专利名称：杀虫基因及其用途的制作方法植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制剂，但二者在实际应用中都具有局限性化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。CrylAb杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki,B. t. k.)产生的伴孢结晶蛋白，是不溶性晶体蛋白。CrylAb蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性PH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，但每年因植物虫害造成的损失巨大， 例如玉米螟、小地老虎或玉米夜蛾、棉铃虫等。已证明CrylAb杀虫蛋白可以抵挡多种鳞翅目昆虫害虫(如玉米螟、棉铃虫等)的侵害，且目前已有大量的研究依据植物的偏好密码子对CrylAb杀虫蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列进行改造，以提高其在植物中的表达水平， 更深入地，分别以提高在单子叶植物或双子叶植物中的表达水平为目的进行改造，而针对具体作物(如玉米)的优化改造并不多见，致使其在玉米中的表达量、毒力等也不够理想。
本发明的目的是提供一种杀虫基因及其用途，其是依据玉米的偏好密码子而进行的优化改造，有效克服现有技术CrylAb杀虫蛋白在玉米中的表达量、毒力等不够理想等技术缺陷。为实现上述目的，本发明提供了一种杀虫基因，其核苷酸序列包括如下(a)或(b) 的序列(a)具有SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列；(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件可为在6XSSC(柠檬酸钠)、0. 5% SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中， 在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述的杀虫基因。为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述表达盒的重组载体。为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述杀虫基因的宿主生物，所述宿主生物为植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本发明还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括将所述的表达盒在植物中与至少一种不同于所述的表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫蛋白质一起表达。进一步地，所述第二种杀虫蛋白质为Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、 α-淀粉酶或过氧化物酶。在本发明中，CrylAb杀虫蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个 Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达CryIAb杀虫蛋白，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。为实现上述目的，本发明还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括使昆虫害虫与抑制量的由所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白接触。为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、 直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明杀虫基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明杀虫基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件， 例如，大约在45°C条件下用6. OX氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50°C条件下用 2. OXSSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0父55(、501到高度严格条件的约0.255(、501。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6XSSC、0. 5(%SDS溶液中，在65°C下与SEQ ID NO :1发生特异性杂交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列， 内含子以及其它可操作地连接到所述杀虫基因的调节序列。所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的 35S启动子、ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的 CTPP靶向液泡。所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列 ’人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列。所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV) 增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-I内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(a-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、 生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是害虫， 例如，但不限于，大部分鳞翅目害虫，如玉米螟、小地老虎或玉米夜蛾、棉铃虫等。本发明中，所述杀虫基因为优化CrylAb基因序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。 所述杀虫基因为用于植物，特别是玉米转化的DNA序列，除了包含由优化CrylAb基因序列编码的蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区。本发明中优化CrylAb基因序列对危害玉米的大多数鳞翅目害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含优化CrylAb基因序列，通过表达抑制量的该蛋白而保护其免受害虫的威胁。抑制量是指致死的或亚致死的剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对由优化CrylAb基因序列编码的蛋白质所靶向的昆虫)。植物材料中杀虫晶体蛋白(ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫为危害玉米的主要鳞翅目害虫，更具体地为亚洲玉米螟、小地老虎或玉米夜蛾、棉铃虫等。此外，包含本发明杀虫基因(优化CrylAb基因)序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺磷抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。本发明提供了一种杀虫基因及其用途，具有以下优点1、表达量高。本发明杀虫基因是完全依据玉米的偏好密码子而进行的优化改造， 同时去除了使mRNA不稳定的序列、PolyA加尾信号和内含子剪切类似位点，且提高了 GC含量，使得本发明杀虫基因特别适合在玉米中表达，且表达量和稳定性均有了显著提高。2、毒力强。本发明杀虫基因是完全依据玉米的偏好密码子而进行的优化改造，同时去除了使mRNA不稳定的序列、PolyA加尾信号和内含子剪切类似位点，且提高了 GC含量，使得本发明杀虫基因不仅特别适合在玉米中表达，而且还显著增强了 CrylAb杀虫蛋白对玉米主要害虫的毒力。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。 图1为本发明杀虫基因及其用途的含有优化CrylAb基因序列的重组克隆载体 DBNOlAb-T构建流程图；图2为本发明杀虫基因及其用途的含有优化CrylAb基因序列的重组表达载体 DBN100053构建流程图；图3为本发明杀虫基因及其用途的含有已知的优化CrylAb基因序列的重组表达载体DBm00053R构建流程图。
2、用I1aqMan验证转入优化CrylAb基因序列的玉米植株分别取转入优化CrylAb基因序列的玉米植株和转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组 DNA,通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测CrylAb基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。检测CrylAb基因拷贝数的具体方法如下步骤11、分别取转入优化Cry IAb基因序列的玉米植株、转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成勻浆，每个样品取3个重复；步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；步骤13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientif ic)测定上述样品的基因组DNA浓度；步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为 80-100ng/y 1 ；步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是以下引物和探针用来检测优化CrylAb基因序列引物 1 (CFl) CGTCAGCGGTTTATCGGAAG 如序列表中 SEQ ID NO 5 所示；引物 2 (CRl) :AGGGACGTTATTGTTCTGTGGC 如序列表中 SEQ ID NO 6 所示；探针1 (CPl) TGGCACCGTGGACTCACTCGATGA 如序列表中 SEQ ID NO 7 所示；以下引物和探针用来检测已知的优化CrylAb基因序列引物 3 (CM) TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID NO 8 所示；引物 4(CR2) CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ IDNO 9 所示；探针2(CP2) CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO 10 所示；PCR反应体系为所述50X引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45 μ 1，100 μ M浓度的探针50 μ 1和860 μ 1 1 X TE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。PCR反应条件为
JumpStart Taq ReadyMix (Sigma) 50χ引物/探针混合物基因组DNA 水(ddH20)
10μ1 Ιμ 3μ1 6μ1步骤温度时间
2195 0C5 分钟
2295 0C30 秒
2360 0C1 分钟
24回到步骤22，重复40次利用SDS2. 3 软件(Applied Biosystems)分析数据。实验结果表明，优化CrylAb基因序列和已知的优化CrylAb基因序列已经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入优化CrylAb基因序列的玉米植株和转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株均获得了含有单拷贝CrylAb基因的转基因玉米植株。第四实施例、转基因玉米植株的杀虫蛋白质检测1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质(CrylAb蛋白)的含量检测本实验中涉及的溶液如下萃取缓冲液:8g/LNaCl, 0. 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4 · 12Η20，0· 2g/LKCl, 5. 5ml/L 吐温 20 (Tween-20)，pH 7. 4 ；洗涤缓冲液PBST:8g/L NaCl,0. 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4 · 12H20,0. 2g/L KCl, 0. 5ml/L 吐温 20 (Tween-20)，pH 7. 4 ；终止液IMHCl。分别取3mg转入优化CrylAb基因序列的玉米植株和转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株(正对照)的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入800 μ 1所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心lOmin，取上清液用所述萃取缓中液稀释40倍，取80 μ 1稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRL0GIX公司， CrylAb/CrylAc试剂盒)对样品中杀虫蛋白质(CrylAb蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。转入优化CrylAb基因序列的共4个株系(S4、S5、S6和 S7)，转入已知的优化CryIAb基因序列的共3个株系(Si、S2和S3)，经荧光定量PCR鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3株进行测试， 每株重复6次。转基因玉米植株的杀虫蛋白质(CrylAb蛋白)含量的实验结果如表1所示。分别测得转入优化CrylAb基因序列的玉米植株、转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株、野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株的新鲜叶片中杀虫蛋白 (CrylAb蛋白)平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)分别为5291. 61,2739. 20、0和0。上述结果表明，转入已知的优化CrylAb基因序列的玉米植株中的杀虫蛋白平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)为2739. 20，而转入优化CryIAb基因序列的玉米植株中的杀虫蛋白平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)为5291. 61，为前者的2倍，这一结果表明完全依据玉米的偏好密码子改造的优化CrylAb基因序列显著地增加了 CrylAb蛋白在玉米中表达的稳定性和表达量。
表1、转基因玉米植株的CrylAb蛋白表达量测定平均结果


本发明涉及一种杀虫基因及其用途，杀虫基因的核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明杀虫基因特别适合在玉米中表达，不仅显著提高了Cry1Ab杀虫蛋白表达量和稳定性，而且显著增强了Cry1Ab杀虫蛋白对玉米主要害虫的毒力。