专利名称：作为新的组蛋白脱乙酰酶抑制剂的杂环烷基衍生物的制作方法：本发明涉及式(I)化合物、其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式 其中 R1为羟基或式(a-1)基团 其中 R2为羟基或氨基； R3为氢、噻吩基、呋喃基或苯基，且噻吩基、呋喃基或苯基各自可任选被1或2个以下基团取代卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷氧基、苯基C1-6烷氧基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基、多卤代C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羟基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、异噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基； R4、R5和R6各自独立为氢、氨基、硝基、呋喃基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R7； 其中R7为氢、C1-6烷基、羟基、氨基或C1-6烷氧基； X 为N或CH； Y 为O、N、NH、CH或CH2，且当Y为N或CH时，则取代基与环结构的Y原子连接； T 为O或NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基氨基羰基或一-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基； n 为0或1，且当n为0时，则为直键； m 为1或2； p 为0或1，条件是当p为0时，则n为0，-(CH2)n-(T)p-为直键，且Y为N； A 为选自以下的基团 其中R9为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基或C3-7环烷基C1-6烷基； 且R10为氢、羟基、氨基、卤素、氰基、C1-6烷基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或一-或二(C1-6烷基)氨基。 从取代基引入双环环系统中的线表示该键可与双环环系统的任何合适的环原子连接。 术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”或“组蛋白脱乙酰酶的抑制剂”用于代表能够与组蛋白脱乙酰酶相互作用并抑制其活性，更尤其其酶活性的化合物。抑制组蛋白脱乙酰酶酶活性表示减少组蛋白脱乙酰酶除去组蛋白的乙酰基的能力。优选，这种抑制为特异性抑制，即组蛋白脱乙酰酶抑制剂在低于产生某些其它无关生物作用所需抑制剂浓度的浓度下，减少组蛋白脱乙酰酶除去组蛋白的乙酰基的能力。 当在前述定义和下文中使用时，卤素为氟、氯、溴和碘的通称；C1-2烷基定义为具有1或2个碳原子的直链饱和烃基，例如甲基或乙基；C1-6烷基定义为C1-2烷基和具有3-6个碳原子的直链和支链饱和烃基，例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、己基、2-甲基戊基等；多卤代C1-6烷基定义为含3个相同或不同卤素取代基的C1-6烷基，例如三氟甲基；C2-6烯基定义为含一个双键并具有2-6个碳原子的直链和支链烃基，例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C3-6炔基定义为含一个三键和具有3-6个碳原子的直链和支链烃基，例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；C3-7环烷基包括具有3-7个碳的环烃基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基等。 药学上可接受的加成盐包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。上文中所述药学上可接受的酸加成盐将包括式(I)化合物能够形成的治疗活性的无毒酸加成盐形式。可通过用适当的酸处理所述碱形式，将具有碱性的式(I)化合物转化为它们的药学上可接受的酸加成盐。适当的酸包括例如无机酸例如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸和类似的酸；或有机酸例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基-水杨酸、扑姆酸和类似的酸。 可通过用合适的有机碱或无机碱处理所述酸形式，将具有酸性的式(I)化合物转化为它们的药学上可接受的碱加成盐。适当的碱式盐形式包括例如铵盐；碱金属和碱土金属盐例如锂、钠、钾、镁、钙盐等；有机碱的盐例如苄星青霉素、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺青霉素(hydrabamine)盐；和氨基酸的盐例如精氨酸、赖氨酸盐等。
术语“酸或碱加成盐”还包括式(I)化合物可形成的水合物和溶剂加合物形式。此类形式的实例是例如水合物、醇化物等。
本文中使用的术语“式(I)化合物的立体化学异构形式”定义为式(I)化合物可具有的由相同原子通过相同连接顺序连接但具有不可互变的不同三维结构组成的所有可能的化合物。除另外提及或说明外，化合物的化学名包括所述化合物可具有的所有可能的立体化学异构体的混合物。所述混合物可含所述化合物的基本分子结构的所有非对映体和/或对映体。式(I)化合物的所有纯形式的立体化学异构体或其彼此的混合物将包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式包括其中一个或几个氮原子氧化为所谓的N-氧化物的那些式(I)化合物，尤其其中哌啶-、哌嗪或哒嗪基-氮中一个或多个是N-氧化的那些N-氧化物。
某些式(I)化合物还可存在互变异构形式。尽管未明确在上式中表明，但此类形式包括在本发明范围内。
当在下文中使用时，术语“式(I)化合物”还包括药学上可接受的加成盐和所有立体异构形式。
本文中使用的术语“组蛋白脱乙酰酶”和＂HDAC＂是指从组蛋白的N末端上赖氨酸残基的ε-氨基上除去乙酰基的酶家族中任一种酶。除上下文中另有说明外，术语“组蛋白”是指包括任何种属的H1、H2A、H2B、H3、H4和H5的任何组蛋白。人HDAC蛋白或基因产物包括但不限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。组蛋白脱乙酰酶也可源自原虫或真菌源。
第1组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中R1为羟基。
第2组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中R3不为氢。
第3组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢； b)X为N或CH； c)Y为O、N或CH； d)T为O或NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基； e)n为0或1； f)m为1； g)p为0或1；和 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第4组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢，R4、R5和R6各自为氢； b)X为N或CH； c)Y为O、N或CH； d)T为NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基； e)n为1； f)m为1； g)p为1；和 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第5组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢； b)X为N或CH； c)Y为O、N或CH； d)T为NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基； e)n为1； f)m为1； g)p为1；和 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第6组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基； b)X为N； c)Y为O、N或CH； d)T为O； e)n为1； f)m为1； g)p为1；和 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第7组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢； b)X为CH； c)Y为N； d)n为0； e)m为1； g)p为0；和 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
一组优选的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基； b)X为N； c)Y为CH； d)T为NR8，其中R8为氢； e)n为1； f)m为1； g)p为1；且 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
一组更优选的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件 a)R1为羟基； b)X为N； c)Y为CH； d)T为NR8，其中R8为氢； e)n为1； f)m为1； g)p为1；且 h)A为选自以下的基团(b-1)、(b-3)和(b-4)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
尤其优选的式(I)化合物是以下所示1号化合物、2号化合物和3号化合物
可按常规方法制备式(I)化合物及其药学上可接受的盐和N-氧化物和立体化学异构形式。原料和某些中间体是已知化合物，它们是市售化合物或可按照本领域中通常已知的常规反应方法或专利申请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述方法制备。
在下文中将更详细地阐述某些制备方法。在实施例中阐述得到最终式(I)化合物的其它方法。制备式(I)化合物的具体方法阐述如下 a)可通过使式(II-a)中间体与适当的酸例如三氟乙酸反应，制备本文中称为式(I-a)化合物的式(I)异羟肟酸，其中R1为羟基。在适当的溶剂例如甲醇或二氯甲烷中，进行所述反应。

b)可在碱例如三乙胺和苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷-1-基-磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)的存在下，通过使其中M代表氢或碱金属例如钠或锂的式(IV)中间体与式(III)化合物反应，制备本文中称为式(I-b)化合物的式(I)化合物，其中R1为式(a-1)基团。在适当溶剂例如四氢呋喃或二氯甲烷或其混合物中，进行所述反应。

或者，可通过在合适的溶剂例如二氯甲烷中例如用磺酰氯(SOCl2)处理，将式(IV)化合物转化为酰氯，然后在碱例如吡啶的存在下，在合适的溶剂例如二氯甲烷或THF中，使得到的酰氯化合物与式(III)化合物反应，制备式(I-b)化合物。
也可通过使式(II-b)中间体与适当的酸例如三氟乙酸反应，制备本文中称为式(I-b1)化合物的式(I-b)化合物，其中R2为氨基。在适当的溶剂例如甲醇或二氯甲烷中，进行所述反应。

可通过使式(II-c)中间体在适当的溶剂例如四氢呋喃中与氟化四丁铵反应，制备本文中称为式(I-b2)化合物的式(I-b)化合物，其中R2为羟基。在式(II-c)中间体中，TBDMS表示叔丁基(二甲基)硅烷基。

也可通过已知技术反应，或根据分子中其它基团敏感性进行官能团转化，使式(I)化合物相互转化，例如将羧酸酯水解为相应的羧酸或醇；可将醇转化为酯和醚；可将伯胺转化为仲胺或叔胺；可将伯胺或仲胺转化为酰胺或磺酰胺；可通过在合适的钯催化剂的存在下插入一氧化碳，将苯基上的碘基转化为酯基。
可在适当的试剂例如N’-(乙基羰基咪唑基(carbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一盐酸盐(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)的存在下，通过使其中M代表氢或碱金属阳离子例如钠的式(IV)中间体与式(V)中间体反应，制备式(II-a)中间体。可在碱例如三乙胺的存在下，在合适的溶剂例如二氯甲烷和四氢呋喃的混合物中，进行该反应。

可在苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)和氢化钠的存在下，通过使其中M为氢的本文中称为式(IV-b)中间体的式(IV)中间体与适当的叔丁氧基羰基(Boc)保护的式(III-b)苯胺反应，制备式(II-b)中间体。可在合适的溶剂例如吡啶中，进行所述反应。

可在苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)和三乙胺的存在下，通过使式(IV-b)中间体与适当叔丁基(二甲基)硅烷基(TBDMS)保护的式(III-c)苯胺反应，制备式(II-c)中间体。在合适的溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺中，进行所述反应。

也可在适当的试剂例如硼氢化钠的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷或甲醇中，通过使式(VI)中间体与适当的其中m为0或1的式(VII)醛反应，制备本文中称为式(II-a1)中间体的式(II-a)中间体，其中p为1，T为NR8。或者，可在酸性条件下例如用乙酸，在合适的溶剂例如甲醇中用NaBH3CN；或在氢化条件下，在合适的溶剂例如甲醇中用钯-碳催化剂，完成该反应。

可在合适的溶剂例如乙醇或四氢呋喃和水的混合物中，通常在回流下，通过使式(VIII)中间体与适当的酸性溶液例如盐酸或适当的碱金属碱例如氢氧化钠或氢氧化锂反应，制备式(IV)中间体。

可通过使相应的其中R8为氢的式(II-a)或(VIII)化合物与适当的用于引入适当的R8基团的官能化试剂反应，制备式(II-a)和(VIII)中间体，其中p为1，T为NR8，其中R8同以上定义不为氢。例如，当R8为C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基C1-6烷氧基C1-6烷基或羟基氨基羰基C1-6烷基时，则试剂是适当的烷化剂例如适当的烷基卤例如烷基氯，在合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中，在碱性条件下例如用三乙胺完成反应。当R8为C1-6烷基羰基或C1-6烷基氨基羰基时，则试剂是适当的酰化剂例如适当的酰卤例如酰氯，在合适的溶剂例如二氯甲烷中，在碱性条件下例如用三乙胺完成反应。当R8为C1-6烷基磺酰基或一-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基时，则试剂是适当的磺酰化试剂例如适当的磺酰卤例如磺酰氯，在常规条件下完成反应。
可通过在适当的试剂例如硼氢化钠的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷或甲醇中，使式(IX)中间体与以上式(VII)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-a)中间体的式(VIII)中间体，其中p为1，T为NR8。或者，可在酸性条件下例如用乙酸，在合适的溶剂例如甲醇中用NaBH3CN，或在氢化条件下在合适的溶剂例如甲醇中用钯-碳催化剂，完成该反应。

或者，可通过在碱例如K2CO3的存在下，在合适的溶剂例如乙腈中，使式(IX)中间体与其中L代表离去基团例如甲磺酰基的式(X)中间体反应，制备式(VIII-a)中间体。

可在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)和二甲基乙酰胺或在K2CO3和乙腈中，通过使其中L1为离去基团例如卤素例如氯的式(XI)中间体与式(XII)中间体反应，制备式(IX)中间体。

可按照以下流程制备本文中称为式(X-a)中间体的式(X)中间体，其中L为有机磺酰氧基RSO2O，m为1
阶段(a)在合适的溶剂例如乙醇中，使式(XIII)中间体与氯化剂例如磺酰氯反应，形成式(XIV)中间体； 阶段(b)在合适的溶剂例如四氢呋喃中，将式(XIV)中间体例如用氢化锂铝还原，形成式(XV)中间体； 阶段(c)在碱性条件下例如用三乙胺，在合适的溶剂例如二氯甲烷中，使式(XV)中间体与适当的磺酰化试剂例如氯化物例如甲磺酰氯反应。
可通过在合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中，使式(XVI)中间体与其中L2为离去基团例如卤素例如溴的式(XVII)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-b)中间体的式(VIII)中间体，其中p为1，T为O。

可在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)和二氯甲烷中，通过使其中L3为离去基团例如卤素例如氯的式(XVIII)中间体与式(XIX)化合物反应，制备式(XVI)中间体。

可通过在NaBH(OAc)3的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷中，使式(XX)中间体与其中m1为0或1的式(XXI)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-c)中间体的式(VIII)中间体，其中Y为N，p为0。

本发明还涉及统称为式(B)化合物的式(IIa)、(IV)和(VIII)中间体及其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中Q为C1-2烷氧基羰基、MO2C(其中M为氢或碱金属)或四氢吡喃氧基氨基羰基，n、m、p、X、Y、T和A同式(I)中定义。

可按照式(I)化合物定义的基团，定义以上中间体的目的化合物、优选的化合物、更优选的和最优选的化合物的基团。
式(I)化合物和某些中间体可在其结构中具有至少一个手性(stereogenic)中心。该手性中心可存在于R或S构型。
按上文所述方法制备的式(I)化合物通常为对映体的外消旋混合物，可按照已知技术拆分方法，将它们彼此分离。可通过与合适的手性酸反应，将外消旋式(I)化合物转化为相应的非对映体盐形式。然后例如通过选择性或分级结晶，将所述非对映体盐形式分离，对映体通过碱从中释放。分离式(I)化合物的对映体形式的备选方法涉及使用手性固定相的液相色谱。如果反应是立体有择的发生，则所述纯立体化学异构形式也可由适当原料的相应纯立体化学异构形式衍生。优选，如果需要特定立体异构体，应通过立体有择制备方法合成所述化合物。这些方法最好使用对映体纯原料。
式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式的有价值的药理性质在于它们具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制作用。
本发明提供通过给予有效量的本发明化合物抑制包括转化细胞的细胞异常生长的方法。细胞异常生长是指独立于正常调节机制的细胞生长(例如丧失接触抑制)。这包括通过引起癌细胞生长停滞、终末分化和/或凋亡直接抑制肿瘤生长，和通过抑制肿瘤新血管形成而间接抑制肿瘤生长。
本发明还提供通过给予需要这种治疗的患者例如哺乳动物(更尤其是人)有效量的本发明化合物，抑制肿瘤生长的方法。尤其是，本发明提供通过给予有效量的本发明化合物抑制肿瘤生长的方法。可抑制的肿瘤的实例是但不限于肺癌(例如腺癌和包括非小细胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌例如外分泌胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、包括晚期疾病的前列腺癌、淋巴系统的造血器官瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间充质源的肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
本发明化合物可用于其它治疗目的，例如 a)在为治疗癌症给予肿瘤放射前、期间或之后，通过给予本发明化合物使肿瘤对放疗敏化； b)治疗关节病和骨病例如类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年关节炎、痛风、多关节炎、银屑病性关节炎、关节强硬性脊椎炎和系统性红斑狼疮； c)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖性疾病、动脉粥样硬化和再狭窄； d)治疗炎性病症和皮肤病，例如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、过敏性鼻炎、移植物抗宿主疾病、结膜炎、哮喘、ARDS、贝赫切特症、移植排斥、荨麻疹(uticaria)、过敏性皮炎、脱发(alopecia areata)、硬皮病、疹病、湿疹、皮肌炎、痤疮、糖尿病、系统性红斑狼疮、川崎病、多发性硬化、肺气肿、囊性纤维化和慢性支气管炎； e)治疗子宫内膜异位、子宫纤维瘤、功能不良性子宫出血和子宫内膜增生； f)治疗包括影响视网膜和脉络膜血管的血管病变的眼血管化； g)治疗心功能障碍； h)抑制免疫抑制性疾病，例如治疗HIV感染； i)治疗肾功能障碍； j)抑制内分泌障碍； k)抑制糖原异生功能障碍； l)治疗神经病例如帕金森病或导致认知障碍的神经病，例如早老性痴呆或聚谷氨酰胺有关的神经元疾病； m)治疗精神病例如精神分裂症、双相性精神障碍、抑郁症、焦虑症和精神病； n)抑制神经肌肉病例如肌萎缩性侧索硬化； o)治疗脊髓性肌萎缩； p)治疗对通过增强基因表达的治疗响应的其它病症； q)强化基因疗法； r)抑制脂肪形成； s)治疗寄生虫病例如疟疾。
因此，本发明公开了用作药物的式(I)化合物和这些式(I)化合物在制备治疗一种或多种前述病症的药物中的用途。
式(I)化合物及其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式的有价值的诊断性质在于可用它们检测或鉴别生物样品中的HDAC，包括检测或测量由标记化合物和HDAC之间的复合物形成。
检测或鉴别方法可使用用标记剂标记的化合物，这些标记剂是例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括125I、131I、3H和14C。通常通过与适当的底物缀合，将酶制成可测酶，而该缀合物又催化可测反应。其实例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酯酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化物酶。发光物质包括例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶。
生物样品可定义为体组织或体液。体液的实例是脑脊液、血液、血浆、血清、尿、痰、唾液等。
鉴于它们的有用的药理性质，可将主题化合物配制成用于给药目的的各种药物形式。
为制备本发明药用组合物，使有效量的作为活性成分的碱或酸加成盐形式的特定化合物与药学上可接受的载体充分混合来组合，该载体可采取各种形式，取决于给药所需制剂形式。需要这些药用组合物为单位剂量形式，优选该形式适合口服、直肠、经皮或肠胃外注射给药。例如在制备口服剂型组合物时，在口服液体制剂例如混悬剂、糖浆、酏剂和溶液剂的情况中，可使用任何常用药物介质例如水、二醇、油、醇等；或在散剂、丸剂、胶囊剂和片剂的情况中，可使用固体载体例如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
因为它们便于给药，所以片剂和胶囊剂代表最佳口服剂量单位形式，在该情况中，显然使用固体药物载体。对于肠胃外组合物，载体通含包括无菌水，尽管例如可包括助溶的其它成分，但至少大部分为无菌水。例如可制备注射液，其中载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可制备注射混悬液，在该情况中可使用适当的液体载体、悬浮剂等。在适合经皮给药的组合物中，载体任选包括促渗剂和/或合适的湿润剂，任选以较小比例与合适的任何性质的添加剂组合，这些添加剂对皮肤不产生明显损害作用。所述添加剂可促进给予皮肤和/或可帮助制备需要的组合物。可按各种方式例如透皮贴剂、喷滴剂(spot-on)或乳膏给予这些组合物。
按便于给药和剂量均匀的剂量单位形式配制前述药用组合物尤其最好。用于本说明书和权利要求的剂量单位形式是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，每单位含经计算可产生需要的疗效的预定量的活性成分和组合应用的需要的药物载体。此类剂量单位形式的实例是片剂(包括刻痕片或包衣片)、胶囊剂、丸剂、袋装散剂、糯米纸囊剂、注射溶液或混悬液、茶匙剂、汤匙剂等及其分离的倍数。
本领域技术人员可容易地由下文中提供的试验结果确定有效量。一般而言，预计治疗有效量将为0.005mg/kg-100mg/kg体重，尤其是0.005mg/kg-10mg/kg体重。可以认识到，在一天中适当时间间隔内，按2、3、4或更多个分剂量给予需要的剂量。可将所述分剂量配制为单位剂量形式，例如每单位剂量形式含0.5-500mg，尤其10mg-500mg活性成分。
作为本发明的另一方面，预计HDAC抑制剂与另一种抗癌药物的组合尤其可用作药物，更尤其用于治疗癌症或相关疾病。
为治疗以上病症，本发明化合物最好可与一种或多种其他药物联合使用，更尤其与其它抗癌药物联合使用。抗癌药物的实例是 -铂配位化合物例如顺铂、卡铂或奥沙利铂(oxalyplatin)； -紫杉烷化合物例如紫杉醇或多西他赛； -拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱化合物，例如伊立替康或托泊替康； -拓扑异构酶II抑制剂例如抗肿瘤鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷； -抗肿瘤长春花生物碱例如长春碱、长春新碱或长春瑞滨； -抗肿瘤核苷衍生物例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨或卡培他滨； -烷化剂例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司汀； -抗肿瘤蒽环衍生物例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星或米托蒽醌； -HER2抗体例如曲妥单抗； -雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟维司群(faslodex)或雷洛昔芬； -芳香酶抑制剂例如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑和伏氯唑； -分化剂例如类维生素A、维生素D和视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)，例如异维A酸(accutane)； -DNA甲基转移酶抑制剂，例如5-氮杂胞苷； -激酶抑制剂，例如flavoperidol、甲磺酸伊马替尼或吉非替尼(gefitinib)； -法尼基转移酶抑制剂； -其它HDAC抑制剂； -遍在蛋白-蛋白酶体途径抑制剂例如万珂(Velcade)；或 -Yondelis。
本文中使用的术语“铂配位化合物”表示抑制任何肿瘤细胞生长的铂配位化合物，该化合物提供离子形式的铂。
术语“紫杉烷化合物”代表具有紫杉烷环系统并与某些种红豆杉(红豆杉属)树的提取物有关或源自该提取物的一类化合物。
术语“拓扑异构酶抑制剂”用于表示在真核细胞中可改变DNA拓扑结构的酶。它们对重要的细胞功能和细胞增殖至关重要。在真核细胞中有两类拓扑异构酶，即I型和II型。拓扑异构酶I是约100,000分子量的单体酶。该酶与DNA结合，引起瞬时单链断裂，使双螺旋解旋(或让其解旋)，然后在DNA链解离前，将断裂重封。拓扑异构酶II具有相似的作用机制，该机制涉及诱导DNA链断裂或形成自由基。
术语“喜树碱化合物”用于表示与母体喜树碱化合物有关或从母体喜树碱化合物衍生的化合物，母体喜树碱是源自中国喜树(Camptothecin acuminata)和印度臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)的水不溶性生物碱。
术语“鬼臼毒素化合物”用于表示与母体鬼臼毒素有关或从它衍生的化合物，鬼臼毒素是从曼德拉草植物中提取的化合物。
术语“抗肿瘤长春花生物碱”用于表示与长春花属植物(Vincarosea)的提取物有关或从它衍生的化合物。
术语“烷化剂”包括具有共同特征的多组化合物，该特征在于在生理条件下它们具有向生物上必需的大分子例如DNA提供烷基的能力。在多数更重要的药物例如氮芥和亚硝基脲中，经过复杂的降解反应后，在体内产生活性烷基化部分，其中某些反应是酶促反应。烷化剂的最重要的药理作用是干扰涉及细胞增殖尤其DNA合成和细胞分裂的基本机制。烷化剂在快速增殖的组织中干扰DNA功能和完整性的能力为其治疗应用及其多种毒性性质提供基础。
术语“抗肿瘤蒽环衍生物”包括从真菌(Strep.peuticus var.caesius)得到的抗生素及其衍生物，其特征在于具有通过糖苷键与非普通糖氨基糖柔胺(daunosamine)连接的四环素环结构。
己证实人表皮生长因子受体2蛋白(HER 2)在原发性乳腺癌中扩增与某些患者临床预后差有关。曲妥单抗是高度纯化的重组DNA衍生的人源化单克隆IgG1 κ抗体，该抗体与HER2受体的细胞外域以高亲和力和特异性结合。
许多乳腺癌具有雌激素受体，这些肿瘤的生长可通过雌激素刺激。术语“雌激素受体拮抗剂”和“选择性雌激素受体调节剂”用于表示雌二醇与雌激素受体(ER)结合的竞争性抑制剂。当与ER结合时，选择性雌激素受体调节剂引起受体的三维形状的改变，调节其与DNA上的雌激素效应元件(ERE)结合。
在绝经后妇女中，循环雌激素的主要来源是通过周围组织中芳香酶将肾上腺和卵巢雄激素(雌烯二酮和睾酮)转化为雌激素(雌酮和雌二醇)。通过芳香酶抑制或失活的雌激素剥夺可有效和选择性治疗某些患依赖激素的乳腺癌的绝经后患者。
本文中使用的术语“抗雌激素药物”不仅包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括上述芳香酶抑制剂。
术语“分化剂”包括可以各种方式抑制细胞增殖和诱导分化的化合物。已知维生物D和类维生素A在调节多种正常和恶性细胞类型的生长和分化中起主要作用。视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)通过抑制细胞色素P450-介导的视黄酸分解代谢，增加内源性视黄酸水平。
DNA甲基化改变在人瘤形成中是最常见的异常。选择的基因的启动子中高甲基化通常与涉及的基因失活有关。术语“DNA甲基转移酶抑制剂”用于表示通过药理抑制DNA甲基转移酶和再激活肿瘤抑制基因表达起作用的化合物。
术语“激酶抑制剂”包括涉及细胞周期进展和程序性细胞死亡(凋亡)的激酶活性抑制剂。
术语“法尼基转移酶抑制剂”用于表示设计成阻止Ras和其它细胞内蛋白的法尼基化的化合物。已证实它们对恶性细胞增殖和存活有作用。
术语“其它HDAC抑制剂”包括但不限于 -羧酸酯(盐)例如丁酸酯(盐)、肉桂酸、4-苯基丁酸酯(盐)或丙戊酸； -异羟肟酸例如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、含哌嗪的SAHA类似物、联芳异羟肟酸酯A-161906及其咔唑基(carbozolyl)醚-、四氢吡啶-和四氢萘酮-类似物、双环芳基-N-羟基甲酰胺、pyroxamide、CG-1521、PXD-101、磺酰胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、与scriptaid有关的三环分子、间羧基肉桂酸双异羟肟酸(CBHA)、CBHA样异羟肟酸、trapoxin-异羟肟酸类似物、CRA-024781、R306465和有关的苯甲酰基-和杂芳基-异羟肟酸、氨基辛二酸酯(盐)和丙二酰胺(malonyldiamide)； -环四肽例如trapoxin、apidicin、缩肽、与spiruchostatin有关的化合物、RedFK-228、含巯基的环四肽(SCOPs)、含异羟肟酸的环四肽(CHAPs)、TAN-174s和azumamides； -苯甲酰胺类例如MS-275或CI-994，或 -depudecin。
术语“遍在蛋白-蛋白酶体途径抑制剂”用于鉴定在包括细胞周期调节蛋白的蛋白酶体中抑制细胞蛋白靶向破坏的化合物。
对于癌症治疗，本发明化合物可和辐射联合给予上述患者。辐射表示电离辐射且尤其γ辐射，尤其通过直线加速器或目前常用的放射性核素发射的辐射。通过放射性核素辐射肿瘤可以是外部或内部。
本发明还涉及抗癌药和本发明HDAC抑制剂的本发明联合药物。
本发明还涉及用于医疗例如用于抑制肿瘤细胞生长的本发明联合药物。
本发明还涉及抑制肿瘤细胞生长的本发明联合药物。
本发明还涉及抑制人患者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明联合药物。
本发明还提供通过给予有效量的本发明联合药物，抑制包括转化细胞的细胞异常生长的方法。
可同时(例如用分开的或单一组合物)，或按任何顺序序贯给予其它药物和HDAC抑制剂。在后一情况中，按足以确保达到有利或协同作用的量和方式，在一定时间内给予两种化合物。可以认识到，对于联合药物中各成分来讲，优选的给药方法和顺序以及各自的剂量和方案应取决于给予的具体其它药物和HDAC抑制剂、它们的给药途径、所治疗的具体肿瘤和所治疗的具体宿主。本领域技术人员可用常规方法和参考本文中所述信息，容易地确定最佳给药方法和顺序以及剂量和方案。
最好按1-500mg/米2(mg/m2)体表面积例如50-400mg/m2剂量给予铂配位化合物，尤其是每疗程按约75mg/m2剂量给予顺铂，按约300mg/m2给予卡铂。
最好按50-400mg/米2(mg/m2)体表面积例如75-250mg/m2剂量给予紫杉烷化合物，尤其是每疗程按约175-250mg/m2剂量给予紫杉醇，按约75-150mg/m2给予多西他赛。
最好按0.1-400mg/米2(mg/m2)体表面积例如1-300mg/m2剂量给予喜树碱化合物，尤其是每疗程按约100-350mg/m2剂量给予伊立替康，按约1-2mg/m2给予托泊替康。
最好按30-300mg/米2(mg/m2)体表面积例如50-250mg/m2剂量给予抗肿瘤鬼臼毒素衍生物，尤其是每疗程按约35-100mg/m2剂量给予依托泊苷，按约50-250mg/m2给予替尼泊苷。
最好按2-30mg/米2(mg/m2)体表面积剂量给予抗肿瘤长春花生物碱，尤其是每疗程按约3-12mg/m2剂量给予长春碱，按约1-2mg/m2剂量给予长春新碱，按约10-30mg/m2剂量给予长春瑞滨。
最好按200-2500mg/米2(mg/m2)体表面积例如700-1500mg/m2剂量给予抗肿瘤核苷衍生物，尤其是每疗程按200-500mg/m2剂量给予5-FU，按约800-1200mg/m2剂量给予吉西他滨，按约1000-2500mg/m2给予卡培他滨。
最好按100-500mg/米2(mg/m2)体表面积例如120-200mg/m2剂量给予烷化剂例如氮芥或亚硝基脲，尤其是每疗程按约100-500mg/m2剂量给予环磷酰胺，按约0.1-0.2mg/kg剂量给予苯丁酸氮芥，按约150-200mg/m2剂量给予卡莫司汀，按约100-150mg/m2剂量给予洛莫司汀。
最好按10-75mg/米2(mg/m2)体表面积例如15-60mg/m2剂量给予抗肿瘤蒽环衍生物，尤其是每疗程按约40-75mg/m2剂量给予多柔比星，按约25-45mg/m2剂量给予柔红霉素，按约10-15mg/m2剂量给予伊达比星。
最好每疗程按1-5mg/米2(mg/m2)体表面积剂量，尤其是按2-4mg/m2给予曲妥单抗。
最好根据具体药物和所治疗的疾病，按约1-100mg/日剂量给予抗雌激素药。最好按5-50mg，优选10-20mg剂量，每日两次通过口服给予他莫昔芬，该疗法持续足以达到和维持疗效的时间。最好按约60mg剂量，每日一次通过口服给予托瑞米芬，该疗法持续足以达到和维持疗效的时间。最好按约1mg剂量，每日一次通过口服给予阿那曲唑。最好按约20-100mg剂量，每日一次通过口服给予屈洛昔芬。最好按约60mg剂量，每日一次通过口服给予雷洛昔芬。最好按约25mg剂量，每日一次通过口服给予依西美坦。
可按例如每疗程一次、两次或多次给予这些剂量，该疗程可以例如每隔7、14、21或28天重复进行。
鉴于它们的有用的药理性质，可将本发明联合药物中的成分即其它药物和HDAC抑制剂配制成用于给药目的的各种药物形式。可将这些成分分别配制成单独的药用组合物，或配制成含两种成分的单一药用组合物。
因此，本发明还涉及药用组合物，该组合物含有其它药物和HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明还涉及药用组合物形式的本发明联合药物，该组合物含有抗癌药和本发明HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明还涉及本发明联合药物在制备抑制肿瘤细胞生长的药用组合物中的用途。
本发明还涉及含作为第一种活性成分的本发明HDAC抑制剂和作为第二种活性成分的抗癌药的产品，在治疗癌症患者中该产品作为联合制剂同时、分别或序贯使用。
实验部分 在下文中，＂DCM＂定义为二氯甲烷，＂DIPE＂定义为二异丙醚，＂DMA＂定义为N，N-二甲基乙酰胺，＂DMF＂定义为N，N-二甲基甲酰胺，＂EDC＂定义为N’-(乙基羰基咪唑基(carbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一盐酸盐，＂EtOAc＂定义为乙酸乙酯，＂EtOH＂定义为乙醇，＂HOBT＂定义为1-羟基-1H-苯并三唑，＂MeOH＂定义为甲醇，＂TFA＂定义为三氟乙酸，＂THF＂定义为四氢呋喃，＂PyBOP＂定义为苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷-1-基-磷鎓六氟磷酸盐。
A.中间体化合物的制备 实施例A1 a)中间体1的制备
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0045mol)、1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.0048mol)和硫酸镁(适量)在MeOH(80ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。分批加入四氢硼酸钠(Sodiumtetrahydroborate)(0.0073mol)。将混合物搅拌5小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.3g(70％)中间体1。
b)

在75℃下，将中间体1(0.0032mol)和氢氧化钠(0.0064mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌12小时，然后冷却至室温，蒸发至干，得到1.28g(100％)中间体2。
c)

在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0048mol)和HOBT(0.0048mol)分批加入中间体2(0.0032mol)的DCM(60ml)和THF(60ml)溶液。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0064mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.6g，39％)在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.45g中间体3，熔点153℃。
实施例A2 a)中间体4的制备
在室温下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0072mol)在THF(40ml)和1N氢氧化钠(40ml)中的混合物搅拌过夜。加入1N盐酸(40ml)。将混合物搅拌10分钟。加入碳酸钠(0.0216mol)。将混合物搅拌10分钟。分批加入1-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基]-2，5-吡咯烷二酮(0.0072mol)。将混合物在室温下搅拌6小时，然后冷却至0℃，用盐酸酸化。将沉淀过滤，用乙醚洗涤，干燥，得到4.1g(100％)中间体4。
b)

在10℃下，在N2气流下，将EDC(0.0455mol)和HOBT(0.0455mol)的混合物加入中间体4(0.0379mol)和三乙胺(0.114mol)在DCM/HOBT(800ml)中的混合物。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0455mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(23g)经硅胶(20-45μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到9.3g(100％)中间体5。
c)

在35℃下，将中间体5(0.0355mol)和哌啶(0.089mol)在DCM(400ml)中的混合物搅拌72小时，然后冷却至室温，蒸发。残留物(25g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 80/20/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到6.7g(56％)中间体6，熔点129℃。
d)

将中间体6(0.0009mol)和1-甲基-1H-苯并三唑-6-甲醛(0.001mol)在MeOH(40ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后在50℃下搅拌12小时，冷却至室温。加入四氢硼酸钠(0.0013mol)。将混合物在室温下搅拌48小时。加入少量水。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH90/10/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.28g，65％)在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.15g中间体7，熔点140℃。

a)中间体8的制备
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0038mol)、1-甲基-1H-苯并咪唑-2-甲醛(0.0045mol)和硫酸镁(适量)在MeOH(80ml)中的混合物在60℃下搅拌过夜，然后冷却回室温。分批加入四氢硼酸钠(0.0064mol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后冷却回室温，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1g)经硅胶(20-45μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.3)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.32g中间体8。
b)

在80℃下，将中间体8(0.0024mol)和氢氧化钠(0.0049mol)在EtOH(80ml)中的混合物搅拌6小时，然后冷却至室温。将沉淀过滤，依次用EtOH、乙醚洗涤，干燥，得到0.8g(82％)中间体9。
c)中间体10的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.003mol)和HOBT(0.41g)加入中间体9(0.002mol)在DCM(80ml)和THF(80ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.004mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.8g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.63g，66％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.5g中间体10，熔点196℃。

a)

在N2气流下，将2-(甲磺酰基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0118mol)的乙腈(30ml)溶液滴加到(2-吗啉基甲基)-氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(0.0098mol)和碳酸钾(0.0196mol)的乙腈(80ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌12小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发至干。残留物(5.6g)经硅胶(15-35μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.75g，75％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.3g中间体11，熔点100℃ b)

在0℃下，将TFA(7.5ml)加入中间体11(0.037mol)在DCM(150ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌48小时。将溶剂蒸发。加入乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到13.5g(96％)中间体12，熔点180℃。
c)

将中间体12(0.0087mol)和1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.013mol)在MeOH(100ml)中的混合物在60℃下搅拌过夜，然后冷却至10℃。加入四氢硼酸钠(0.015mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(4.6g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH97/3//0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.9g(62％)中间体13。
d)中间体14的制备
将中间体13(0.0054mol)和氢氧化钠(0.0108mol)在EtOH(80ml)中的混合物在80℃下搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发，得到2.1g(100％)中间体14。
e)

在室温下，在N2气流下，将三乙胺(0.0075mol)加入中间体14(0.0025mol)的THF/DCM(20ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.005mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.7g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/H2O 95/5//0.9)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.34g(29％)中间体15。

a)

在60℃下，将6-(1-哌嗪基)-3-吡啶甲酸乙酯(0.0094mol)和1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.0131mol)在1，2-二氯乙烷(60ml)中的混合物搅拌24小时，然后冷却至10℃。加入三(乙酸根合-α-O)硼氢化(1-)钠(0.016mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，残留物(5.5g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.725g)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.43g中间体16，熔点237℃。
b)中间体17的制备
在80℃下，将中间体16(0.0008mol)和氢氧化钠(0.0017mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌过夜，然后冷却至室温。将沉淀过滤，依次用EtOH、乙醚洗涤，干燥，得到3g(94％)中间体17。

a)

在室温下，在N2气流下，将2-氯-5-嘧啶甲酸甲酯(0.033mol)的DCM(80ml)溶液加入4-哌啶甲醇(0.066mol)和N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺(0.083mol)的DCM(100ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌3小时又30分钟，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。将残留物溶于戊烷。将沉淀滤出，干燥，得到7.88g(95％)中间体18。
b)

在140℃下，将中间体18(0.01mol)和5-(溴甲基)-1-甲基-1H-苯并三唑(0.0035mol)在DMF(30ml)中的混合物搅拌6小时。将溶剂蒸发。将残留物溶于EtOAc。将有机层依次用水、饱和氯化钠洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。将残留物与用类似方法制备的另一份流分合并，得到4g，然后经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。残留物(0.9g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.22g中间体19。
c)中间体20的制备
在室温下，将中间体19(0.0011mol)和氢氧化锂(0.0021mol)在THF(10ml)和水(10ml)中的混合物搅拌24小时。将溶剂蒸发。加入水(10ml)。将混合物用乙醚洗涤两次。将水层用3N盐酸酸化至pH 4。将沉淀过滤，用水洗涤，干燥，得到0.29g(71％)中间体20。
d)

在室温下，将EDC(0.001mol)和HOBT(0.001mol)加入到中间体20(0.0007mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.001mol)和三乙胺(0.003mol)在DCM/THF(50/50)(40ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.28g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.28g(80％)。使得到的部分残留物(0.04g)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.032g中间体21，熔点159℃。
实施例A7 a)中间体22的制备
在室温下，在N2气流下，将硫酸镁(适量)加入2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0013mol)和2-苯并噻唑甲醛(0.0015mol)的MeOH(15ml)溶液中。将混合物搅拌回流48小时，然后冷却至10℃。加入四氢硼酸钠(0.0026mol)。将混合物在室温下搅拌4小时。加入DCM(15ml)。将混合物搅拌过夜，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到0.5g中间体22。该产物直接用于下步反应。
b)

在室温下，在3巴压力下，将中间体22(0.0012mol)和Pd/C(0.5g)在MeOH(40ml)中的混合物氢化48小时，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干。残留物(0.46g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 100/0-95/5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.143g(30％)中间体23。
c)中间体24的制备
将中间体23(0.0003mol)和氢氧化钠(0.0014mol)在EtOH(15ml)中的混合物搅拌回流4小时，然后冷却至室温，将溶剂蒸发至干。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.14g(100％)中间体24，熔点>260℃。
d)中间体25的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0007mol)和HOBT(0.0007mol)加入中间体24(0.0003mol)的THF(15ml)和DCM(15ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0007mol)。将混合物在室温下搅拌3天，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.24g)经硅胶(10μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.075g(17％)中间体25。
实施例A8 中间体26的制备
在5℃下，在N2气流下，将甲磺酰氯(0.0046mol)加入1-甲基-1H-苯并三唑-5-甲醇(0.0031mol)和三乙胺(0.0092mol)在DCM(50ml)中的混合物。将混合物在10℃下搅拌2小时又30分钟，然后蒸发至干，得到中间体26。该产物直接用于下步反应。
实施例A9 a)中间体27的制备
在室温下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0038mol)、乙醛(0.0076mol)和Pd/C(0.2g)在MeOH(100ml)中的混合物氢化24小时，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干，残留物(2.35g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 90/10/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.66g(30％)中间体27。
b)中间体28的制备
将中间体27(0.002mol)、中间体26(0.0031mol)和碳酸钾(0.0061mol)在乙腈(60ml)中的混合物搅拌回流过夜，然后冷却至室温，倾入冰水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.76g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 100/0-98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.42g(47％)中间体28。
c)

将中间体28(0.0009mol)和氢氧化钠(0.0038mol)在EtOH(50ml)中的混合物搅拌回流4小时，然后冷却至室温，溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.35g(85％)中间体29，熔点>260℃。
d)中间体30的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0016mol)和HOBT(0.0016mol)加入中间体29(0.0008mol)的THF(40ml)和DCM(40ml)溶液中。将混合物搅拌30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0016mol)。将混合物在室温下搅拌5天，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.6g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05-93/7/0.35)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.285g(70％)中间体30。

a)

在N2气流下，将2-氯-5-嘧啶甲酸甲酯(0.058mol)的DMA(80ml)溶液滴加到4-哌啶甲胺(0.116mol)和N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺(0.145mol)的DMA(150ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时又30分钟，倾入冰水中，依次用EtOAc、DCM萃取。将有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。使残留物在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到10g(65％)中间体31。
b)

将中间体31(0.008mol)和1-甲基-1H-苯并三唑-6-甲醛(0.0087mol)在MeOH(250ml)中的混合物搅拌回流15小时，然后冷却至5℃。分批加入四氢硼酸钠(0.0112mol)。将混合物在5℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时，倾在冰上。将沉淀过滤，用水洗涤，干燥。残留物(3.1g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到2g(63％)中间体32。
c)

将中间体32(0.0018mol)、碘乙烷(0.0037mol)和三乙胺(0.0056mol)在DMF(3.5ml)中的混合物在70℃下搅拌24小时。将溶剂蒸发。将残留物溶于水。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.9g)(经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 98/2纯化)。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.41g(51％)中间体33。
d)中间体34的制备
在室温下，将中间体33(0.0009mol)和氢氧化锂(0.0018mol)在THF(25ml)和水(12.5ml)中的混合物搅拌15小时。加入3N盐酸至pH4。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到0.35g(83％)中间体34。
e)中间体35的制备
在室温下，将EDC(0.0012mol)和HOBT(0.0012mol)加入中间体34(0.0007mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0012mol)和三乙胺(0.0025mol)的DCM/THF(60ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.55g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.1-93/7/0.7)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.31g(72％)中间体35。
实施例A11 a)

在室温下，在3巴压力下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0013mol)、1-甲基-1H-苯并三唑-5-甲醛(0.0015mol)和Pd/C(0.1g)在MeOH(40ml)中的混合物氢化4天，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干。残留物(0.6g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH100/0-95/5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.23g(43％)中间体36。
b)

将中间体36(0.0012mol)、氯代乙酸乙酯(0.0018mol)和三乙胺(0.0036mol)在DMF(10ml)中的混合物在50℃下搅拌24小时，然后在80℃下搅拌24小时，冷却至室温，倾入冰水中，用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.56g)经硅胶(10μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH 99.5/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.21g(35％)中间体37。
c)

将中间体37(0.0004mol)和氢氧化钠(0.0017mol)在EtOH(20ml)中的混合物搅拌回流6小时，然后在室温下搅拌过夜，蒸发至干。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.2g(100％)中间体38，熔点>260℃。
d)

在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0016mol)和HOBT(0.0016mol)加入中间体38(0.0004mol)的THF(25ml)和DCM(25ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0016mol)。将混合物在室温下搅拌4天，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05-92/8/0.4)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.18g(71％)中间体39。

a)

在5℃下，将甲磺酰氯(0.0018mol)滴加到中间体32(0.0012mol)和三乙胺(0.0037mol)的DCM(20ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌15小时，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。使残留物在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.53g(88％)中间体40，熔点190℃。
b)

将中间体40(0.001mol)和氢氧化锂(0.002mol)在THF(30ml)和水(10ml)中的混合物在室温下搅拌15小时，然后加入3N盐酸中和。将溶剂蒸发。将沉淀过滤，依次用水、乙醚洗涤，干燥，得到0.3g(64％)中间体41。
c)中间体42的制备
在室温下，将EDC(0.0009mol)和HOBT(0.0009mol)加入中间体41(0.0006mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0009mol)和三乙胺(0.0019mol)的DCM/THF(50/50)(30ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.33g(92％)中间体42。
实施例A13 a)中间体43的制备
在室温下，依次将三乙胺(0.011mol)、丙酰氯(0.0049mol)滴加到中间体1(0.0038mol)的DCM(80ml)溶液中。将混合物在室温搅拌过夜，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使该流分(1.4g，80％)在乙醚/DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到1.05g中间体43，熔点116℃。
b)

在60℃下，将中间体43(0.0021mol)和氢氧化钠(0.17g)在EtOH(80ml)中的混合物搅拌15小时，冷却至室温，蒸发。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到1.1g(100％)中间体44。
c)中间体45的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0032mol)和HOBT(0.0032mol)加入中间体44(0.0021mol)和三乙胺(0.0065mol)的DCM/THF(120ml)溶液。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0043mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.8g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.3)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.87g，75％)在乙醚/DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.565g中间体45。
实施例A14 a)中间体46的制备
在-70℃下，在N2气流下，将氢化二(2-甲基丙基)铝(0.0344mol)加入1-丙基-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(0.0138mol)的THF(140ml)溶液中。将混合物在-70℃下搅拌，然后升温至室温，保持1小时，倾入1N HCl和冰中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到2.8g(100％)中间体46。
b)中间体47的制备
将中间体46(0.0138mol)和氧化镁(0.097mol)在DCM(150ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤。将硅藻土用MeOH洗涤。将滤液蒸发，得到2.2g(85％)中间体47。
c)中间体48的制备
在60℃下，将6-(1-哌嗪基)-3-吡啶甲酸乙酯(0.0057mol)和中间体47(0.008mol)在1，2-二氯乙烷(30ml)中的混合物搅拌24小时，然后冷却至室温。分批加入NaBH(OAc)3(0.0096mol)。将混合物在室温下搅拌5小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.4g(61％)中间体48。
d)

在80℃下，将中间体48(0.0025mol)和氢氧化钠(0.0049mol)在EtOH(60ml)中的混合物搅拌4小时，然后冷却至室温。将沉淀过滤，用EtOH洗涤。将滤液(0.25g)蒸发至干，得到0.7g中间体49。
e)中间体50的制备
在室温下，将三乙胺(0.002mol)加入中间体49(0.0005mol)、[2-氨基-4-(2-噻吩基)苯基]-氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(0.001mol)和PyBOP(0.0011mol)的THF(3ml)和DCM(3ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.14g(43％)中间体50。
B.终化合物的制备


在室温下，将TFA(2ml)滴加到中间体3(0.001mol)在MeOH(40ml)中的混合物。将混合物在室温下搅拌24小时，然后蒸发至干，使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.336g(65％)化合物1，熔点197℃。

化合物2的制备
.0.89C2HF3O2 0.28H2O 在5℃下，将TFA(1.7ml)加入中间体7(0.0007mol)的MeOH(34ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发至干。使残留物在乙醚/CH3CN中结晶。将沉淀过滤，用乙醚洗涤，干燥，得到0.32g(90％)化合物2，熔点206℃。
实施例B3 化合物3的制备
在室温下，将中间体10(0.001mol)在TFA(2.5ml)和MeOH(50ml)中的混合物搅拌72小时，然后蒸发。使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.5g(96％)化合物3，熔点209℃。
实施例B4 化合物4的制备
在室温下，将中间体15(0.0007mol)在TFA(2ml)和MeOH(40ml)中的混合物搅拌24小时，然后蒸发。使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀过滤，干燥，得到0.241g(65％)化合物4，熔点193℃。



在室温下，将三乙胺(0.01mol)加入到中间体14(0.0025mol)、1，2-苯二胺(0.0058mol)和PyBOP(0.005mol)的THF(30ml)和DCM(30ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(4.3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5-93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.4g，34％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.288g化合物5，熔点152℃。



在室温下，将三乙胺(0.022mol)加入中间体17(0.0054mol)、1，2-苯二胺(0.0124mol)和PyBOP(0.0108mol)的THF(50ml)和DCM(50ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(8.3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.4)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.48g，21％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.314g化合物6，熔点219℃。



在5℃下，将TFA(0.9ml)滴加到中间体21(0.0003mol)的MeOH(18ml)和DCM(6ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时。将溶剂蒸发一半。将沉淀滤出，用乙醚洗涤，干燥，得到0.135g(71％)化合物7，熔点197℃。



将中间体25(0.0001mol)在TFA(0.3ml)和MeOH(8ml)中的混合物在室温下搅拌3天，然后蒸发至干。使残留物在MeOH/CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.049g(64％)化合物8，熔点208℃。



将中间体30(0.0005mol)在TFA(1.5ml)和MeOH(30ml)中的混合物在室温下搅拌24小时，然后蒸发至干。残留物(0.38g)经氨基涂布的硅胶(amino coated silica gel)(25-40μ)柱层析(洗脱液DCM/MeOH/水80/20/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.185g，78％)在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.15g(63％)化合物9，熔点168℃。



在5℃下，将TFA(1.5ml)加入中间体35(0.0005mol)的MeOH(30ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发至干。使残留物在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.295g(93％)化合物10，熔点110℃。



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