一种螺旋藻基因转化筛选的方法 [0002] 螺旋藻（Spirulina)在分类学上属于蓝藻门，颤藻纲，螺旋藻属，是一种多细胞、 微型、不分枝、无异形胞的螺旋状体，靠分裂增殖，光合自养生物。其作为一种新的基因转化 载体，具有高安全性、高营养性和高营养价值的特点，并且还有许多独到之处，如：对外源蛋 白质容受力高，繁殖迅速、再生快、培养条件简单等。螺旋藻作为一种具有重要开发应用价 值的原核生物具有巨大的潜力。 [0003] 近年来，理化诱变广泛用于筛选目标菌株，获得优良螺旋藻的传统手段一般都是 自然驯化和不断自然筛选而得，改造其基因结构，获得不同品系的更优良螺旋藻也有不少 研究。Li jianhong等用紫外诱变螺旋藻获得了富含藻蓝蛋白的突变体。Cohen等用除草剂 SAN-9785作为生长抑制剂，从钝顶螺旋藻和紫球藻中筛选获得突变株，其生长速度及糖脂 含量均高于出发株，且钝顶螺旋藻突变株富含亚麻酸。物理诱变因素（Y-射线、紫外 线等）和化学诱变因素（EMS、MNNG等）均能使螺旋藻丝体或细胞发生变异，产生耐低温、耐 盐、富含某种氨基酸或藻蓝蛋白以及藻丝加长、高产的突变体。 [0004] 现有的转基因技术大多只适用于单细胞的蓝藻，对于丝状的螺旋藻尚没有成熟的 遗传转化方法。螺旋藻之所以难以转化，除了研究者们公认的，由于螺旋藻基因组自身的完 美性和复杂性而对外源基因产生强烈的排斥作用外，尚未建立有效的筛选、纯化系统和方 法也是限制其转化效率的重要因素之一。Zeng等、茅云翔等分别报道利用超声波、电击等转 化方法转化了螺旋藻单细胞，获得了具有氯霉素抗性的转化藻株。Kawata等人采用建立基 于Tn5基础上的转座子载体和转座酶进行了钝顶螺旋藻转化体系的研究。徐虹等利用超声 波转化获得了具有G418抗性的转化藻株，并使外源基因成功的表达。张海生等通过自然转 化法将带有GFP报告基因的表达载体导入钝顶螺旋藻A9细胞中，实现了 GFP在螺旋藻细胞 中的瞬时表达。在上述试验中普遍采用的筛选标记系统是利用抗生素基因作为筛选标记， 但是选择何种抗生素以及抗生素的浓度却众说纷纭，更为重要的是单单采用抗生素标记筛 选出的转基因藻在长时间的培养过程中往往会出现杂交信号不稳定，甚至出现性状退化等 现象。出现这种现象，一方面是由于整合基因丢失，但更为主要的无疑是由于野生藻污染， 转化藻纯度不高所造成的。
[0005] 本发明的目的旨在提供利用nptll抗性标记基因和gfp基因，以及两步筛选法对 转化子进行筛选、纯化，提高螺旋藻转化子的筛选、纯化效率，为转基因螺旋藻的筛选和育 种提供途径方便，并为后续基因功能研究提供参考的一种螺旋藻基因转化筛选的方法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)构建犾得包含有两个插入序列、gfp基因、nptll标记基因和Ap标记基因的螺 旋藻整合筛选质粒pEGFP-IS-IS-Km ;
[0008] 2)供体质粒pEGFP-IS-IS-Km的超声转化和筛选：用EcoR I酶切 pEGFP-IS-IS-Km，获得线状质粒，两端各有一个IS序列，与转座子特征结构类似，用实验室 超声转化法转化螺旋藻869s，以苄青霉素（Ap)和G418(nptII)筛选出插入突变的螺旋藻 株，两步筛选法筛选突变株，抗性平板初筛，梯度稀释后利用荧光显微镜挑出单根绿色荧光 藻，然后超声波复筛，进行扩大培养，筛选出优良性状藻株。
[0009] 在步骤2)中，所述初筛的方法如下：通过超声转化法将构建好的螺旋藻整合筛选 质粒pEGFP-IS-IS-Km(事先用Not I线性化）转化螺旋藻，以含有200ii g/mL Amp和60ii g/ ml G418的Zarrouk固体培养基筛选转化藻株；10?15天后，转化组在含有G418和Amp的 抗性平板上长出绿色藻落，即为转化藻株；
[0010] 所述复筛的方法如下：从初筛的抗性平板上分别挑取若干单藻落，接到含有 100 ii g/mL Amp和30 i! g/mL G418的Zarrouk液体培养基中继续培养10?20天，吸取少许 藻液于载玻片上，在荧光正置显微镜下观察，用自制的微吸管分离吸取发绿色荧光的转化 藻株至5ml EP管中，继续培养15天后，用超声波将其处理成3?5个细胞的短藻丝体后， 再加入100 U g/mL Amp和30 ii g/mL G418,继续培养20?30天；再次进行上述步骤，如此 反复直至所有藻丝体在荧光显微镜下均发绿色荧光为止。
[0011] 本发明按照设计从蓝藻（包括螺旋藻）染色体DNA上PCR扩增出转座子IS序列， 构建了含两个插入序列、gfp基因、nptll标记基因的供体质粒pEGFP-IS-IS-Km，同时建立 了含转座子IS序列的螺旋藻介导整合和两步法筛选系统。本发明提高了螺旋藻转基因的 筛选效率，使筛选周期从以往的半年缩短到2个月，同时也大大提高了转化藻的纯度，其筛 选方法简单，成本低，具有很大的应用前景，为螺旋藻优良品种的遗传改造和选育打下了基 础。




[0012] 图1为螺旋藻转化子初筛效果图。
[0013] 图2为螺旋藻转化子复筛纯化效果图。


[0014] 下面由实施例对本发明作进一步的说明。
[0015] 步骤一螺旋藻转座子介导系统的构建
[0016] 1. 1蓝藻转座子序列（IS)的克隆
[0017] 根据NCBI上提供的蓝藻IS基因序列设计一组引物IS1-1、IS1-2、IS1-3,其中在 IS1-1、IS1-2、IS1_3 上分别设置了 Not I、ClaI 和 EcoR I 位点：