专利名称：猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗，然而，随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药菌株的传播进一步加剧。而裂解酶是由噬菌体基因组编码，能够水解细菌细胞壁的酶。噬菌体裂解酶像噬菌体一样仅攻击细菌，而不影响动物细胞，并具有较高的特异性，因此该酶不影响无害或有益的动物寄生菌。一般认为，裂解酶作用于细菌的速度极快，以至于细菌不会对该酶产生抗性。噬菌体的裂解酶有比噬菌体更为广泛的抗菌谱。所以，裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势。应用大肠杆菌表达系统虽可大量表达裂解酶，但表达产物需进一步提纯后方能应用于动物。本发明应用食品安全级的乳酸乳球菌表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得了有活性的裂解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用，为直接进行临床应用提供了可能。经过对现有技术的检索发现，王丽平等发表了 “32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，该文献记载了一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制或抗菌药物显得尤为重要。
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解酶基因，获得目的片断，再将目的片断与PNZ8148载体连接，得到重组表达质粒，导入乳酸乳球菌L9000表达，获得一个分子量为52kDa的融合蛋白，得到有活性的裂解酶，获得的裂解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种猪链球菌噬菌体SMP裂解酶，其DNA序列如kq ID No. 3所示。本发明涉及上述猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，包括如下步骤步骤一，从猪链球菌2型烈性噬菌体宿主菌SS2-H中纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体；所述的纯化是指以SS 2-H为指示菌，采用双层琼脂法培养噬菌体。所述的双层琼脂是指底层平板为1. 5wt%琼脂，顶层为0. 7wt%琼脂糖。所述的双层琼脂法是指将噬菌体SMP用链球菌THB培养基(Todd-Hewitt broth, THB培养基)作10_2、10_4、10_6等梯度稀释，取200 μ L上述噬菌体稀释液与200 μ L宿主菌 SS2-H混勻，再加入lmol/L CaCl2至终浓度0. lmol/L,将上述混合物放置于37°C孵育15min 后与50°C已熔化的顶层琼脂混勻，浇注在底层平板上，室温放置至上层琼脂凝固后，倒置于37°C培养箱培养10-1池，取长成密集相连噬斑的平板，每板加入5mL SM液(配方=NaCl 5. 8g, MgS04 · 7H20 2g, IM Tris · CL(pH7. 5) 50ml，2% 明胶 5ml，加去离子水至 1000ml)，在 4°C摇床晃动3小时，收集含噬菌体的SM液，置于无菌离心管中，4000g离心10分钟去除细胞碎片，得到纯化的噬菌体。步骤二，以步骤一所得噬菌体为材料提取其基因组DNA，并以此DNA为模板，应用 PCR扩增得到裂解酶基因，如kq ID No. 3所示；所述的提取是指在噬菌体重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50 μ g/mL, 37°C温育30分钟，再加10% SDS (十二烷基磺酸钠)至终浓度为0. 5%，混勻后将消化混合物于56°C温育1小时，冷却至室温。用等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开， 将亲水相收集至另一个离心管中。在回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0. 3mol/ L，混勻后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀。用适当体积的TE (核酸溶解缓冲液)溶解噬菌体DNA。所述的PCR扩增，具体包括以下步骤2. 1)根据Genbank的SMP DNA序列(EF116^6)，设计两条引物Pl及P2，分别在5， 端和3’端插入限制性内切酶^CbalI和HindIII的酶切位点，其中引物Pl如kq ID No. 1 所示，及？2如^^ ID No. 2所示。2. 2)用引物 Pl、P2 按以下进行 PCR 扩增PCR 体系为 2 XPCR mix 25 μ LUO μ M/L 的Pll μ LUO μ M/L的P21 μ L、噬菌体的SM溶液5 μ LjK 18 μ L ；PCR参数为35循环(95°C 预变性 5min 后；95°C变性 lmin，58°C退火 30s，72°C延伸 Imin 45s ；72°C延伸 IOmin)。2. 3)反应结束后，取5μ L产物用于的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用PCR产物回收试剂盒回收。步骤三，应用乳酸乳球菌表达步骤二扩增所得裂解酶基因，得到融合蛋白；所述的表达，具体包括以下步骤3. 1)目的基因片段与pMDIS-T载体的连接使用TAKARA公司的pMD18_T反应试剂盒连接目的基因片段与pMD18_T载体(自带有载体PMD18-T、Solution I)，连接反应体系如下(单位μ L)一种生物技术领域的猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得目的片断，再将目的片断与pNZ8148载体连接，得到重组表达质粒，导入乳酸乳球菌L9000表达，获得一个分子量为52kDa的融合蛋白，得到有活性的裂解酶，获得的裂解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。