乳房内乳头封闭剂制剂和用其减少或消除陈化奶酪中的视觉缺陷的方法

S·A·兰金

2012年11月28日

2010年4月7日

2009年4月8日

威斯康星旧生研究基金会

A61K47/06GK102802642SQ201080026136

封闭剂 乳头 制剂 乳房 减少

1.一种在非人类动物的乳头管内形成物理屏障的方法，其用于在动物的干奶期间预防性治疗乳房疾病并同时防止用该动物的奶制成的乳制品中的黑斑缺陷，所述方法包含 将一定量的乳头封闭制剂注入动物的乳头管中，其中所述乳头封闭制剂中包含无毒的金属盐，该盐分散于包含甘油酯的凝胶相中， 其中所注入的乳头封闭制剂的量足以形成阻止微生物进入乳头管的物理屏障，并且其中所述乳头封闭制剂不会引起用该动物的奶制成的乳制品中的黑斑缺陷2.权利要求I的方法，其包含注入不含抗感染剂的乳头封闭制剂3.权利要求I的方法，其包含注入不含铋的乳头封闭制剂4.权利要求I的方法，其包含注入不含抗感染剂且不含铋的乳头封闭制剂5.权利要求I的方法，其包含注入在包含甘油三酯的基质中含有无铋、无毒金属盐的乳头封闭制剂6.权利要求I的方法，其包含注入包含至少约30%重量的无毒金属盐的乳头封闭制剂7.权利要求I的方法，其包含注入包含约50%至约75%重量的无毒金属盐的乳头封闭制剂8.权利要求I的方法，其包含注入包含约65%重量的无毒金属盐的乳头封闭制剂9.权利要求I的方法，其中所述无毒金属盐选自钛盐、锌盐、钡盐和它们的组合10.权利要求I的方法，其中所述无毒金属盐选自二氧化钛、氧化锌、硫酸钡和它们的组合11.权利要求I的方法，其中所述凝胶基质包含选自以下的油动物性脂肪、低芥酸菜籽油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、菜籽油、豆油、向日葵油、鱼油、藻油和它们的组合12.—种乳房内乳头封闭剂,其以组合方式包含 包含甘油酯的凝胶基质；和 分散于所述凝胶基质中的无毒金属盐13.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述凝胶基质包含甘油三酯14.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述凝胶基质包含选自以下的油动物性脂肪、低芥酸菜籽油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、菜籽油、豆油、向日葵油、鱼油、藻油和它们的组合15.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述乳头封闭剂不含抗感染剂16.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述乳头封闭剂不含铋17.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述乳头封闭剂不含抗感染剂且不含铋18.权利要求12的乳头封闭剂，其包含至少约30%重量的无毒金属盐19.权利要求12的乳头封闭剂，其包含约50%至约75%重量的无毒金属盐20.权利要求12的乳头封闭剂，其包含约65%重量的无毒金属盐21.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述无毒金属盐选自钛盐、锌盐、钡盐和它们的组合22.权利要求12的乳头封闭剂，其中所述无毒金属盐选自二氧化钛、氧化锌、硫酸钡和它们的组合23.在非人类动物的乳头管内形成物理屏障、用于在动物的干奶期间预防性治疗乳房疾病的方法中的改进，所述方法包含注入封闭制剂至动物的乳头管中的步骤，所述改进包含 注入如权利要求12所述的乳头封闭制剂

本发明涉及含有金属的乳房内乳头封闭剂，用在不泌乳奶牛中预防乳腺炎该乳房内乳头封闭剂不会在用受治疗动物的奶制成的乳制品(尤其是奶酪)中引起视觉缺陷本发明还涉及在奶酪中预防“黑斑缺陷”(BSD)的方法背景在乳畜群中的乳腺炎是乳品生产者遇到的最昂贵和困难的疾病之一针对治疗临床的乳腺炎的常规疗法包括乳房内抗微生物疗法虽然商业可购得很多乳房内抗微生物产品，临床乳腺炎的治愈率依然令人困惑地低链球菌属乳腺炎为46%，葡萄球菌属乳腺炎为21 金黄色葡萄球菌乳腺炎只有9%见Wilson等(1996) National Mastitis CouncilProceedings 164-165,和Crandall等(2005)NMC Annual Meeting Proceedings 215-216因此，乳品生产者通常仅通过从他们的畜群中剔除有乳腺炎倾向的动物来控制疾病由于治疗乳腺炎的困难性，在乳品产业中预防新的乳房内感染是主要的焦点干奶期间的新感染的比率显著高于泌乳期间的新的感染(例如，某一研究表明所有新的革兰阴性乳房内感染的61%发生于干奶期见Todhunter等(1995) J. Dairy Sci. 78 2366.)紧接着干奶后的三星期和产犊前的两星期是特别易于新感染的期间因此，近年来乳品生产者集中大量的努力于干奶期间奶牛的“预防保持”2003年4月，在美国市场引入了一种用于干奶奶牛的内部(或“乳房内”)乳头封闭剂(ITS)该产品开发于新西兰，在美国以“0RBESEAL”商标(美国商标注册号2，772，198和3，120,693)市售引入美国市场的“0RBESEAL”商标的ITS含有分散于粘稠糊剂中的65% w/w碱式硝酸铋该ITS产品不含有任何抗生素，该产品也不含有任何活性抗微生物齐U以施用抗生素于干奶奶牛的相同方式，将该ITS用管状给药注射器注射入乳头末端该ITS产品填充乳头管的裂缝和褶皱，由此对病原体产生物理屏障见发行于2001年7月3日的美国专利号6，254，881，其通过引用结合到本文中在新西兰“0RBESEAL”商标的产品的初期研究推断，该产品在产犊时预防新的乳房内感染并在哺乳的头五(5)个月预防乳腺炎的临床表现中，与广谱长效乳房内抗生素同样良好地作用见 Woolford 等(1998) New Zealand Veterinary Journal 461在美国更近期的研究还推断该ITS产品改善已经注入苄星邻氯青霉素的奶牛的乳房健康见Godden 等(2003) J. Dairy Sci. 86 3899_3911因此，“0RBESEAL” 商标的 ITS 被证实是减少奶牛在它们的干奶期间乳腺炎新病例的数量的有效工具虽然它相对近期才引入美国市场，“ORBESEAL”商标的产品具有普遍的市场接受度并广泛用于美国乳畜群简言之，“0RBESEAL”商标的产品在它的预防乳腺炎的预期目的上非常好“ORBESEAL”商标的ITS产品在美国引入之后，在陈化乳制品中，最显著地在陈化车达(cheddar)奶酪中，开始出现视觉缺陷视觉缺陷以小的黑斑(约0. 5_5mm直径)形式遍布于陈化奶酪中该斑点是纯粹美观的、视觉的缺陷，其降低了受这个问题影响的奶酪的品质等级(及由此降低市场价值)该斑点在奶酪中不伴随有任何感观性能缺陷受黑斑影响的奶酪是易卖的，虽然比不受影响的奶酪等级差所述缺陷被称为“黑斑缺陷”(BSD)发明简述本发明的第一形式涉及一种在非人类动物的乳头管内形成物理屏障的方法，用于在动物的干奶期对乳房疾病进行预防性治疗，并同时防止用该动物的奶制成的乳制品中的BSD该方法包含将乳头封闭制剂注入动物的乳头管内该乳头封闭制剂可含有铋或可以是无铋的该制剂以足够形成阻止微生物进入乳头的物理屏障的量给予，但不会在该动物的奶制成的乳制品中引起黑斑缺陷优选封闭剂不含抗感染剂(即该乳头封闭剂优选不含有抗生素或其它抗感染活性剂)优选方法包含注入乳头封闭制剂，该乳头封闭制剂包含至少约30%重量的无毒金属盐，更优选约50%至约75%重量的无毒金属盐，和更优选约65%重量的无毒金属盐盐的目的主要是给予组合物足够的密度以使ITS “沉降”入乳头管在该方法的一个形式中，无毒金属盐选自铋盐、钛盐、锌盐、钡盐和这些盐的组合物最优选的盐是碱式硝酸铋，二氧化钛，氧化锌，硫酸钡和这些盐的组合物这些金属的其它无毒盐明确地在本发明范围内，比如卤化物、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、硝酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、草酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐等凝胶基底可以是任何适合的凝胶制剂，许多凝胶制剂公知于制药领域优选的凝胶基底含有单、双和/或三酸甘油酯，其给予极大提高了的清洁度甘油酯可含有来源于饱和的或不饱和的脂肪酸的同侧链或不同侧链因此，通过非限制性实例，单、双和/或三酸甘油酯可包含由癸酸、十二烷酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、十五酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、十七酸、肉豆蘧烯酸、棕榈油酸、油酸、顺二十碳-9-烯酸、芥酸、顺蓖麻酸、亚油酸、亚麻酸、里卡利酸、十七碳一烯酸(margaroleic acid)、花生四烯酸、鲽鱼酸(clupanadonic acid)、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等衍生的侧链具有更长或更短的侧链的甘油酯也可使用所述甘油酸酯可包含或衍生于天然动物或植物的油或脂肪，比如(但非限制于)动物性脂肪、低芥酸菜籽油(canola oil)、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、菜籽油、豆油、向日葵油、鱼油、藻油等特别优选的凝胶基底是低芥酸菜籽油、玉米油和/或棉籽油有许多甘油酯的商品供应者，比如ABITEC Corporation,Columbus，OhioABITEC 的产品“CAPTEX 355”，目录号65381-09-1 和 73398-61-5，一种辛酸甘油三酯，在本发明中非常适用因此，在最优选形式中，乳房内乳头封闭剂以组合形式包含包含甘油酯的凝胶基底；和分散于凝胶基底中的无毒金属盐因此优选的对应方法包含将一定量的乳头封闭制剂注入动物的乳头管中该乳头封闭制剂包含分散于包含甘油酯的凝胶相中的无毒金属盐，其中注入的乳头封闭制剂的量足够形成阻止微生物进入乳头的物理屏障乳头封闭制剂还不会在所述动物的奶制成的乳制品中引起黑斑缺陷本发明的另一形式涉及一种乳房内乳头封闭剂，其基本上由包括单、双和/或三酸甘油酯的凝胶基底，组合分散于凝胶基底中的无毒金属盐而组成，其中金属盐是碱式硝酸铋如之前提到的，乳头封闭制剂优选包含至少约30%重量、更优选约50%至约75%重量，还更优选约65%重量的金属盐本发明的另一形式是乳房内乳头封闭剂的改进尤其是，在非人类动物的乳头管内形成物理屏障、用于在动物的干奶期间乳房疾病的预防性治疗的方法中，其中该方法包含将无抗感染剂的封闭制剂注入动物的乳头管内的步骤，本发明的改进包括注入在含有甘油酯的凝胶基底中包含无毒金属盐的乳头封闭制剂该改进防止受治疗动物的奶制成的乳制品中黑斑缺陷的形成本文用的数值范围旨在包括包含于该范围内的每个数值和子集，不论是否明确公开此外，这些数值范围应解释为对涉及该范围内任何数值或数值子集的权利要求提供支持例如，从I至10的公开应解释为支持从2至8，从3至7、5、6，从I至9，从3. 6至4. 6，从3. 5至9. 9等的范围所有对本发明的单数特征或限定的指示物应包括相应的复数特征或限定，并且反之亦然，除非另外详细说明或通过作出该指示物的上下文清楚地意指为相反本文所用的所有方法或方法步骤的组合可在任何顺序下进行，除非另外详细说明或通过作出该所指组合的上下文清楚地意指为相反本发明的方法可包含、包括本文描述的方法和产品的基本要素和限定，以及本文描述的或者在合成有机化学中有用的任何其他或任选的成分、组成或限定，或基本上由其组成附图简述图IA和IB是在在18kg陈化的白色车达奶酪块中的典型的黑斑缺陷的照片图IA显示酪块的表面，带有容易看到的黑斑缺陷图IB是表明缺陷尺度的放大视图(带叠加的直尺)这样的斑点平均地分布于整个奶酪中图2是呈现铋(III)硫化物纳米棒的特征性毛发状或棒状结构的黑斑缺陷的电子照片在任何无BSD奶酪或试验的无BSD奶酪区未出现这样的结构显示于图2的棒具有直径范围为 37. 09nm-129. 33nm图3是黑斑缺陷区域的单个棒状结构的电子照片该棒显示直径为130. 88nm，并呈现二等分棒长度的线图4A和4B是实验室诱导的黑斑缺陷的图像在图4A中，将“ORBESEAL”商标的乳房内乳头封闭剂(ITS)的各种成分与奶酪混合并且对每个斑点立即照相图4B显示在暴露于陈化车达奶酪挥发物或硫化氢后照相的相同斑点位点4和5分别含有碱式硝酸铋和完整的“ORBESEAL”商标的ITS制剂图5是描述各种类型的ITS的清洁度的矩形图图6是描述ITS制剂在不同温度下的粘度曲线图X轴表示温度(°C )，Y轴表示粘度发明详述开始于2003年后期，奶酪生产者向Wisconsin-Madison大学食品科学部门和乳品研究中心(CDR)提出许多咨询，寻求在陈化的奶酪，特别是陈化的车达奶酪中出现新的“黑斑缺陷”的信息在历史上，奶酪中由灰到黑的污点由几个不同和清楚的原因导致，包括特定微生物(例如某些环境丙酸杆菌或霉菌)的生长或食物级润滑碎屑对奶酪的污染然而，奶酪生产者注意到的该特殊BSD不符合细菌污染或其它变质生物体的外形，它看来也不是那些进入奶流中的润滑碎屑或在奶酪生产过程中引入的其它碎屑因此，第一步是测定黑斑缺陷的化学结构最初做出大量的努力于提取BSD奶酪的受影响区域用不同极性、疏水性等的广谱有机溶剂的提取努力，作为从奶酪基质分离任何类型的有机色素物质的手段，被证明没有结果尽管用有机溶剂对BSD的提取不成功，该提取努力的确产生有用的数据值得注意的是，由于该色素不溶解或扩散进入这样的溶剂，其可推断(具有高度的可能性)该黑斑色素同样不在奶酪基质本身内溶解或扩散渐增数量的呈现缺陷的奶酪样品(从商业奶酪制造者累积的样品)的目视检测确认了这个结论-黑斑色素被良好地容纳并且看起来不扩散进入奶酪基质见图IA和1B，其为典型的受BSD影响的18kg陈化的、白的车达奶酪块的照片图IA是奶酪块外表面的照片图IB是单个黑斑的放大视图，带有重叠于图像上的直尺，以显示斑点的尺度如图IA和IB中显示的斑点通常平均地分布于整个奶酪块中，直径尺度范围从< Imm至约5_任何给出的18kg奶酪块内的斑点的频率在很大程度上变化，从每块< 10个至远大于100个一些从奶酪生产者里收到的无对照报告指出，特别的陈化的和保存策略可能有助于溶解或扩散斑点至它们不再是视觉上显著的程度(由于该缺陷是不伴有任何感官性能缺陷，“褪去”该斑点将改善这种情况)然而，因为给出了在用于提取努力的有机溶剂中的色素稳定性，这样的效果极不可能简言之，由本发明人进行的提取实验用具有类似于乳脂的疏水性的溶剂如果该黑斑色素溶解或扩散进入奶酪基质本身(经陈化或贮存方案)，该色素应同样易于溶解或扩散进入具有物理性质类似于乳脂的有机溶剂那样的结果未出现于实验室中此外，给定了在奶酪中典型PH/酸性环境，和多数陈化车达奶酪(0.5-2年)相关的典型的陈化/保质期，该缺陷可经陈化或贮存方案改善的无对照证据没有价值然而一实验显示的最大启发是黑斑色素在硝酸中易于溶解这强烈提示该色素是无机盐结合该缺陷的第一次出现的时间，形成一种工作假设，即该ITS或者是BSD的致病因素(或至少与之相关)黑斑色素易溶于酸的发现支持进一步的假设色素可能包含铋III硫化物因此，推断在美国含有65%重量的含铋盐的“ORBESEAL”商标的产品可能不经意地引入到奶流中如上所述，该“ORBESEAL”商标的产品在商业上是成功的，因为它形成阻止病原体进入乳头管的紧密的物理屏障然而，从受治疗的动物除去该产品需要从动物的乳头剥离看来一些ITS在剥离后残留于乳头中，并进入奶酪中研究的下一阶段依据一种假设操作，该假设是铋III硫化物实际上是BSD的致病因素碱式硝酸铋本身是白色的和相对化学惰性的因此，在液体牛奶、马苏里拉(mozzarella)奶酪和酸奶中存在的其痕量不易明显看到然而，在带有高气味强度的陈化奶酪中，黑斑缺陷看起来显著因此，假设铋III硫化物(黑色的相对不溶的盐)是碱式硝酸铋(来自ITS)和硫化氢之间的反应产物，该硫化氢通过熟化微生物群、酶类和作用于奶酪的蛋白/氨基酸成分的某些辅因子的作用而在陈化奶酪中产生简言之，假设由于在挤奶前ITS清除不完全使得碱式硝酸铋进于奶流然后按照方程式I，该碱式硝酸铋与硫化氢反应产生铋III硫化物4BiN03 (OH)2BiO (OH)+H2S^Bi2S3 (不溶，黑色)(方程式 I)产物铋 III 硫化物(或只是硫化铋)是相对不溶的黑色的盐除了具有特别的元素目标铋之外，假设在奶酪基质中存在的条件或化学环境下，Bi2S3分子将形成在文献中称为纳米棒或纳米晶须的结晶结构见W. Zhang等(2001)Sol.State Comm. 119 143-146 和 B. Zhang 等(2006) J. Phys. Chem. 110 8978_8985这些含铋的纳米棒将由此构成光学衍射颗粒，其能赋予见于黑斑缺陷中的灰至黑的色调随之，努力集中于证实1)在黑斑缺陷中铋元素的存在；和2)证实在黑斑缺陷中铋III硫化物纳米棒结构的物理存在证实在黑斑中铋的存在，使用电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)研究用AOAC国际(分析共同体协会，Association of Analytical Communities)方法 993. 14第一步努力为对多个黑斑筛选可促成BSD的几种元素的存在初始实验集中于牛奶和奶酪处理/运输设备发现的典型的金属盐/氧化物，和其他存在于食物级加工中的残留金属衍生物作为对照的测量，进行奶酪成分分析具体的，分别用法定分析方法，AOAC第17版(版权2000, ISBN 0935584-67-6)的方法 2001. 14、935. 42 和 926. 08 测量蛋白、灰分，和水分根据法定分析方法，AOAC第17版描述的方法测量脂肪进行透射电子显微镜(TEM)研究如下加入约100 U I双蒸馏水至样品中，并用玻棒将混合物粉碎至成悬浮液将悬浮样品约5 Ul的等分部分沉积于涂有聚乙烯醇-甲醛缩醛的300目铜TEM网格(Ted Pella, Inc.，Redding, CA)用小块滤纸将过量的样品吸去，并在室温下将剩余样品干燥至网格表面在一些情况下，将NANO-W-商标的TEM阴性着色剂(Nanoprobes, Incorporated, Yaphank, NY)应用于干燥样品上以增强对比度和可见度用Philips CM 120电子显微镜观察样本,并用MegaView 3数码摄影机(来自SIS, Ringoes,NJ)收集图像用已知长度的参比样品校准的SIS-商标的分析软件(Ring0es，NJ)进行测量ICPMS结果证明元素铬、铜、铁、镍和铋存在于BSD区域中尽管发现元素铬、铜、铁和镍的增量增加，在BSD区域的铋浓度通常为在非BSD区域分析的相同奶酪的三阶次大这些结果说明铋是以参加色素生成反应的足够数量存在的唯一元素奶酪样品的BSD区域的几百个TEM图像获得了单一、一致的结论以上引用的文献报道的那些中典型的纳米棒独特地存在于BSD奶酪区域这样的图像的一个实例呈现于图2图2显示的纳米棒结构太小而不易用光学显微镜检测图2显示的纳米棒直径范围为约69nm-约130nm该纳米棒对TEM可能的破坏情况非常稳定这些棒看来具有轻微斑驳的表面，并且它们呈现沿该纳米棒长度延伸的特征线见图3，其为单个纳米棒的增加放大倍数的视图这样的结构的存在与在奶酪基质中的条件下形成的硫化铋纳米棒的存在一致为证实碱式硝酸铋作为反应物形成铋Ill硫化物纳米棒的反应性，进行其他分析以察看BSD是否能在实验室中有目的性地再现简言之，用已知量的ITS成分制备奶酪，并且经受由成熟奶酪产生的真实的挥发性物，或直接暴露于假设的碱式硝酸铋共反应剂-硫化氢气体在两种情形中，反应总是相同的当含有碱式硝酸铋或完整的ITS制剂的奶酪样品暴露于真实的奶酪挥发物或“化学标准”级H2S气体时，每个都形成相同的黑色着色，伴随纳米棒结构的出现，进一步证实碱式硝酸铋是BSD的原因结果显示于图4当这样暴露时无其他ITS成分形成黑斑此外，当接触真实奶酪挥发物或硫化氢气体时,敏感位点形成相同的黑色着色，因此证实硫化氢气体是可疑的共反应剂从奶酪制备和陈化或熟化观点上，认为以消除硫化氢气体的产生为目标作为控制BSD的手段是不合理的硫化氢是一种高度气味活性的化合物，是针对含硫氨基酸(比如半胱氨酸)的微生物、酶和辅因子活动的产物见Arfi等(2002)Appl. Microbiol.Biotechnol. 58 503_510大量研究支持硫化氢是典型的陈化车达奶酪香味的必需的和/或重要的成分的主张见Burbank和Qian(2005) J. Chrom. 1066 149_157即使设计方案以消除硫化氢的产生(通过阻断许多复杂的代谢途径)，生成的最终产品有香味特征不被奶酪定级者和消费者接受的风险实施例仅为了提供本文公开和要求保护的发明的更完整的描述而包括以下实施例实施例不以任何方式限制本发明实验例I 配制用氧化锌和氧化钛的组合作为金属盐的试验ITS除了它不含有任何铋或含铋的盐，该试验ITS与“ORBESEAL”商标的制剂相同该试验ITS包含氧化锌、二氧化钛、矿物油(30-40% )和硬脂酸铝为制备一批ITS，将液体石蜡(例如矿物油)供给到适当的装有搅拌器的容器中加入硬脂酸铝，搅拌混合物并加热至约160°C直到均匀(约两个小时)然后在搅拌下将无毒的不含有铋的盐分次加入到混合物中，直到已加入需要的金属盐的量随后搅拌混合物直到均匀然后将产品转移至常规注射器管中用于乳头内给药实验例2该实施例的目的是与“ORBESEAL”商标的产品相比，比较不包括碱式硝酸铋的ITS在非泌乳奶牛的乳头中的保留该研究在Wisconsin 的 Arlington 的 Wisconsin-Madison 大学(UW)的 Blaine 牛奶场进行在干奶日编入十六(16)头奶牛(11 = 64个乳头)所有编入的奶牛要求具有四个功能区域并且没有乳腺炎的可见迹象所有奶牛是干奶的，并根据标准UW乳畜群方案接受乳房内抗生素不泌乳奶牛治疗(dry cow therapy,DCT)记录每头奶牛的产次和产奶量(在干奶期)在入编初期，对乳头的形状、长度、直径和乳头末端过度角化的程度评分在每头奶牛中，分配两个乳头接受“ORBESEAL”-商标的ITS，并分配两个乳头接受试验ITS设计给药方案，确保在乳头位置中每种产品均匀地给予，每种产品给予每一位置(右后方、右前方、左后方、左前方)的各八个乳头给予前和后称量封闭剂管以测定净给药体积在接受DCT和内部乳头封闭剂前，用单一 70%异丙醇醇擦拭物清洁乳头末端，并用部分插入技术减少引入乳头皮肤病原体的可能性在给予内部封闭剂后，将乳头用外部乳头消毒剂浸溃在第1、2、3、4、5、6、7、14、28、42天时和在产犊时检查乳头，以检测发红、肿胀和/或封闭剂的渗漏在第14、28、42天和在产犊时，通过人工剥离将封闭剂从每头奶牛的一个乳头(每个除去日对每一封闭剂为八个乳头)中除去伴随初乳收集该除去的封闭剂，置于带刻度的50ml塑料管形瓶中离心该管形瓶(3000rpm x 5-7分钟)，冲洗上清液，称重回收的封闭剂比较每个时期试验ITS治疗乳头和“ORBESEAL”商标的ITS治疗乳头回收的封闭剂的量然后用相同方法在产犊后第一天收集样品在所有采样时期，在除去封闭剂后，用外部乳头消毒剂浸溃乳头在产犊后，从所有区域里无菌收集四等份奶样品并培养，以鉴定乳房内的感染情况群组特征-乳头长度和体积总共16头奶牛编入该研究，总数为64只乳头；32只乳头接受试验ITS和32只乳头接受“ORBESEAL”商标ITS受试群体的乳头长度和体积列于表I 表I.通过复合的乳头的长度和体积的平均值、标准偏差(S.D.)和标准误差(S. E.)