专利名称：免疫抑制状态鸡用作测试药物免疫增强作用的动物模型的制作方法 在临床应用中，一些化药和中药被认为对人及动物有免疫增强作用。由于缺乏一种可用来科学和客观评价药物的免疫增强作用的实验体系，在申报新药证书时，均不能提供必要的试验数据。因此，迄今为止尚没有一种具免疫增强作用的药物或制剂被批准为正式药品。免疫抑制状态鸡的实验模型作为一种实验系统可为检测和评价对鸡的免疫增强作用提供科学和客观的实验数据。这对新药的开发和评价将会有很大的应用前景。
本发明所涉及的设计原理对于免疫功能正常的人或动物来说，免疫功能的增强可能意味着病态，而用于治疗目的的免疫增强性药物，应是针对免疫功能低下的个体和群体。如能在鸡群中建立起可控程度的免疫抑制状态，就可用做测试药物免疫增强作用的动物模型，这也就是本发明所要达到的目的。建立免疫抑制状态鸡的实验模型的原则方法 将用不同剂量的免疫抑制性病毒接种不同日龄、没有特定母源抗体的雏鸡，建立起不同程度免疫抑制状态的鸡群。对以上所建立的免疫抑制状态的鸡在1周、2周或3周龄时使用鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、H5-AIV型或H9-AIV型的禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)制备的灭活油乳疫苗。在免疫后3、4和5周采血提取血清分别测定对NDV和H5-AIV和H9-AIV的血凝抑制(HI)抗体滴度，以此作为免疫功能状态的客观量化的指标。本发明具体实施方案1 禽网状内皮增生病毒(Avian Reticuloendotheliosis viruses，REV)感染免疫抑制状态试验1.1 REV的标准化为了保证病毒毒力的稳定性从而有效地控制感染鸡群的免疫抑制状态，本发明使用REV-C99株的传染性克隆作为病毒的来源。在用该传染性克隆DNA(可用基因工程的方法无限复制而且不会有明显变异)转染鸡胚成纤维细胞产生病毒后，在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代不超过6代(该病毒已于2001年07月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1429；专利申请号2005101262182)。1.2鸡群免疫抑制状态的建立方法取没有REV母源抗体的鸡(SPF来源鸡或经预先测定没有REV母源抗体的鸡)，分别在1、7、14日龄接种100、1000、10000个TCID50的REV-C99病毒，将可建立处于不同程度免疫抑制状态的鸡群作为动物模型；也可以用没有J亚群鸡白血病病毒(ALV-J)母源抗体的鸡(SPF来源鸡或经预先测定没有CLV-J母源抗体的鸡)，分别在1、7、14日龄接种1000、10000、100000个TCID50的NX0101株ALV-J病毒(张纪元等，J亚群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的构建及其致病性，微生物学报，2005，45437-440；Cui et al.，Reduced serologic response to Newcastle disease virus inbroiler chickens exposed to a Chinese field strain of subgroup J avian leukosis virus.Avian Diseases，2006，50191-195.)，建立起处于不同程度免疫抑制状态的鸡群作为动物模型。1.3 REV感染建立免疫抑制状态的检测 以用对NDV、H5-AIV型或H5-AIV型灭活疫苗免疫鸡只后的HI抗体滴度为指标，可以客观并可量化地确定REV感染鸡群的免疫抑制状态(程度)，结果见表1、表2、表3和表4。表1 不同剂量REV感染对NDV HI抗体滴度的影响(Log2)

表中数字为平均数±标准差(样本数)。
两个不同大字母表示差异极显著(p＜0.01)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
表2不同剂量REV感染对免疫鸡H9-AIV HI抗体滴度的影响(Log2)

表中数字为平均数±标准差(样本数)。
两个不同大字母表示差异极显著(p＜0.01)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
表3 REV感染对免疫鸡AIV-H5 HI抗体滴度的影响(Log2)

两个不同大字母表示差异极显著(p＜0.01)，两个不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
表4 REV感染对SPF鸡中枢免疫器官的影响(％)

两个不同大字母表示差异极显著(p＜0.01)，两个不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
由此建立的免疫抑制状态的鸡群，可作为用来判断或评价药物是否有免疫增强的实验模型。
2 REV诱发免疫抑制状态鸡群作为测试免疫增强性药物的动物模型的初步应用利用本发明建立的动物模型，根据对NDV或H5-AIV型和H9-AIV型的HI抗体滴度的差异，可以科学而又客观地评价药物的免疫增强作用。初步实验的结果见表5。由表5可见，免疫抑制状态的鸡群使用药物A可使对NDV和AIV的HI抗体水平显著高于对照组，但在正常鸡群，同样该药物无此作用。
表5不同药物对不同健康状态下鸡的抗体水平的比较

B组鸡在1日龄接种5000TCID50的REV-C99株，7日龄接种NDV和H5-AIV型灭活疫苗。在免疫后4、5、6周分别作检测ND、H5-AIV的HI抗体水平3次。
A组鸡未经REV感染，Al、A2和A3三组间抗体滴度无显著差异，表明所用的二种药物对正常鸡不显示任何免疫增强作用。
而经REV感染造成免疫抑制状态的B1，B2和B3三组鸡，对NDV和H5-AIV的HI抗体效价均显著低于未经REV感染的鸡。但是，经喂饲某种中药浸剂的B2组，其HI抗体滴度显著高于不喂药的B1组或喂另一种药物的B3组。这表明，该中药浸剂对于处于免疫抑制状态的鸡，可显示一定程度的免疫增强作用。
本发明的优点本发明利用鸡免疫抑制病毒感染鸡造成动物体可控的免疫抑制状态，建立的动物模型，根据对NDV或H5-AIV型和H9-AIV型AIV的HI抗体滴度的差异，可以科学而又客观地评价药物的免疫增强作用。


本发明涉及一种用作测试药物免疫增强作用的动物模型及其建立方法。用免疫抑制性病毒(如REV或ALV－J)诱发鸡群的可控程度的免疫抑制状态。以处于免疫抑制状态的鸡为动物模型作为一种实验系统可为检测和评价药物对鸡的免疫增强作用提供科学和客观的实验数据。这对新药的开发和评价将会有很大的应用前景。