一种活细胞精华液产品及其制备方法和应用的制作方法[0002]目前国内外有关干细胞在美容方面应用的产品主要集中在以下几个国家:日本的人胎素(莱乃康)、胎盘素(美思满)；瑞士的羊胎素(LFS );韩国的脂肪干细胞蛋白(AAPE)等。[0003]莱乃康是日本JBP高尖生物技术打造的胎盘素针剂，是最早获得厚生省批准的产品之一，美思满是日本美思满医药科技有限公司研制成功并于1956年开始生产，两者都是从人体胎盘提取的100%萃取物，内含基因修复因子、细胞活化因子及氨基酸等多种生命元素。莱乃康可以皮下、肌肉、静脉使用，美思满只能皮下注射，该类产品能够通过毛细血管迅速抵达皮下组织，促进皮肤细胞的分裂，对于皮肤粗糙、暗晦、色斑、粉刺、皱纹、疤痕等都有很大改善，使皮肤变得光滑有弹性，长期使用能够使老化的细胞重新开始分裂，人体恢复并保持年轻健康态。[0004]但是这些产品原材料获得困难，需要大量的人胎盘，成本高制约了该类产品的发展；同时每批胎盘素的活性成分含量多寡也差距颇大，产品品质易不稳定；其次使用时要到相应的正规医疗机构或者医院进行注射，使用不方便。[0005]瑞士的羊胎素源自于该健康医疗中心，已有70多年的发展史。是从阿尔皮斯高山黑绵羊母体内约5个月的小样胚胎中提取的含有特别丰富活性物质的细胞产生的活性因子，临床应用表明:羊胎素可以消除皱纹、恢复肌肤弹性、缩小皮肤毛孔、恢复皮肤光泽等功效，长期使用能够提高人的免疫力，延缓衰老。[0006]但是羊胎素来源于动物，可能导致因物种间差异导致的过敏、感染等问题；而且其提取和精炼技术非常复杂，如今只能在实验室完成，不能进行大批量生产；此外，经过提纯的羊胎素在极为苛刻的温度要求下最多只能保存6个月，根本不适合长途运输，不能成为大众消费，只是极少数人可以承担的奢侈品。[0007]韩国的脂肪干细胞蛋白萃取物(AAPE)是在韩国上市的全球首支脂肪干细胞护肤品，是由韩国成均馆大学和Prostemics企业联合研制的，他们发现从脂肪组织中获得的干细胞所生成的蛋白质混合物具有促进皮肤再生的效果，且美国护肤品协会已在《国际护肤品原料词典和手册》中将这种蛋白质萃取物命名为“AAPE”。[0008]该AAPE蛋白质萃取物是从脂肪干细胞分泌物中浓缩、水解和纯化而获得，在修复受伤皮肤和皮肤抗衰老上效果显著，但是其价格昂贵，也是极少数人可以消费的奢侈品，而且经过水解，生物活性物质的活性受到损伤，较易引起皮肤过敏。
[0009]目前国内该类产品主要还是重组单一因子产品，如金因肽、美国疤克、贝复济等均含有EGF或FGF等单一细胞生长因子，可以直接满足皮肤的生长需要，美容和皮肤创伤愈合短期效果显著，皱纹细化明显，但是是单一细胞生长因子成份，长期使用皮肤对其有依赖性和抵抗性，效果会逐渐减弱。
[0010]活细胞精华液是从脂肪干细胞的旁分泌机制中分离、纯化获得，含有细胞生长已知和未知的380多种有效蛋白，来源纯天然。活细胞精华液能够加快细胞的新陈代谢，完善胶原组织的构建，改善皮肤的衰老过程和加速创面愈合的速度，起到美容和修复创面的效果，真正做到从细胞水平上实现肌肤的生物美颜，在修复损伤皮肤和美容美肤上更安全、更有效、稳定性更强。
[0011]干细胞疗法作为新型的治疗方式，其应用已涉及生长发育、创面愈合和组织工程等多个方面。随着对干细胞研究的不断深入，研究者发现移植干细胞分化成组织细胞的几率很低且移植后存活时间很短，因此干细胞依靠其分泌的营养因子网络改善病理微环境，修复组织器官的推论逐渐被接受。
[0012]干细胞能够分泌大量细胞因子，以间充质干细胞为例，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，修复和抑制细胞的凋亡，从而达到修复组织的目的。移植干细胞进行创面修复，干细胞分化成组织细胞的几率很低且移植后存活时间很短，不能有效发挥作用；植物或重组因子制剂不能直接涂抹于创面或作用单一，创面只能自然愈合，时间长。干细胞注射剂直接进入人体虽然可以达到美容的效果但容易出现免疫排斥问题。
[0013]从人的脂肪组织中分离出的脂肪干细胞(ADSCs)，是一种类似于间充质干细胞(MSCs)的细胞群，拥有多向分化潜能。ADSCs也属于来自中胚层的成体干细胞，其体外扩增和自我更新能力很强，经过诱导培养可分化为脂肪细胞、骨和软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、血管内皮细胞等等。其旁分泌机制与间充质干细胞类似。
[0014]活细胞精华液中富含细胞生长因子和胶原蛋白分子，能够促进上皮细胞(表皮细胞、内皮细胞)、成纤维细胞等多种细胞的迁移，加速创面愈合速度；与靶细胞表面特异性结合，促进各种细胞的分裂增殖和抑制凋亡，改善皮肤环境；促进细胞基质(胶原蛋白、细胞粘附因子、纤维连接蛋白、透明质酸等)的合成，补充皮肤所必需养分，预防和减少疤痕形成。
[0015]活细胞精华液含有的典型细胞生长因子功能和作用:
EGF:表皮生长因子(EGF)可促进羟脯氨酸的合成，促使胶原及胶原酶合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，调节胶原纤维，故具有滋润皮肤，增强皮肤弹性，减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老的作用。
[0016]FGF:成纤维细胞生长因子(FGF)能刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，使胶原纤维以线性方式排列，防止结缔组织异常增生，故而有缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用，对防止和护理痤疮有较好的效果。
[0017]PDGFB:血小板衍化生长因子(PDGFB)是一种多肽生长因子，是一种多种细胞合成和分泌的多功能蛋白质，对胶质细胞和间质细胞具有促有丝分裂和趋化作用，直接或间接参与了创伤修复过程中的炎症反应、组织和细胞的分化与增殖过程，对正常以及病理状态下的创伤愈合均有显著作用。
[0018] VEGF:血管内皮细胞生长因子(VEGF)能促进新生毛细血管生成，使肉芽组织增生良好，新生上皮覆盖明显加快，从而使单纯性创伤快速愈合。
[0019]活细胞精华液是从脂肪干细胞的旁分泌机制中分离、纯化获得，含有细胞生长的多种有效蛋白，来源纯天然。活细胞精华液中富含细胞生长因子和胶原蛋白分子，能够促进上皮细胞(表皮细胞、内皮细胞)、成纤维细胞等多种细胞的迁移，加速创面愈合速度；与靶细胞表面特异性结合，促进各种细胞的分裂增殖和抑制凋亡，改善皮肤环境；促进细胞基质(胶原蛋白、细胞粘附因子、纤维连接蛋白、透明质酸等)的合成，补充皮肤所必需养分，预防和减少疤痕形成。活细胞精华液能够加快细胞的新陈代谢，完善胶原组织的构建，改善皮肤的衰老过程和加速创面愈合的速度，起到美容和修复创面的效果，真正做到从细胞水平上实现肌肤的生物美颜。


[0020]发明目的:本发明的第一个目的提供了一种条件培养基。
[0021]本发明的第二个目的提供了一种活细胞精华液产品及其制备方法。
[0022]本发明的第三个目的提供了上述活细胞精华液的应用。
[0023]技术方案:为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现:一种条件培养基，按重量份数包括以下组分:碱性纤维细胞生长因子0-0.05份、表皮生长因子0-0.05份、DMEM/F1294.9-95.9份、抗生素1份、谷氨酸盐1份、非必需氨基酸1份、抗氧化剂0-1份。[0024]优选地，按重量份数包括以下组分:碱性纤维细胞生长因子0-0.05份、表皮生长因子0-0.05份、DMEM/F1295份、抗生素1份、谷氨酸盐1份、非必需氨基酸1份、抗氧化剂I份。
[0025]一种活细胞精华液产品的制备方法，包括以下步骤:
1)人体脂肪的获取；
2)加入消化液消化人体脂肪获得单个脂肪干细胞；
3)完全培养基培养脂肪干细胞，贴壁纯化、扩增；
4)细胞冻存、复苏后扩大培养；
5)采用所述的条件培养基促进脂肪肝细胞分泌ADSCs分泌液，收集ADSCs分泌液；
6)通过超滤杯蛋白截留系统浓缩ADSCs分泌液，获得活细胞精华液产品。
[0026]上述体外培养脂肪干细胞保证在8代以内。分离培养的脂肪干细胞应表达STR0-1，CD44、CD90，CD105，CD73，不表达 CD34，CD133, CD14，CD45 表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95%和98% ;干细胞经过严格的细菌性和外源物质的检验，细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等无污染。
[0027]其中，上述混合酶为IV型胶原酶和胰酶。
[0028]其中，上述消化液为含有0.075%的IV型胶原酶、0.25%胰酶-EDTA和1%青霉素/链霉素的PBS。
[0029]上述的制备方法具体包括以下步骤:
I)首先通过吸脂术获得人脂肪，剪刀剪碎，用PBS(含青霉素、链霉素)清洗去除血细胞。
[0030]2)采用含有0.025%-0.1%的IV型胶原酶和0.025%_0.125%胰酶的消化液初次消化脂肪组织，再用0.05%-0.125%胰酶-EDTA消化未消化脂肪组织，进一步获得更多的ADSCs。[0031]3)对所获ADSCs用完全培养基[DMEM/F12 (1:1), 10%FBS, 1%青/链]体外培养，传代2-5次，利用贴壁筛选方法进一步纯化ADSCs，对纯化后的ADSCs液氮冻存(冻存液10%DMS0, 20%FBS, 70%DMEM),每个冻存管1ml，脂肪干细胞个数I X IO7个/ml，保存为细胞种子。
[0032]4)取出冻存ADSCs, 37 °C Imin复苏、T175瓶2瓶培养，融合80-90%后扩大培养。
[0033]5)去除多层细胞培养瓶中完全培养液，添加条件培养基，培养1-7天，收集分泌液。
[0034]6) 通过超滤杯蛋白截留系统浓缩ADSCs分泌液，获得活细胞精华液产品。
[0035]一种活细胞精华液产品，由上述的制备方法制备而成。
[0036]一种活细胞精华液产品在制备美容用品方面的应用。本发明的活细胞精华液产品可以添加到化妆品中起到祛斑祛皱、细化皱纹、美容皮肤的效果；还可以可以直接作用于创伤表面，改善病理微环境，修复体表创面。作为修复创面的药物使用。
[0037]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:
1、采用混合酶、分阶段分离脂肪干细胞，尽量从较少的脂肪组织中获取更多的ADSCs，采用一般酶解法，ADSCs得率约1000个/mg，我们的新方法ADSCs得率3000~5000个/mg。
[0038]2、为了使分泌液中生物活性物质更多，选用条件培养基促分泌，提高主要蛋白活性因子的含量，增加产品的疗效。蛋白纯化采用蛋白截留系统方式，既不不损伤蛋白的活性，又避免了终制品中掺加其他杂质。
[0039]3、条件培养基中不含动物来源物质，避免物种间差异导致的过敏、感染等问题。产品中富含EGF、FGF、PDGFB, VEGF等生物活性因子，利用条件培养基提高产品中主要活性物质的浓度。



[0040]图1本发明的活细胞精华液产品的制备方法流程图；
图2本发明高通量细胞因子群阵列分析结果图；
图3本发明活细胞精华液修复细胞效果图；图中是小鼠糖尿病溃疡模型；
图4本发明活细胞精华液减少皮肤皱纹、防止皮肤老化的效果图。

[0041 ] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0042]实施例1
一种条件培养基，按重量份数包括以下组分:碱性纤维细胞生长因子0.05份、表皮生长因子0.05份、DMEM/F12 95份、抗生素1份、谷氨酸盐1份、非必需氨基酸1份、抗氧化剂1份。
[0043]实施例2
一种条件培养基，按重量份数包括以下组分:表皮生长因子0.05份、DMEM/F12 95.9份、抗生素1份、谷氨酸盐1份、非必需氨基酸1份、抗氧化剂1份。
[0044]实施例3一种条件培养基，按重量份数包括以下组分:碱性纤维细胞生长因子0.05份、DMEM/F12 94.9份、抗生素1份、谷氨酸盐1份、非必需氨基酸1份。
[0045]实施例4脂肪干细胞的提取
1、组织获取及清洗:吸脂手术获得自体脂肪组织，剪刀剪碎后将脂肪组织一次挤压进入准备好的50ml离心管中，每个离心管中组织不超过15ml。无菌条件下吸取PBS (含有青霉素/链霉素)对组织进行洗涤，用吸管吹打10 — 20次，然后静置Imin左右，用吸管将组织下层液体吸出。如此反复直到脂肪组织尽可能清洁。
[0046]2、组织消化:向有脂肪组织的离心管中加入等体积的消化液，其中消化液为含有
0.075%的IV型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA，1%青霉素/链霉素的PBS，将样品放入37° C恒温摇床中，190r/min,震荡消化30_60min。
[0047]3、离心分离:吸出离心管下层液体到完全培养基(含10%FBS的DMEM)终止消化。上层未消化的脂肪组织进行再次消化，将下层细胞悬液以1200rpm，4°C，离心5min。[0048]4、再次消化:将未消化的脂肪组织加0.05%胰酶-EDTA进一步消化，将样品放入37° C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30_60min。消化后步骤同步骤4。
[0049]5、细胞培养:弃去上层油以及上清，用培养基(DMEM，10%FBS, 1%青/链)对沉淀进行重悬、合到I管50ml离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，将收集到的细胞重悬于培养基(DMEM，10%FBS, 1%的1%的青霉素/链霉素)中，按照一定密度(1X105)接种到T25培养瓶中，37° C，5%的C02进行培养。约48h后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每三天换液一次，待细胞生长融合达80%-90%时(7 —10天)，用0.05%胰酶-EDTA消化后传代。
[0050]实施例5脂肪干细胞的冻存和复苏
1、收获细胞:用0.05%胰酶-EDTA消化贴壁脂肪干细胞，2min后添加完全培养基终止消化，1500rpm, IOmin, PBS清洗一次，添加细胞冻存液混匀移入冻存管中。
[0051]2、细胞冻存:把细胞冻存管放入程序降温盒中，放入_80°C冰箱过夜，再放入液氮te中保存。
[0052]3、细胞复苏:从液氮罐中取出细胞冻存管迅速置于37°C水浴锅中水浴化冻lmin，用PBS清洗掉冻存液后用完全培养基重悬，分两个T175培养瓶培养。
[0053]实施例6活细胞精华液产品的获得
将实施例5培养得到的复苏的脂肪干细胞中去除多层细胞培养瓶中完全培养液，添加实施例1或2或3的条件培养基培养1-7天，收集ADSCs分泌液。脂肪干细胞ADSCs分泌液首先经过高速离心去除细胞碎片，0.22 μ m过滤器灭菌进一步去除细胞杂质，然后通过超滤杯蛋白截留系统20倍浓缩、筛选一定质量的蛋白体系，获得活细胞精华液产品。
[0054]实施例5活细胞精华液的应用
采用混合酶、分阶段分离脂肪干细胞，重复试验三次，每次三组，每组(5±0.5)g，ADSCs 得率分别为:(3.82 ± 0.5) X IO6 个 /g，(3.96 ± 0.4) X IO6 个 /g，(4.6 ± 0.7) X IO6 个/go ADSCs 得率 3000 ~5000 个 /mg。
[0055]不用条件培养基时，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为0.16g/ml。用上述实施例1的条件培养基培养I天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为0.4mg/ml ;用上述实施例1条件培养基培养3天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为1.06mg/ml ;用上述实施例1条件培养基培养7天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为1.3mg/ml。[0056]用上述实施例2的条件培养基培养I天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为
0.3mg/ml ;用上述实施例2条件培养基培养3天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为
1.02mg/ml ;用上述实施例2条件培养基培养7天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为1.2mg/ml。
[0057]用上述实施例3的条件培养基培养I天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为
0.32mg/ml ;用上述实施例3条件培养基培养3天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为
1.03mg/ml ;用上述实施例3条件培养基培养7天后，浓缩的分泌产物中蛋白质的浓度为
1.25mg/ml。
[0058]活细胞精华液含有大量细胞生长因子和胶原分子。主要产物包括EGF、FGF、VEGF、C0L11A1、C0L12A1、C0L16A1、C0L1A等大量与细胞生长代谢相关的生长因子和胶原蛋白。这些蛋白质分子对促进细胞生长和代谢很重要。图2中高通量细胞因子群阵列分析结果显示:如图2中所示，活细胞精华液含有大量细胞生长因子和胶原分子。
[0059]用活细胞精华液能够促进成纤维细胞和血管内皮细胞的分裂和扩增、增加细胞外基质的合成和分泌，因此能够促进组织再生，窦道变小；表皮细胞修复液还能够促进上皮细胞的分裂和增殖，因此能够促进表皮损伤的愈合。图3示表皮细胞修复液在烧伤中运用时，能够促进成纤维细胞的和血管内皮细胞的分裂和增殖，同样也能促进细胞外基质的合成和分泌，因此能够促进组织再生和伤口愈合；还能够促进毛囊、汗腺和伤口周围的上皮细胞分裂和增值，因此能够促进伤口处上皮层的形成。
[0060]活细胞精华液的美容效果是通过其所含生物活性物质增加胶原合成和刺激皮肤成纤维细胞生长来评估的。皮肤的弹性来自于皮肤真皮层成纤维细胞分泌的胶原构成了皮肤的支架。活细胞精华液可以通过皮肤成纤维细胞折叠层增加胶原产物的体积，同时成纤维细胞的体积也增加30%左右。因此，连续产生的自体胶原蛋白会使皮肤真皮层的厚度和密度增加，填充皱纹，消除伤疤，恢复皮肤的弹性和光泽。
[0061]活细胞精华液所包含的各种活性成分，特别是细胞生长因子类和胶原类能够促进羟脯氨酸的合成，促进胶原蛋白和胶原酶的合成，分泌胶原蛋白、透明质酸和糖蛋白，调节胶原纤维，因此具有保湿、增加皮肤弹性、减少皱纹和防止皮肤老化的作用。图4展示了本发明专利中上述的活细胞精华液减少皮 肤皱纹、防止皮肤老化的效果。它能够明显提高皮肤弹性使皮肤变得紧致，眼角和额头的皱纹变浅，皮肤光滑柔软，色斑变淡。
[0062]根据本发明专利中的技术，我们已经意识到用各种方法使用本发明专利用于当前的美容产品、医疗产品和药物，通过这些方法来获得各种所期望的美容产品、保健产品和药物，因此这里所描述的已前景不远。