专利名称：脂质体组合物及放射增敏剂的给药方法放射治疗已成为癌症治疗的常规部分。但是，放射治疗的一个缺点是在治疗的过程中破坏了肿瘤周围的正常、健康组织。另一个缺点是治疗停止后，肿瘤可能并且确实出现了复发。肿瘤复发部分是由于存在抗放射性的低氧的肿瘤细胞，增强放射量以破坏低氧的肿瘤组织经常是必需的。然而，为了保存正常的健康组织，又的确希望减少放射总量。显然，这两个因素是矛盾的。因此，使用某些使低氧的肿瘤细胞对放射优先敏感的药物和化学物质，即使用放射增敏剂。放射增敏剂是与放射联合给药时能提高放射的致死作用的化学药剂，有通过不止一种机理起作用的各种各样的放射增敏剂。能直接改变确定放射敏感性的大分子装置的一类放射增敏剂是卤化嘧啶类。卤化嘧啶类包括5-氯脱氧尿苷(CudR)，5-溴脱氧尿苷(BudR)和5-碘脱氧尿苷(IudR)。这些放射增敏剂混合到肿瘤细胞的DNA中代替胸腺嘧啶，使细胞更容易被放射灭活。在癌症的放射治疗中，通过选择性混入卤化嘧啶诱使放射敏感性增加的有用性受到若干因素的限制。首先，既然卤化嘧啶只在S期混合到细胞中，药物就必须存在足够长的时间，以使细胞通过至少一个DNA合成循环。尽管肿瘤细胞通常繁殖得比正常组织快，但某些肿瘤可能有从几天到几周的加倍时期这一事实使得治疗计划复杂化。其次，放射敏化的程度直接涉及到胸苷取代的程度。因此，仅长期输入游离形式的药物将使其混合最大化。第三，不仅敏化作用的程度是重要的，而且必须致敏的细胞总数也是重要的，以得到任何对肿瘤的显著疗效。第四，必须克服迅速的肝降解作用和脱卤作用。克服这些缺陷的一个途径是将卤化嘧啶包封在脂质体中。但是，这些尝试尚未完全令人满意，因为放射增敏剂容易迅速地从脂质体中泄漏，且脂质体在血清中的稳定性不好。发明概述因此，本发明的一个目的是提供用于放射疗法的放射增敏剂的组合物和给药方法。本发明的另一个目的是提供用单一的每周给药实现肿瘤的放射敏化的方法。本发明的又一个目的是提供一种组合物，它使放射增敏剂在肿瘤组织中的分布是其在正常、健康组织中的两倍。本发明一方面包括用于将放射增敏剂对肿瘤给药的方法。该方法包括制备脂质体，该脂质体由(i)成囊泡脂质；(ii)1-20摩尔百分数的用亲水性聚合物链衍生的成囊泡脂质，和(iii)1-15摩尔百分数的用与放射增敏剂相连的脂质部分衍生的放射增敏剂组成；和将该脂质体对肿瘤患者给药。
在一个实施方案中，放射增敏剂是5-碘-2’脱氧尿苷或5-溴-2’脱氧尿苷。
在另一个实施方案中，脂质部分是脂肪酸或饱和脂肪酸。在其他实施方案中，脂质部分选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸和木蜡酸。
在优选的实施方案中，放射增敏剂是5-碘-2’-脱氧尿苷，脂质部分是棕榈酸。
在本发明的另一个实施方案中，放射增敏剂是用第二脂质部分衍生的。例如，放射增敏剂是5-碘-2’-脱氧尿苷，脂质部分是棕榈酸。
在一个实施方案中，包括在脂质组合物中并衍生为脂质部分的亲水性聚合物链是聚乙二醇。
本发明在另一个方面包括制备包含放射增敏剂的脂质体组合物的方法，该方法是将(i)成囊泡脂质；(ii)1-20摩尔百分数的用亲水性聚合物链衍生的成囊泡脂质，和(iii)1-15摩尔百分数的用与放射增敏剂相连的脂质部分衍生的放射增敏剂混合在脂质溶剂中；和加入适量的第二溶剂，所选的第二溶剂(i)使脂质溶剂的量大于10重量百分数而小于约50重量百分数，和(ii)使脂质体的尺寸小于在另一种脂质溶剂量下得到的脂质体的尺寸，其中脂质溶剂和第二溶剂在所得的水合混合物中是可溶混的。
在一个实施方案中，脂质溶剂是醇，诸如甲醇、乙醇或丁醇。在一个实施方案中，第二溶剂是水。
本发明在另一个方面包括用于放射增敏剂给药的脂质体组合物。该组合物包括的脂质体由(i)成囊泡脂质；(ii)1-20摩尔百分数的用亲水性聚合物链衍生的成囊泡脂质，和(iii)1-15摩尔百分数的用与放射增敏剂相连的脂质部分衍生的放射增敏剂组成。该组合物通过下述方法形成(a)将组分(i)、(ii)和(iii)混合在脂质溶剂中；和(b)加入选定量的第二溶剂，所述选定量有效地(i)使脂质溶剂的量大于10重量百分数而小于约50重量百分数，和(ii)使脂质体的尺寸小于在除了所述选定量以外的脂质溶剂量下得到的脂质体的尺寸，所述脂质溶剂和所述第二溶剂在选定量的第二溶剂下是可溶混的。
阅读下面对本发明的详细描述并结合附图将更全面地理解本发明的这些以及其他目的和特征。
附图的简要描述

图1是用于合成3’，5’-二棕榈酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷的合成反应图；图2是在脂质体脂质水合过程中以脂质体大小(以nm计)作为乙醇重量百分数的函数而绘制的图；图3是脂质、溶剂、第二溶剂混合物的相图，显示了当溶剂为乙醇、第二溶剂为水时的优选操作区域；
图4显示了单独用放射治疗(#7，闭合三角)、用0.5ml(#1，闭合倒三角)或1ml(#3，闭合圆)包裹了dpIUdR的脂质体治疗、以及用与放射结合的不同剂量dpIUdR脂质体治疗(#2、4、5、6)的患纤维肉瘤肿瘤小鼠的肿瘤体积(以mm3计)；和图5A-5B显示了患肿瘤小鼠单独用放射治疗后(实心三角)或用包裹了dpIUdR的脂质体和放射联合治疗后(实心方块)的存活率(图5A)和肿瘤体积的变化百分数(图5B)。
发明详述I.定义本文中所用的“dpIUdR”是指3’，5’-二棕榈酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷。
本文中所用的“IUdR”是指5-碘-2’-脱氧尿苷。
II.脂质衍生的放射增敏剂如上所讨论，放射增敏剂是当用放射疗法治疗固体肿瘤时能混合到细胞DNA中并随后增强由电离放射引起的破坏的化合物。意图用于本发明的这样两种放射增敏剂是5-碘脱氧尿苷和5-溴脱氧尿苷。这些化合物以胸苷的类似物起作用，在细胞中经历磷酸化作用并最终混入到DNA中替代胸苷酸。
在本发明中，放射增敏剂是由用于混入到脂质体脂质双层中的脂质部分衍生的。适于混入到脂质体脂质双层中的脂质部分有许多，包括脂肪酸、单酰甘油、二酰甘油、脂肪醇、胆固醇和磷脂。这些脂质仅是例举性的，应当理解，当衍生为放射增敏剂时能使该放射增敏剂更亲脂的任何化合物都是合适的。在一个优选的实施方案中，放射增敏剂是用脂肪酸衍生的，其在优选实施方案中具有2-24个碳原子，更优选具有10-20个碳原子。合适的脂肪酸包括饱和脂肪酸，诸如月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)、花生酸(C20)、二十二烷酸(C22)、木蜡酸(C24)，和不饱和脂肪酸，诸如油酸(C18)。
脂质体领域内的技术人员将理解，脂质部分上的酰基尾部的长度是按照所需的与形成脂质体脂质双层的成囊泡脂质的相容性的程度来选择的。具有在成囊泡脂质上的酰基链长的1或2个碳原子内的酰基链长的脂质部分将产生更均匀的脂质双层，使衍生的放射增敏剂保持更持久。如果需要，这种特性可用于调节衍生的放射增敏剂从脂质双层的释放。
放射增敏剂可以用一个脂质部分衍生，或者在本发明的优选实施方案中，用两个脂质部分衍生。在有些情况下还可能有更多的脂质部分。放射增敏剂衍生的部位是可变的，条件是化合物从脂质衍生物中释放后必须保留了治疗活性，或者在保留脂质衍生物的情况下，当为衍生形式时治疗活性也保留了下来。
在为支持本发明而进行的研究中，5-碘-2’脱氧尿苷，在本文中称之为IUdR，是用16个碳原子的脂肪酸-棕榈酸在IUdR的核糖上的两个部位衍生的，如图1所示。在图中所显示并详细描述在实施例1中的反应方案中，IUdR与稍微过量的棕榈酰氯和4-二甲基吡啶催化剂在吡啶或在吡啶/氯仿溶剂中反应，得到3’，5’-二棕榈酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷，在本文中称之为dpIUdR。如下所述，将dpIUdR混合到脂质体中并测试其作为放射增敏剂的体内治疗功效。
III.脂质体组合物的制备方法本发明在一个方面包括适合用于给药脂质衍生的放射增敏剂的脂质体组合物的制备方法，用dpIUdR举例说明。脂质体治疗组合物的一个特性是药物/脂质比，药物/脂质比优选较高，以在达到治疗功效时尽可能给患者较低的脂质负担。脂质衍生化合物的制备提出了常规的非脂质衍生化合物没有遇到的制剂问题，因为化合物上的脂质尾部对脂质双层和总脂质含量有贡献。当总脂质含量升高时，利用常规技术、诸如通过聚碳酸酯膜挤压来定型脂质体变得困难，且限制了可能得到的药物/脂质比。
这一点用表1中列出的数据来阐述。按照实施例2描述的操作制备脂质体，其中，将脂质氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(mPEG-DSPE)和脂质衍生的dpIUdR以89/5/6、87.5/5/7.5和85/5/10的摩尔比溶于乙醇中。该乙醇-脂质溶液用含水第二溶剂水化，使最终的乙醇含量为10.1重量百分数。脂质体悬液通过聚碳酸酯圆片式膜挤出，以得到约100nm大小的目标脂质体。然后使用准弹性光散射测量每个悬液中的脂质体颗粒大小，结果显示在表1中。
如表1所示，用6和7.5摩尔百分数的dpIUdR制备的脂质体可以利用通过膜挤压的方法定型。但是，用10摩尔百分数的dpIUdR不可能得到大小约100nm的目标脂质体，因为在较高的脂质含量下，脂质体不再能容易地挤出。
表1
在较高负荷量的脂质衍生药物下脂质体的定型问题通过按照现在将要描述的方法来制备脂质体而克服。该方法提供了一种方式来实现高药物/脂质比，同时又保持得到所需脂质体大小的能力，该方法或者单独使用，或者与第二定型步骤诸如挤压结合使用。
在该方法中，将成囊泡脂质和脂质衍生化合物混合在脂质溶剂中。如本文所述，“脂质溶剂”指的是其中脂质体的脂质组分在任何温度下都可溶解的有机溶剂。例举性的脂质溶剂包括醇，诸如甲醇、乙醇、丁醇等，和低分子量多元醇，诸如甘油、丙二醇和乙二醇。将脂质以所需摩尔比加入到溶剂中并混合直至溶解，需要时加热。然后向该脂质溶剂/脂质混合物中加入适量的第二溶剂，以形成水合混合物。本文中所用的第二溶剂指的是可以某些比例与脂质溶剂溶混的溶剂，且必须在所得的水合混合物中是可与脂质溶剂溶混的。将第二溶剂加入到脂质溶剂混合物中，加入量应足以使脂质溶剂的重量百分数达到选定的一点，即脂质溶剂大于约10重量百分数但小于约50重量百分数，更优选使脂质溶剂的浓度在15-45重量百分数范围内，最优选使脂质溶剂的浓度在20-40重量百分数范围内，以得到具有所需大小的脂质体，正如现在将要说明的。
如实施例3中所述，将脂质HSPC、mPEG-DSPE和dpIUdR以89∶5∶6的摩尔比溶于乙醇。该脂质储备溶液用于通过用第二溶剂-含水缓冲剂水化适量的脂质溶液而制备脂质体悬液。一式三份制备最终的乙醇重量百分数为8.1、10.1、12.2、14.3、16.5、20.8、25.3和44.1的脂质体悬液。通过准弹性光散射测量每个样品中的脂质体平均大小，结果显示在表2中。
表2
从表2的最后一行可明显看出，在16.5重量百分数乙醇下脂质体的粒径最小。此数据用图显示在图2中，从中可明显看出，脂质体大小的沟槽开始于约10重量百分数，终止于约25重量百分数。诸如图2以脂质大小作为乙醇含量的函数而绘制的这样一种曲线可以用于确定得到特定脂质体大小所需的乙醇的量。例如，最小粒径106nm可以通过将脂质-乙醇混合物水化成16.5重量百分数乙醇而得到。根据该曲线，较大的粒径通过水化成或更多或更少的乙醇而得到。确定这样的曲线，以对于脂质和溶剂的任何混合物，确定要达到最小粒径或选定粒径的脂质溶剂的目标量，正如下面将进一步阐明的那样。
图3是显示用于形成本发明脂质体的操作区域的相图。在图中，阴影区与脂质体形成相对应，其中脂质溶剂的量在约10-50重量百分数之间，而脂质的重量百分数在0.1-15之间。根据脂质混合物和脂质溶剂，可以确定脂质体粒径在操作区域内达到最小的那一点。在操作区域内的脂质体悬液外观是澄清的，含有亚微米大小的脂质体。应当理解，按照脂质、溶剂和药物组分，操作区域会有轻微变化。本领域技术人员可容易地进行象实施例3和表2中列出的那样的研究，以确定能得到最小脂质体大小的脂质溶剂的量。
根据水合混合物中脂质溶剂的量，利用上述方法形成的脂质体可以是最小粒径的。因此，在有些情况下，不需要通过挤压或其他技术进一步定型脂质体。在有些情况下，可能需要对脂质体作进一步加工，例如通过挤压。制备方法对于将脂质衍生的药物以高药物/脂质比混合到脂质体中是特别有效的，但要得到药学上有用的90-150nm之间的粒径是困难的，因为如上所讨论的那样，无法挤出该混合物。按照本发明来制备脂质体就克服了这样的缺陷，因为脂质体在用第二溶剂水合后就达到或接近了所需粒径，任何进一步的定型操作被减到了最小。因此，可以采用较高的脂质衍生的药物负荷量，同时仍然能够达到所需的脂质体大小。
本发明的这一特性通过实施例4中描述的研究来阐述。脂质体使用脂质HSPC、mPEG-DSPE和dpIUdR制备，其中各制剂的摩尔量是89/5/6、85/5/10、80/5/15、70/5/25和55/5/40。将脂质、包括dpIUdR溶于乙醇，然后用足够的水进行水化，以使每个混合物中的乙醇浓度达到16.5重量百分数(20体积百分数)。每个脂质体悬液然后如实施例中所述进行挤压，挤压后，测量每个悬液中脂质体的平均粒径。结果显示在表3中。
表3
*组合物未能挤出当按照本发明的方法制备时，通过将脂质混合物水化至能产生最小粒径的适量脂质溶剂，含有6、10和15摩尔百分数dpIUdR的脂质体可容易地定型为约100nm。重要的是，脂质体以最小粒径形成，药物/脂质比在约1.5和5之间，更通常在约2-4之间。在本发明的一个优选实施方案中，具有所需粒径的脂质体使用该方法制备成药物/脂质比大于约4，如用含有15摩尔百分数dpIUdR的脂质体组合物得到的。
应当理解，许多脂质都适合用于本发明。为支持本发明而使用HSPC和mPEG-DSPE进行的研究只是说明性的，脂质体领域内的技术人员已知的任何成囊泡脂质都可加以考虑。
如本领域中公知，通过在PEG链的远端或在脂质体的外表面上包括靶向部分诸如抗体，也有可能提供含有被包裹的放射增敏剂的靶向脂质体组合物。
IV.组合物的给药方法将按照本发明制备的包括dpIUdR的脂质体对动物给药，以确定脂质体组合物作为放射增敏剂的效力。脂质体制剂由摩尔比为89∶5∶6的HSPC、mPEG-DSPE和dpIUdR组成。脂质体颗粒直径大约为100nm，dpIUdR药物前体通过将棕榈酸链插入到双层中而混合到脂质体脂质双层中。脂质体载体转运到肿瘤后，药物前体水解而将IUDP释放到肿瘤组织间隙中，在此，它可以进入细胞并混合到DNA中。
dpIUdR脂质体的放射增敏潜力用两种鼠肿瘤模型-RIF-1纤维肉瘤裸鼠模型和人头颈异种皮移植KB肿瘤裸鼠模型进行评估。在纤维肉瘤模型中，给动物接种肿瘤并且在肿瘤体积大于约100mm3后用于研究。患肿瘤动物按照表4中列出的若干方案之一进行治疗。
表4
1以放射治疗第1天计为第0天，显示为放射治疗第1天前(例如-1)或后(例如+2)的天数。
用表4中显示的方案1-8治疗的动物的结果显示在图4中。图中，在1-5天沿着X轴的箭头表示给予4Gy放射治疗的天数。数据表明，用含有dpIUdR的脂质体和放射疗法(方案1(闭合菱形)、方案4(开放正方形)、方案5(开放三角形)、方案6(开放倒三角形))进行治疗，与单独的放射治疗(闭合三角形)相比，肿瘤的生长比同期延迟了30％以上。数据进一步显示，在放射治疗前一天给药足以使dpIUdR到达肿瘤部位并混合到肿瘤细胞的DNA中，如在方案2中，0.5ml脂质体就在第一次放射治疗前一天给药、然后在研究的第2天给药，结果就证明了这点。
在KB肿瘤模型研究中，动物给药的同时开始放射治疗。将患肿瘤动物分成两个试验组，一组接受单独的放射治疗(9Gy，分三次)，另一组在第0天、例如进行放射治疗的这天时接受脂质体组合物。接受脂质体组合物的这组也分三次接受9Gy的放射治疗。
KB肿瘤模型研究的结果显示在图5A-5B中，其中图5A显示了患KB肿瘤小鼠的存活率，记录为未达到三次肿瘤体积加倍的肿瘤的百分数，其作为研究天数的函数。数据显示，当使用dpIUdR与放射结合时，治疗后三周存活的小鼠数比用单独的放射疗法治疗后存活的小鼠数多约35％。
图5B显示了测试小鼠肿瘤体积的变化百分数，结果表明，dpIUdR结合放射治疗显著延迟了肿瘤的生长。在第20天时，接受单独的放射治疗组的肿瘤生长比接受结合治疗的组的肿瘤生长高200％以上。
本发明的含有放射增敏剂的脂质体通过用于脂质体给药的任何一种已知方法对病人给药。该脂质体可以作为缓冲的水溶液通过静脉、腹膜、肌内、瘤内或皮下注射给药。任何药学上可接受的含水缓冲剂或其他载体都可使用，只要能保持脂质体的结构和活性。
对哺乳动物、包括人的给药剂量将根据肿瘤类型、肿瘤分期和病人的状况而变化。放射性核苷酸的剂量水平是充分确定的，并作为用于确定本发明脂质体组合物所需剂量的指标。在本发明的一个优选实施方案中，脂质体组合物在放射治疗前或治疗期间每周给药一次或两次。在本发明的另一个优选实施方案中，脂质体组合物可有效地达到在肿瘤组织中的分布是其在正常组织中分布的两倍。
V.实施例以下实施例说明了本发明的组合物和方法，且决不打算起任何限制作用。
材料从指示来源得到以下材料部分氢化的大豆磷脂酰胆碱(Vernon Walden Inc.，Green Village，NJ)；胆固醇(SolvayPharmaceuticals，The Netherlands)；乙醇(Quantum ChemicalCo.Tuscola，IL)和组氨酸(Seltzer Chemicals，Carlsbad，CA)。mPEG-DSPE按照文献中所述加以制备(例如，Zalipsky，S.等，生物共轭化学4296-299(1993))。
方法QUELS准弹性光散射使用Brookhaven Instruments ModelB1-200SM(Brookhaven Instruments Corporation，Holtsville，NY)进行。
实施例1合成3’，5’-二棕榈酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷将棕榈酰氯缓慢加入到脱氧尿苷的吡啶溶液或吡啶/氯仿溶液中，4-二甲基吡啶为催化剂。将该溶液混合至颜色变为黄色，然后将其放置过夜，使产生沉淀。将该混合物溶于氯仿并用10％柠檬酸水溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。除去氯仿，加入甲醇，得到白色沉淀，鉴定为3’，5’-二棕榈酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷(66％收率)。合成反应方案显示在图1中。
实施例2常规脂质体制备将摩尔比为89/5/6、87.5/5/7.5和85/5/10的脂质氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和用甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPE-mPEG)和dpIUdR各自在70℃下溶于乙醇，直至达到完全溶解(大约1小时)。该脂质混合物在70℃下用足够的10％蔗糖溶液水化，以使乙醇重量百分数达到10.1(12.5％v/v百分数)。该混合物搅拌1小时，以形成脂质体悬液。
该脂质体悬液通过聚碳酸酯膜挤出，以达到100nm均匀尺寸。该悬液然后针对10％蔗糖溶液渗滤，以使乙醇浓度降低到400ppm以下。然后该悬液进行超滤至高于目标药物浓度，测定药物浓度并通过加入10mM组氨酸缓冲剂稀释至目标浓度，并将pH调节至6.5。每个制剂的脂质体大小通过准弹性光散射确定，粒径作为dpIUdR重量百分数的函数显示在表1中。
实施例3按照本发明方法的脂质体制备将摩尔比为89/5/6的脂质氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和用甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPE-mPEG)和dpIUdR在70℃下溶于乙醇，直至达到完全溶解(大约1小时)。该脂质储备溶液根据需要稀释到维持固定脂质浓度后，在70℃下用10％蔗糖溶液水化到8-44重量百分数的不同乙醇浓度。每个脂质体混合物搅拌1小时，以形成脂质体悬液。使用准弹性光散射确定每个混合物的脂质体粒径，结果显示在表2中。
实施例4在16.5重量百分数的脂质溶剂下制备脂质体将摩尔比为89/5/6、85/5/10、80/5/15、70/5/25和55/5/40的脂质氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和用甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPE-mPEG)和dpIUdR在70℃下溶于乙醇，直至达到完全溶解(大约1小时)。该脂质混合物在70℃下用足够的10％蔗糖溶液水化，以使水合混合物中的乙醇重量百分数含量达到16.5(20％v/v乙醇)。在按照实施例2中描述的操作挤出混合物之前，将该混合物搅拌1小时，并通过准弹性光散射测量脂质体的粒径。结果显示在表3中。
尽管本发明已用具体实施方案进行了描述，但很明显，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的情况下可以进行各种变化和改进。


本发明公开了对受治疗者体内的肿瘤部位给药放射增敏剂的方法。该方法包括制备由成囊泡脂质和脂质衍生的放射增敏剂组成的脂质体。在一个实施方案中,放射增敏剂是二棕榈酰基－5－碘－2’－脱氧尿苷。还公开了包括脂质衍生的放射增敏剂的脂质体组合物的制备方法。