专利名称：含有抑制trail敏化剂靶基因tip41表达或活性抑制剂的用于增强trail敏感性的组合物的制作方法参照所附的附图可最佳地理解本发明优选实施方案的应用，其中图I显示TIP41在肝癌组织中表达增强，并证明了将TIP41siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中然后用TRAIL处理，对TIP41的抑制图IA显示TIP41在肝癌组织中表达增强；图IB显示通过蛋白质印迹法(Western Blot)分析，不考虑HBV感染，与周围正常细胞中的TIP41相比，TIP41在肝癌组织中表达增强的水平； 图IC显示通过将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中然后用TRAIL处理，对 TIP41表达的抑制；si-cont :对照组 siRNA ;和si-TIP41 :TIP41siRNA。图2所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后用TRAIL处理，所诱导的癌细胞的细胞凋亡图2A所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，通过核染色质染色法显示的癌细胞的细胞凋亡；si-cont :对照组 siRNA ；si-1017 TIP41 siRNA;图2B所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，采用膜联蛋白V-FITc/PI染色法进行FACS (荧光活化细胞分选器)分析；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图2C所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与浓度相关的方式用TRAIL处理，采用膜联蛋白V-FITc/PI染色法进行FACS (荧光活化细胞分选器)分析；si-cont :对照组 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。图3所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，促凋亡蛋白对癌细胞的细胞凋亡的激活作用图3A所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，半胱天冬酶(caSpaSe)-3、-8、-9和PARP (聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)的激活作用si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA;图3B所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，细胞色素C释放至细胞液中si-cont :对照组 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。图4显示JNK (Jun氨基末端激酶)途径与接受TIP41 siRNA和TRAIL处理的Huh7肝癌细胞的细胞凋亡相关联图4A显示将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，JNK途径的激活作用si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图4B显示JNK抑制剂处理减少了接受TIP41消耗和TRAIL处理的Huh7肝癌细胞的细胞凋亡；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ； 对照溶剂(Vehicle):0. 3% 的二甲亚砜(DMSO);和SP600125:JNK 抑制剂。图5所示表明TIP41siRNA和TRAIL处理所诱导的Huh7肝癌细胞的细胞凋亡与P53信号转导途径无关图5A显示接受TIP41 siRNA和TRAIL处理的Huh7肝癌细胞细胞凋亡的诱导与P53信号转导途径无关；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和图5B所示表明TIP41消耗和TRAIL处理所诱导的细胞凋亡与p53的存在无关。图6显示TIP41消耗和TRAIL受体之间并无关联图6A显示TRAIL受体在各种细胞系中的表达水平；图6B显示接受TIP41消耗和TRAIL的Huh7肝癌细胞系中TRAIL受体的表达水平；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和图6C显示TRAIL受体的表达水平取决于肝癌组织的时期。图7显示TIP41消耗和TRAIL处理无法诱导正常HAEC (人主动脉内皮细胞)细胞中的大量细胞死亡图7A显示在接受与时间相关方式的TIP41消耗和TRAIL处理的HAEC细胞中，未观察到显著的细胞凋亡的诱导；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图7B显示在接受与时间相关方式的TIP41消耗和TRAIL处理的HAEC中，细胞凋亡与促凋亡蛋白裂解没有关联；si-cont :对照组 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。图8显示在接受TIP41消耗和TRAIL处理的肺癌、结直肠癌和肝癌细胞系中细胞凋亡增加图8A显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至A549肺癌细胞，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，所诱导的细胞凋亡增加；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图8B显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至A549肺癌细胞，然后以与浓度或时间相关的方式用TRAIL处理，所诱导的细胞凋亡增加；si-cont :对照组 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。图8C显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至H印G2、SK-Hepl肝癌细胞，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，所诱导的细胞凋亡增加； si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图9所示为通过动物实验确认TIP41的抗细胞凋亡作用图9A显示裸鼠移植了癌细胞，然后注射TIP41 siRNA和TRAIL，其肿瘤减小了 ；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；图9B所示为通过对裸鼠肿瘤染色显示的细胞的细胞凋亡；si-cont :对照组 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和图9C所示为对溶解的裸鼠肿瘤细胞采用蛋白质印迹法显示半胱天冬酶-8蛋白的活性与细胞凋亡有关。图10显示TIP41和PP2Ac之间的相互作用；图10A显示在PP2Ac过表达后，用蛋白质印迹法对TIP41和PP2Ac之间相互作用进行分析的结果；以及图10B所示确认了 TIP41和PP2Ac复合体(complex)之间，以及TIP41和MKK7之间的相互作用。图11所示确认了 TIP41和PP2Ac复合体之间，以及TIP41和MKK7之间的相互作用图IlA所示确认了 MKK7过表达后，TIP41和PP2Ac复合体之间，以及TIP41和MKK7之间的相互作用；图IlB所示为采用免疫沉淀反应法(immunoprecipitationprocedure)确认了TIP41和PP2Ac复合体之间，以及TIP41和MKK7之间的相互作用；以及图IlC所示确认了采用体外GST免疫沉淀反应法确认了 TIP41、PP2Ac复合体和MKK7之间的相互作用。图12所示确认了 TIP41与MKK7相互作用的结合位点图12A显示制备的用于确认TIP41与MKK7相互作用结合位点的TIP41片段；以及图12B采用蛋白质印迹法显示的TIP41与MKK7相互作用的结合位点。图13所示确认了 MKK7与TIP41相互作用的结合位点图13A显示制备的用于确认MKK7与TIP41相互作用结合位点的MKK7片段；以及图13B为采用蛋白质印迹法显示的MKK7与TIP41相互作用的结合位点。图14所示为通过MKK7与TIP41相互作用确认的细胞凋亡途径图14A所示确认对MKK7表达的抑制减少了细胞凋亡；图14B所示表明一旦TIP41表达被抑制则MKK7/JNK途径被激活；si-cont :对照组 siRNA ;和si_MKK7 :MKK7 siRNA。为简化下列步骤如洗涤或分离复合体，所述抗体可结合至固体基质。固体基质的实例包括合成树脂、硝化纤维、玻璃基质、金属基质、玻璃纤维、微球和微珠。另外，合成树脂包括聚酷、聚氣乙纟布、聚本乙纟布、聚丙纟布、PVDF和尼龙。适述适体是一种单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)，其本身具有稳定的三维结构，可以高亲和力和特异性结合靶分子。由于第一种适体发现技术的发展，即SELEX(指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))(Ellington, AD 和 Szostak, JW.，自然(Nature) 346:818-822，1990)，发现了许多可结合各种靶分子如低分子量有机物质、肽和膜蛋白的适体。由于适体具有独特的高亲和力(通常为PM水平)和对靶分子的特异性，这一点与单克隆抗体相当，尤其是其用作替代性抗体的可能性很高，因而适体通常被称为“化学抗体”。在本发明的一个实验例中，通过免疫组织化学和蛋白质印迹法确定了肝癌组织中 TIP41蛋白的过表达。同样，在以TIP41siRNA感染的肝癌细胞系中确定了 TIP41蛋白消耗(参见图I)。在本发明的一个实验例中，当用TIP41 siRNA处理Huh7肝癌细胞后，以TRAIL处理各种不同的时间，确定的结果表明通过核染色质染色和FACS分析法证实了细胞凋亡。另夕卜，将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系后，通过TRAIL以浓度-依赖的方式诱导细胞凋亡，FACS分析结果证实与仅用TRAIL处理相比，在用TIP41siRNA和TRAIL共处理的情况下，细胞凋亡进一步增加(参见图2)。在本发明的一个实验例中，用TIP41 siRNA转染后，以时间-依赖的方式用TRAIL处理Huh7肝癌细胞系，观察到蛋白激活与细胞凋亡有关，尤其确定了半胱天冬酶-3、-8、-9和聚ADP核糖聚合酶(PARP)。另外也确定了细胞色素C在细胞液中的表达，其表明的事实为通过外在途径和内在途径的结合，在Huh7肝癌细胞系中发生了由TRAIL和TIP41蛋白消耗导致的细胞凋亡(参见图3)。在本发明的一个实验例中，将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中后，用TRAIL以时间-依赖的方式处理，然后确定了 C-JunN-末端激酶(JNK)转导途径的激活(activation)，由于在JNK抑制剂处理的情况下确定了通过TRAIL和TIP41蛋白消耗的细胞凋亡减少，通过这些发现证明JNK转导途径在TRAIL介导的通过TIP41消耗的细胞凋亡中起着重要的作用(参见图4)。在本发明的一个实验例中，为证明通过TIP41蛋白消耗，TRAIL-诱导的细胞凋亡不会在正常细胞系中诱导细胞凋亡，而是特异性地在癌细胞系中发生的事实，研究了在TIP41 siRNA和TRAIL-诱导的细胞凋亡途径中p53蛋白的作用，并观察到在丝氨酸(ser) 15和392位的磷酸化。然而，在p53-缺陷的HCT116同基因的HCC细胞系中TIP41消耗后，用TRAIL处理以诱导细胞凋亡，凋亡的细胞死亡得以证实。这表明用TRAIL处理的TIP41消耗所诱导的细胞凋亡与P53的存在无关(参见图5)。在本发明的一个实验例中，确定在肝癌和肺癌细胞系中TRAIL受体的转录水平的结果为，与正常细胞系相比TRAIL-R2(DR5)过表达。另外，TIP41消耗后，同样地确定了肝癌细胞系中TRAIL受体表达。这表明通过TIP41消耗的细胞凋亡增加并非由于TRAIL受体表达的变化(参见图6)。
在本发明的一个实验例中，在正常细胞系中用TIP41 siRNA和TRAIL处理后检验细胞凋亡，与TIP41 siRNA转染和TRAIL处理有关的细胞凋亡没有变化，证明影响细胞凋亡的蛋白激活没有变化。因此，siRNA TIP41转染后确定TRAIL介导的细胞凋亡特异性发生于癌细胞(参见图7)。在本发明的一个实验例中，用siRNA和TRAIL处理TRAIL-抗性肺癌和结直肠癌细胞系，通过TIP41敲除确定细胞凋亡的诱导(参见图8)。在本发明的一个实验例中为了通过动物实验证明TIP41的功能，将肝癌细胞系移植至裸鼠后，注射TIP41 siRNA和TRAIL，确定了肿瘤大小的减小和细胞凋亡的诱导，与仅注射TRAIL相比，当TIP41 siRNA和TRAIL —起注射时，与细胞凋亡有关的蛋白激活甚至增强(参见图9)。另外，为了确定TIP41作为TRAIL敏化剂诱导的细胞凋亡途径，确定了 MKK7与作为TIP41结合蛋白的PP2Ac成分，以及与PP2Ac复合体之间的相互作用(参见图10和1 1)。更具体地，为了确定结合TIP41的MKK7的结合位点，构建包括各种MKK7区的片段，并确定结合位点(参见图12和13)。而且，为了确定由TIP41消耗和TRAIL处理诱导的细胞凋亡途径是否由于TIP41和MKK7之间的相互作用而减少，在Huh7肝癌细胞系中实施MKK7敲除以及TIP41和TRAIL处理后，进行细胞凋亡分析。在这种情况下观察到细胞凋亡的减少。MKK7敲除明显减少了由TIP41消耗和TRAIL处理诱导的细胞凋亡。此外，我们还检验了是否JNK激活与TIP41消耗和TRAIL-诱导的细胞凋亡有关(参见图14)。因此，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理TRAIL-抗性肝癌细胞系后，在TRAIL抗性癌细胞如肝癌、肺癌和结直肠癌中诱导了细胞凋亡。另外，将TIP41 siRNA和TRAIL注射到人癌细胞系产生的异种移植小鼠后，观察到癌症组织中肿瘤大小的减小和细胞凋亡的诱导。因此，TIP41蛋白表达或TIP41活性抑制剂可有效地用作增强TRAIL敏感性的组合物中的活性成分。除了 TIP41蛋白表达或活性抑制剂以外，所述组合物可含有一种或多种具有相同或相似功能的活性成分。所述组合物可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时，其可进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、子宫内注射(intrauterine dura Iinjection)、脑血管内注射或胸廓内注射，并可作为常规药物形式使用。所述组合物可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。所述组合物的日剂量为约O. OOOlg 100mg/kg,优选O. OOlg 10mg/kg,且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄速率和疾病严重度。在实际的临床施用中，本发明所述组合物可作为各种非口服制剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、增量剂(extender)、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。对于非肠道制剂，其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用wit印sol (饱和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯(Iaurin)和甘油胶冻。本发明还提供含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的抗癌助剂。优选所述TIP41蛋白具有如SEQ. ID. NO: I所示的氨基酸序列，尽管其不限于此。优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，尽管其不限于此。优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为例如选自下组之一(但不限于此)互补结合TIP41基因mRNA的反义核苷酸、抗TIP41的小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA，尽管其不限于此。优选所述TIP41活性抑制剂选自下组之一特异性结合TIP41的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌，以及任何具有TRAIL抗性的癌症，但不限于 此。进一步地，在所述抗癌助剂中，优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂增强TRAIL敏感性，但不限于此。在本发明的一个实验例中，TIP41蛋白在肝癌组织中过表达(参见图1)，与仅用TRAIL处理相比，当将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系且用TRAIL以不同的时间段处理后，细胞凋亡增加更多(参见图2)。另外，为了发现通过TIP41 siRNA和TRAIL诱导的细胞凋亡途径，检测了半胱天冬酶_3、-8、-9和聚ADP核糖聚合酶以及JNK转导途径相关蛋白和P53蛋白的活性，与仅用TRAIL处理相比，当用TIP41 siRNA和TRAIL 二者处理时细胞凋亡增加更多，其表现的细胞凋亡被确定为癌细胞系特异性细胞凋亡(参见图3、4、5和7)。另外当TIP41蛋白受到抑制，确定了 TRAIL受体未发生变化(参见图6)。此外，用TIP41s iRNA和TRAIL处理肝癌以外的也具有TRAIL抗性的细胞系，确定了凋亡的细胞死亡(参见图8)。而且，与分别注射TRAIL和TIP41 siRNA相比，共同注射TIP41 siRNA和TRAIL时异种移植裸鼠的肿瘤大小减小了。另外，也观察到共同注射TIP41siRNA和TRAIL时，细胞凋亡相关蛋白的激活和肿瘤组织中的细胞凋亡最有效。因此，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理具有TRAIL-抗性的肝癌细胞系时，在TRAIL抗性癌细胞如肝癌、肺癌和结直肠癌中诱导了癌细胞系特异性细胞凋亡，且当将TIP41siRNA和TRAIL注射到异种移植小鼠模型中，其可有效诱导癌细胞的细胞凋亡并减小肿瘤的大小，因此其可有效用作含有TIP41表达或活性抑制剂的抗癌助剂。除了 TIP41表达或活性抑制剂以外，所述抗癌助剂可含有一种或多种具有相同或相似功能的活性成分。所述抗癌助剂可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时，其可进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、子宫内注射、脑血管内注射或胸廓内注射，并可作为常规药物形式使用。所述抗癌助剂可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。所述抗癌助剂的日剂量为约O. OOOlg 100mg/kg,优选O. OOlg 10mg/kg,且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄速率和疾病严重度。
在实际的临床施用中，本发明所述抗癌助剂可作为各种非口服制剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性齐U。对于非肠道制剂，其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用wit印sol (饱和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯和甘油胶冻。本发明还提供一种预防和治疗癌症的组合物，其包含本发明的抗癌助剂。在一个实施方案中，当本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂与TRAIL联用时，在各种具有TRAIL抗性的癌细胞系如肝癌、肺癌和结直肠癌细胞系中，癌症特异性细胞凋亡比率增加。进一步地，在植入癌细胞系的裸鼠模型中检测了本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂的癌症特异性细胞凋亡体内效果。因此，所述含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的抗癌助剂可用作所述预防和治疗癌症的组合物的活性成分。 除了 TIP41表达或活性抑制剂以外，所述组合物可含有一种或多种具有相同或相似功能的活性成分。所述组合物可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时，可将所述组合物进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、子宫内注射、脑血管内注射或胸廓内注射，并可作为常规药物形式使用。所述组合物可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。所述组合物的日剂量为约O. OOOlg 100mg/kg,优选O. OOlg 10mg/kg,且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄速率和疾病严重度。在实际的临床施用中，本发明所述组合物可作为各种非口服制剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性齐U。对于非肠道制剂，其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用Wit印sol (饱和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯和甘油胶冻。本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括I)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；2)测量步骤I)中TIP41与PP2Ac或TIP41与MKK7蛋白之间的结合水平；以及3)与未经步骤I)中样品物质处理的对照相比，筛选出降低步骤2)中TIP41和PP2Ac或TIP41和MKK7蛋白之间结合水平的物质，尽管其不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤2)中所述蛋白的结合水平以选自下组之一的方法测量免疫沉淀反应、ELISA、蛋白质印迹法、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)钓饵(Pull-down)分析、蛋白质芯片、荧光共振能量转移(FRET)、双分子荧光互补(BiFC)和酵母双杂交(Y2H)，但其并不限于此。本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括I)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；2)测量步骤I)中MKK7的活性；以及3)与未经步骤I)中样品物质处理的对照相比，筛选出增加步骤2)中MKK7活性的 物质，但不限于此。在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤2)中所述MKK7蛋白的表达水平以选自下组之一的方法测量RT_PCR、ELISA、免疫组织化学染色、蛋白质印迹法和FACS，但其并不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括I)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；2)测量步骤I)中PP2Ac的表达水平；以及3)与未经步骤I)中样品物质处理的对照相比，筛选出降低步骤2)中PP2Ac蛋白表达水平的物质，尽管其不限于此。在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤2)中所述PP2Ac蛋白的表达水平以选自下组之一的方法测量免疫荧光、ELISA、质谱分析和蛋白质芯片，但其并不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。本发明还提供一种增强癌症对TRAIL敏感性的方法，其包括将药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用于患有TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病对象的步骤。优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，但其并不限于此。优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂选自下组之一互补结合TIP41基因mRNA的反义核苷酸、短干扰RNA(SiRNA)和短发夹RNA，但其并不限于此。优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂选自下组之一特异性结合TIP41的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但其并不限于此。所述TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病为癌症、炎症性疾病或自身免疫性疾病，但其并不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌，但不限于此。进一步地，优选所述炎症性疾病选自下组之一皮肤炎、过敏症、特异反应性、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、僵直性脊椎炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、退行性关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症以及急性和慢性炎症，但不限于此。进一步地，优选所述自身免疫性疾病选自下组之一风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、葛瑞夫兹病、桥本甲状腺炎、阿狄森病、白癜风、全身性硬化症、肺出血肾炎综合征、白塞病、克罗恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板减少性紫癜、寻常性天疱疮、糖尿病、自身免疫性贫血、冷球蛋白血症、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和全身性红斑狼疮(SLE)，但不限于此。在一个实施方案中，当本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂与TRAIL联用时，在各种具有TRAIL抗性的癌细胞系如肝癌、肺癌和结直肠癌细胞系中，癌症特异性细胞凋亡比率增加。进一步地，在植入肿瘤的裸鼠模型中检测了本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂的癌症特异性细胞凋亡体内效果。因此，本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂可有效地用于增强TRAIL敏感性。 本发明还提供一种预防癌症的方法，其包括将药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用到对象的步骤。本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括将药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用到患有癌症的对象的步骤。优选所述对象为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为包括小鼠、兔、豚鼠、仓鼠、狗、猫的实验动物，最优选为包括黑猩猩或大猩猩的类人猿动物。所述药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂可根据各种因素如给药方法、靶向部位或患者状况而变化。因此，所述施用量在用于人体时应该考虑到稳定性和效率而恰当地确定。所述药学上有效量的给药量也可在动物实验中估测然后调整用于人类。关于确定药学上有效量的给药量要考虑的因素的信息，可参见Hardman和Limbird编著，古德曼和吉尔曼的治疗学药物基础(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics),第 10 版(2001)，拍盖蒙出版社(Pergamon Press);以及 E. W. Martin 编著,雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第 18 版(1990),麦克出版公司(Mack Publishing Co.)。根据一个实施方案，TIP41蛋白表达或活性抑制剂可包括通常用于生物药物制剂中的载体、赋形剂、稀释剂，或上述两者或更多的组合。所述药用载体没有严格的限制，条件是所述载体适合将TIP41蛋白表达或活性抑制剂蛋白递送到体内。作为实例，所述载体可包括在默克索引(Merck Index),第13版,默克公司(Merck & Co. Inc)公开的化合物的混合物、盐溶液、无菌水、林格氏(Ringer’s)溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或上述一种或以上的混合物。根据需要，所述载体可以和其他常用添加剂包括抗氧化剂、缓冲液或抑真菌剂一起加入。进一步地，可另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备包括水溶液、悬浮液或乳液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂的剂型。此夕卜，可使用已知方法或雷明顿药物科学(麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第18版，1990)公开的方法根据疾病或成分而制备合适的剂型。本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂可另外包括一种或多种具有相同或相似功能的有效成分。相对于药物组合物的总重量，本发明药物组合物包括O. OOOf 10wt%的所述蛋白，优选包括O. 001 lwt%的所述蛋白。根据不同目的，本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂可为非经口给药(如静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射或局部应用)或经口给药。进一步地，所述给药量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间和方法、排泄速率和疾病严重度而变化。本发明药物组合物每日给药量的范围为O. 001 μ g 10mg/kg，优选为O. 01 μ g 10mg/kg，且优选将每日一次给药分为每日多次给药。本发明还提供在治疗TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病期间，用于增强TRAIL敏感性的TIP41蛋白表达或活性抑制剂。此外本发明提供用作抗癌助剂的TIP41蛋白表达或活性抑制剂。优选所述TIP41蛋白具有如SEQ. ID. NO: I所示的氨基酸序列，但不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，但不限于此。优选所述TIP41表达抑制剂选自下组之一互补结合TIP41基因mRNA的反义核苷酸、抗TIP41的小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA，但不限于此。优选所述TIP41活性抑制剂选自下组之一特异性结合TIP41的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但不限于此。所述TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病为癌症、炎症性疾病或自身免疫性疾病，但不限于此。优选所述癌症选自下组之一肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌、胰腺癌和具有TRAIL抗性的任何癌症，但不限于此。进一步地，优选所述炎症性疾病选自下组之一皮肤炎、过敏症、特异反应性、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、僵直性脊椎炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、退行性关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症以及急性和慢性炎症，但不限于此。进一步地，优选所述自身免疫性疾病选自下组之一风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、葛瑞夫兹病、桥本甲状腺炎、阿狄森病、白癜风、全身性硬化症、肺出血肾炎综合征、白塞病、克罗恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板减少性紫癜、寻常性天疱疮、糖尿病、自身免疫性贫血、冷球蛋白血症、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和全身性红斑狼疮(SLE)，但不限于此。以下将结合实验例和制备例详细描述本发明。然而，下列实验例和制备例仅用于说明本发明的目的，本发明并不限于下列实验例和制备例。<实验例1>确认肝癌和肺癌组织中TIP41蛋白的表达〈1-1>用免疫染色确认TIP41表达将肝癌患者的组织(忠南大学医学院，Kim, Jin-Man教授)用约10%中性福尔马林溶液固定，加入石蜡并切成约5μπι厚的切片。将所述切片用约IOmM的抗坏血酸缓冲液(ΡΗ6. O)处理约4分钟，置于含有约3%过氧化氢(H2O2)的约O. IM Tris-缓冲盐溶液(TBS, ρΗ7. 4)中约30分钟。将所述切片用蛋白封闭液(DAKO)于室温下处理约20分钟，并与抗-ΤΙΡ41抗体反应30分钟。用O. IM TBST (含有O. 01%吐温20的O. IM TBS)洗涤后，使所述切片与nVision抗兔聚合物(DAKO)反应30分钟。通过与3，3-二氨基联苯胺(DAB)色原体基质溶液(DAKO)反应可以观察到该过氧化物酶-结合抗体。在显微镜下观察，适当染色后用O. IM TBS洗涤以结束反应，用奥林巴斯(Olympus)BX51显微镜(奥林巴斯，日本)观察，用奥林巴斯DP 70照相机(奥林巴斯，日本)成像。结果，与正常区域相比，观察到肝癌组织肿瘤区域的TIP41过表达(图1A)。另外与肝癌和肺癌患者的周围正常组织(忠南大学Kim，Jin-Man教授的研究组提供)相比，这些患者癌症组织中的TIP41蛋白过表达(表I和2)。TIP41表达和癌症阶段之间的相关分析表明，TIP41阳性表达与NSCLC的较高阶段显著相关，肺癌(P=O. 045)，表明了 TIP41表达与NSCLC级数的相关性(表2)。这些数据显示在HCC和NSCLC细胞中TIP41表达是高度过表达。表I肝癌(HCC)临床组织中的TIP41表达水平(IHC法)


本发明涉及一种增强TRAIL敏感性的组合物，其含有用于抑制TIP41蛋白表达或活性的抑制剂。更具体地，已发现当用TIP41siRNA和TRAIL处理具有TRAIL抗性的肝癌细胞系后，诱导了癌细胞特异性的细胞凋亡，且不仅在肝癌中而且在具有TRAIL抗性的肺癌和结肠癌中均诱导了细胞凋亡，并且通过动物实验发现肿瘤的大小减小且癌细胞的细胞凋亡被诱导，由此诱导的细胞凋亡是由于抑制TIP41表达而激活MKK7/JNK传递途径导致的。因此，本发明含有用于抑制TIP41蛋白表达或活性的抑制剂的组合物可有效地用于预防和治疗癌症或作为抗癌助剂。