期形成克隆球，则必须及时降低密度，以避免高密度的抑制作用。由于克隆球周围吸附其它细胞，所以必须经过几次传代后才能纯化。神经干细胞具有一定的贴壁能力，在形成克隆球并长大至200 μ m前，能够一直保持贴壁状态，这有利于贴壁细胞培养法在不改变细胞培养环境状态下动态观察从单个干细胞分裂增殖形成克隆球的全过程。原代细胞应用开始高密度(lX107ml)而后密度逐渐递减的贴壁培养法开始形成克隆球的时间较晚，可能与神经干细胞密度依赖性有关，一旦开始形成克隆球，生长速度明显加快，大约4周时即可以得到大量克隆球。首次培养时使用高密度，神经干细胞和其它细胞一样有较多数量贴壁，每次换液去除悬浮起的活力下降或死亡的细胞，细胞密度逐渐下降，大约3周时，贴壁细胞密度大约在IX (IO3 IO5)/ml左右， 神经干细胞仍能较好地分裂增殖并形成克隆球。贴壁培养法可以准确地观察从单细胞至克
6隆球的全过程，得到的克隆球周围无其它细胞的吸附，无需传代纯化，结合在培养瓶底面标记和微管吸取技术，可以得到来自单细胞的克隆球。 本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。


本发明提出一种分离及培养大胚龄人神经干细胞的原代细胞的方法，其应用于大胚龄人神经干细胞的培养过程，所述神经干细胞培养过程的步骤包括原代细胞的分离及培养；神经干细胞的传代培养；单细胞定点动态观察克隆形成；诱导分化培养；以及免疫荧光法检测。本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代细胞悬浮培养法，可以快速形成克隆球，克隆球开始形成时间比维持低密度培养明显提前，并且生长迅速。而一旦进入有丝分裂期形成克隆球，则必须及时降低密度，以避免高密度的抑制作用。