含有益生菌的大豆寡糖产品及其制备方法[0002]肠道是人体主要的消化器官，也是重要的免疫系统。肠道中的细菌种类非常多，有好菌也有坏菌，已有许多研究显示肠道中益生菌的增加，可防止坏菌的生长，改善肠道蠕动、增加免疫力及预防癌症发生等保健效果(Gibson and Roberfroid, 1995)。此外,研究也发现肠道菌可控制脂质的代谢，当肠道菌相失去平衡，会引发全身性的低度慢性发炎，进而导致肥胖，增加代谢症候群等疾病发生的机率(Cani and Delzenne, 2009)。肠道菌对人体健康的影响可见一斑。而一般可以透过补充有益于肠道健康的保健食品，来改善肠道的环境，这类的保健食品可分成三种:益生菌(probiotics)、益菌生(prebiotics)以及同时具有益生菌与益菌生的合生素(synbiotics)。[0003]大豆寡糖是常见的益菌生(prebiotics),天然存在的是由棉子糖(raffinose)、水苏糖(stachyose)等α -半乳糖苷类(a-galactoside)及鹿糖(sucrose)所组成。是一种低甜度、低热量的甜味剂，能替代蔗糖应用在功能性食品或低热量食品中，由于不会增加胰岛素的分泌量，糖尿病人也可安心食用。其主要成分在小肠内不会被吸收，而在菌丛较多的大肠部位才会被利用。研究发现，对人体健康有害的细菌如大肠杆菌等，不仅无法利用寡糖，反而会被抑制生长。另一方面，大豆寡糖在大肠中发酵或部份发酵，产生短链旨肪酸(short chain fatty acids, SCFA),醋酸盐(acetate)、丙酸盐(propionate)及丁酸盐(butyrate)等代谢产物，可以直接促进肠道蠕动，使排便顺畅。醋酸盐或丁酸盐并且可以抑制有害菌的生长繁殖，进而改变肠道菌相，使肠道成为有利于好菌生长的良好环境(Campbell et al., 1997 ；Bang et al.,2007 ；Su et al.,2007 ；Smiricky-Tjardes et al.,2003)。[0004]一般而言，益生菌被认定为活菌本身，但是近年来发现某些益生菌所衍生的活性物质，也有促进宿主健康的功效，因此目前已把活菌体、死菌体、菌体的萃取物，甚至其代谢产物等，都归纳属于益生菌的范围。乳酸菌兼具多样生理功能以及高度食用安全的特性，因此成为现今保健产品开发的重要素材(陈等人，2007)。[0005]乳酸菌是益生菌中最重要的一群，人类长久以来有饮用发酵乳品的习惯，乳酸菌被认为是相当安全的一种菌种，且是肠内有益菌的代表I性细菌。当乳酸菌进入肠道后，可刺激肠道相关淋巴组织特异性与非特异性的免疫反应，效果会受到菌体黏着在肠腔时与淋巴组织接触的程度影响。一般认为乳酸菌必须黏着于肠道并繁殖才具有效用。有些实验显示，停止摄食乳酸菌后，在几周内乳酸菌便会消失，并不会持续存在于肠道内。但是短暂的黏着，还是有刺激肠道免疫系统的效果，尤其是对服用抗生素或腹泻感染的对象，摄食乳酸菌后可帮助病人肠内菌丛的重建，而回复免疫系统的平衡。乳酸菌借着促进宿主内部防御机制的功能和改善肠道菌相，可作为肠道异常和发炎反应等疾病上的治疗。有研究指出，愈早摄食乳酸菌，愈有机会与宿主细胞上的接受器交互作用，在上皮细胞黏膜建立据点，成为共生的菌群(Parvez et al.，2006)。由于乳酸菌在肠道中扮演非常关键的角色，直接影响到人类的健康，因此乳酸菌产品或利用乳酸菌进行生物转化的衍生性产品，已成为市场上的热门商品(陈等人，2007)。目前于市售乳酸菌商品，较常使用的菌种以乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)与双歧杆菌(Bifidobacterium sp.) 二属居多，而胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)也是其中常见的益生菌菌株(Parvez et al., 2006) ?[0006]目前常见的合生素(synbiotics)的调制方法是将益生菌(probiotics)添加至益菌生(prebiotics)中，例如日本专利JP2-200168揭示了一种于制造豆腐等大豆加工食品过程中，利用所产生的含糖质的大豆浸溃水进行乳酸菌发酵，而制造乳酸饮料的方法，但是该方法所使用的大豆浸溃水由于以水萃取，无法去除豆臭等大豆特有异味的问题，同时由于溶出物相当有限，就经济效益而言，难说令人满意。也有建议将益生菌(如乳酸菌等)添加至益菌生(如大豆寡糖等)中而制造合生素的方法，例如韩国专利KR20020043078揭示了一种益生菌复合物，中国专利CN101406489A揭示了一种微生态复合菌剂及其制备方法以及CN101496583A揭示了一种含有益生菌的营养食品。该三专利案均是将特定的乳酸菌组合物以特定比例添加至大豆寡糖中而成，但是对于大豆寡糖的组成并未具体界定，特别是对于肠内细菌有选 择性增殖作用的棉子糖与水苏糖的含量，完全未述及。另外，中国台湾发明专利252759揭示了一种发酵大豆萃取液的制备方法，以热水溶出方式取得大豆萃取液后，加入乳酸菌培养，将最终发酵液经加热杀菌及过滤处理而获得具有免疫调节功能的活性物质，亦即所制备者仅为益菌生物质。[0007]由上述可知，现今对于合生素的调制方法，仍采用将益生菌添加至益菌生中的方式，而本发明案的发明人则是针对上述问题，提供一种由将益生菌接种至益菌生，进行发酵，而此发酵产品可直接作为合生素的方法。[0008]【文献】
[0009]专利文献
[0010]1.日本专利 JP2-200168
[0011]2.中国专利 CN101406489A
[0012]3.中国专利 CN101496583A
[0013]4.韩国专利 KR20020043078
[0014]5.中华民国发明专利252759
[0015]非专利文献
[0016]1.Bang, Μ.H., Chio, 0.S.and Kim, ff.K.2007.Soy oligosaccharide increasesfecal bifidobacteria counts, short — chain fatty acids, andfecal lipidconcentrations in young Korean women.2007.J.Med.Food.10:366-370.[0017]2.Campbell, J.M., Fahey, G.C.and Wolf, B.ff.1997.Selected indigestibleoligosaceharides affect large bowel mass, cecal and fecal short chain fattyacids, pH and microflora in rats.J.Nutr.127: 130-136.[0018]3.Cani, P.D.and Delzenne, N.M.2009.1nterplay between obesity andassociated metabolic disorders:new insights into the gut microbiota.Cur.0pin.Pharma.9:737-743.[0019]4.Gibson，G.R.and Roberfroid, Μ.B.1995.Dietary modulation of thehuman colonic microbiota !introducing the concept of prebiotics.J.Nutr.152:1401-1412.[0020]5.Parvez, S., Malik, K.A., Kang, S.A.and Kim, Η.Y.2006.Probiotics and theirfermented food products are beneficial for health.J.Appl.Micr0.100:1171-1185.[0021]6.Smiricky-Tjardes，M.R.，Flickinger, E.A.，Grieshop，C.M.，Bauer, L L，Murphy,M.R.and Fahey,G.C.2003.1n vitrofermentation characteristics of selectedoligosaccharides by swinefecal microflora.J.Animal Sc1.81:2505-2514.[0022]7.Su, P.，Henriksson, A.and Mitchell，H.2007.Selected prebiotics supportthe growth of probiotic mono-cultures in vitr0.Anaerobe.13:134-139.[0023]8.陈庆源、黄崇真、邱雪惠、廖启成。2007。乳酸菌之保健功效与产品开发。食品生技60-68。


[0024]本发明的一主要目的在于提供一种含有益生菌的大豆寡糖产品，其包含大豆的酸可溶性糖及益生菌，其中该大豆的酸可溶性糖包含果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖，其中棉子糖及水苏糖两者的重量和占46%以上，果糖占8.5%以下，及葡萄糖占1.0%以下，以果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖的重量和为基准。
[0025]本发明的另一目的在于提供一种含有益生菌的大豆寡糖产品的制备方法，其包括以水在PH3-6及温度50-70°C萃取大豆原料以获得含有大豆的酸可溶性糖的萃取物，及对该萃取物接种可分解单糖与双糖但不分解三糖与四糖的益生菌进行发酵。
[0026]较佳的，本发明的大豆寡糖产品中的棉子糖及水苏糖两 者的重量和为49-85%，及葡萄糖占0.5%以下，以果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖的重量和为基准。更佳的，棉子糖及水苏糖两者的重量和为75% -85%,以果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖的重量和为基准。
[0027]较佳的，本发明的大豆寡糖产品中的益生菌为可分解单糖与双糖，且不分解三糖与四糖的益生菌。
[0028]较佳的，该益生菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳杆菌(Lactococcus Iactis)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),其中以胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)更佳。
[0029]较佳的，本发明的大豆寡糖产品中的益生菌为选自BCRC20270 (Saccharomycescerevisiae)、21403、21468、21469、21727、21480(Kluyveromyces marxianus)及21777 (Pichia stipitis)的酵母菌。
[0030]较佳的，本发明的大豆寡糖产品中的益生菌的含量为1.0xlO9CFU/g-9.9X10lclCFU/g。
[0031]较佳的，本发明的大豆寡糖产品中的大豆的酸可溶性糖是将大豆原料以水在pH为3-6及温度50-70°C的条件萃取获得的。[0032]较佳的，该大豆原料是选自大豆、全脂大豆片、脱脂大豆片、全脂大豆粉、脱脂大豆粉、或大豆残渣，其中该大豆残渣是以大豆为原料的食品制程所产生的。更佳的，该大豆原料为脱脂大豆片或脱脂大豆粉。
[0033]在本发明的一实施方案中，本发明的含有益生菌的大豆寡糖产品是作为食品添加剂。
[0034]在本发明的另一实施方案中，本发明的含有益生菌的大豆寡糖产品是作为饲料添加剂。
[0035]依本
所完成的一种含有益生菌的大豆寡糖产品的制备方法，包括下列步骤:
[0036](a)以水在pH3_6的酸性条件下萃取大豆原料；
[0037](b)对步骤(a)的萃取混合物进行固液分离，得到酸可溶性糖液；
[0038](c)调整该酸可溶性糖液的pH值至碱性并加入植酸沉淀剂，以形成植酸盐沉淀，接着进行固液分离，得到大豆粗糖液；
[0039](d)去除上述大豆粗糖液中的蛋白质，接着去除其中的盐类，而得到一脱盐大豆糖液；
[0040](e)将上述脱盐大豆糖液接种益生菌进行发酵，以及收集该发酵液；
[0041]其中，该益生菌分解单糖、双糖而不分解三、四糖。
[0042]较佳的，步骤(a)中的萃取于50至70°C的温度进行。
[0043]较佳的，步骤(C)中的该酸可溶性糖液的pH值被调整至8-9，及该植酸沉淀剂为碳酸钙。更佳的，该碳酸钙的用量为0.1-0.5%，以该酸可溶性糖液的重量为基准。
[0044]较佳的，本发明的方法进一步包含，在步骤(C)之前，对步骤(b)得到的酸可溶性糖液进行浓缩。
[0045]较佳的，本发明的方法进一步包含，在步骤(d)之前，对步骤(C)得到的大豆粗糖液进行浓缩。
[0046]较佳的，本发明的方法进一步包含，在步骤(e)之前，对步骤(d)得到的脱盐大豆糖液进行浓缩。
[0047]较佳的，本发明的方法进一步包含对步骤(e)得到的发酵液进行浓缩，而得到一糖浆形式的产品。
[0048]较佳的，本发明的方法进一步包含对步骤(e)得到的发酵液进行干燥，而得到一粉末形式的产品。
[0049]较佳的，步骤(d)以微过滤膜处理上述大豆粗糖液而去除其中的蛋白质，接着对所获得的过滤液进行电透析处理而去除其中的盐类。更佳的，该微过滤膜具有0.3μπι的孔径。
[0050]较佳的，本发明的方法所使用的大豆原料是选自大豆、全脂大豆片、脱脂大豆片、全脂大豆粉、脱脂大豆粉、或大豆残渣，其中该大豆残渣是以大豆为原料的食品制程所产生的。
[0051]在本发明的一实施方案中，步骤(e)所得到的发酵液被作为食品添加剂。
[0052]在本发明的另一实施方案中，步骤(e)所得到的发酵液被作为饲料添加剂。
[0053]实施方式[0054]本发明揭示了 一种含有益生菌的大豆寡糖产品，其制备方法包含以酸液萃取大豆原料得到一酸可溶性糖液，进一步精制后，选择具备益生菌性质且选择性利用单、双糖而不利用三、四糖的微生物进行发酵，使得发酵后的糖液中的棉子糖和水苏糖的相对浓度显著的提升，同时也因为益生菌的生长而使得最终产品为一种合生素。
[0055]于本发明中所使用酸萃取方式可以取得大约脱脂大豆粉或脱脂大豆片的15重量％的酸可溶性糖。该酸可溶性糖液包含果糖、萄葡糖、蔗糖、棉子糖和水苏糖，其中有约50%为蔗糖及单糖，另有50%左右为具有机能性的棉子糖及水苏糖。由于其中蔗糖所占比例颇高(约40%，w/w)，无法直接以喷雾干燥方式制成粉末产品。因此本发明以微生物发酵方式将糖液中的果糖、萄葡糖及蔗糖转化，但同时不分解棉子糖和水苏糖，即可使得发酵后的糖液中的棉子糖和水苏糖的相对浓度显著的提升。
[0056]于本发明的一较佳具体实施例中以大豆糖浆BrixlO至30为培养基，接种乳酸菌(105CFU/mL)于37°C培养2至3天，乳酸菌在增殖过程会选择性分解双糖及单糖，并保留住大部分的三糖及四糖，此发酵培养基的乳酸菌可增殖到相当的菌量(101(lCFU/mL)。最后得到的发酵液、发酵浓缩液或喷雾干燥方式制成的粉末，即是同时含有益生菌(乳酸菌)及益菌生的合生素产品。
[0057]本发明所使用的大豆原料，并无特别限定，可例举大豆、全脂大豆片、脱脂大豆片、全脂大豆粉、脱脂大豆粉、或其它以大豆为主要原料的加工制程残渣，如:豆腐或豆浆制程所残余下来的大豆残渣(okara)等。较佳为脱脂的大豆片及脱脂的大豆粉。
[0058]本发明所使用的益生菌，只要为可分解单糖与双糖，且不分解三糖与四糖者即可，例如乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸乳杆菌(Lactococcus Iactis)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等。该益生菌也可为选自 BCRC20270 (Saccharomyces cerevisiae)、21403、21468、21469、21727>21480 (Kluyveromyces marxianus)及 21777 (Pichia stipitis)的酵母菌。以脱盐大豆粗糖液接种益生菌进行发酵后，棉子糖及水苏糖的残留量为75%以上者为佳，尤以棉子糖及水苏糖对总糖的比例达85%为更佳。
[0059]由于希望益生菌黏附于肠道后开始发生作用，视需要，由本发明的方法所制得的含有益生菌的大豆寡糖产品，可进一步进行浓缩、干燥等加工步骤后，直接与被覆剂调配作成膜衣制剂，或与此领域中所已知的添加剂(例如黏着剂、赋形剂、可塑剂、润滑剂、遮蔽齐U、着色剂及防腐剂等的I种或I种以上)组合，作成例如锭剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒齐L1、舌片剂等。
[0060]本发明可使用的被覆剂、黏着剂、赋形剂、可塑剂、润滑剂、遮蔽剂、着色剂及防腐剂等，均为此项【技术领域】中所已知，且可为此项【技术领域】者，根据需要适合选用，无进一步限定的必要。
[0061]根据本发明所制得的含有益生菌的大豆寡糖产品，不仅本身可作为健康食品，其亦可作为食品添加剂或饲料添加剂。其添加方式及添加量，可由此项【技术领域】者，根据需要，选择适当方式，以适当量添加使用。
[0062]本发明将以下列实施例进一步具体说明，惟这些实施例的揭示不应视为任何限制本发明之意图。
[0063]实施例1
[0064]1.大豆寡糖液的制备，包括以下步骤:
[0065](I)大豆原料酸萃取
[0066]大豆酸可溶性糖液是由大豆原料经酸萃取而得的酸可溶性糖液。将IOOKg脱脂大豆粉(购自大统益股份有限公司的高蛋白黄豆片)加入四倍量的水(w/v)并以16wt%盐酸水溶液调整溶液PH值至3至6，于50至70°C加热搅拌5?30分钟后(在此实施例中搅拌10分钟)，以压榨机进行固/液分离，收集第一次的压榨酸液，所得的压榨渣再以同样的条件萃取一次，再进行第二次的压榨分离，将两次压榨液混合即获得酸萃取糖液，浓度约Brix(糖度)6。于大量生产时，可多批次制备较多量的酸萃取糖液，适度浓缩后，再进行后续大批量的精制处理。
[0067](2)大豆酸可溶性糖液的杂质去除
[0068]大豆酸可溶性糖液可以一般已知的固液分离方式(例如:离心或过滤)进一步去除不溶的渣，取得的澄清液被加入40wt% NaOH水溶液将pH调整至8-9，再加入0.1至0.5%(w/w)碳酸钙(也可使用氯化钙、碳酸镁或氯化镁)，并加热至90°C、10分钟，即可将萃取液中的植酸以盐类形式沉淀，再经固液分离(离心)即得澄清大豆粗糖液，最后将粗糖液PH调至7。
[0069](3)精致化处理:
[0070]此步骤的目的是将粗糖液中的蛋白质与盐分去除。一种合适操作的方法是先以微过滤膜(孔径为0.3 μ m)处理粗糖液，然后过滤液再使用电透析处理。将280Kg浓缩的大豆粗糖液(Brixl8.6)，经微过滤膜处理4小时后，获得270Kg澄清液(Brixl6.3)，回收率为85% (蛋白质含量被降低)；而后继续以电透析循环处理(Micro Acilyzer G5, AsahiC0.),导电度从32mS/em下降至10mS/cm,盐含量也自1.34%减至0.07 透析液回收量260Kg(Brixl3.9)，回收率为80%，估算盐分的去除率高达95%，可溶固形物(Brix)的保留率69.4%。将脱盐后的大豆糖液进一步浓缩至Brixl5，即可供下一阶段的发酵使用。
[0071]2.以脱盐大豆糖液培养益生菌
[0072]由财团法人食品工业发展研究所BCRC菌种数据库中，筛选可以分解单、双糖但不分解三、四糖之乳酸菌及酵母菌。
[0073]在乳酸菌发酵方面，透过乳酸菌发酵将脱盐后的大豆糖液中的蔗糖、果糖与葡萄糖成份转化，使脱盐大豆糖液的单、双糖含量降低，进而提升棉子糖及水苏糖等寡糖的相对浓度。此处所使用的益生菌可以是Pediococcus、Lactobacillus、Bifidobacterium等所属的菌株，经适当地活化后，即可被接入脱盐大豆糖液中，于37°C培养24至72小时后(此时已达稳定期(stationary phase)),收集发酵液即得。
[0074]在本实施例中选择Pediococcus acidilactici BCRCl 1064 或 Lactobacillusdelbrueckii BCRC12297 或 Lactobacillus plantarum BCRC12327 或 Lactobacillusfermentum BCRC10360 或 Lactococcus lactis BCRC12312 或 Lactobacillus caseiBCRC10697等乳酸菌进行脱盐大豆糖液的发酵培养，首先于甘油保存管内取一接种环的菌量，接入5毫升MRS培养基，并于37 °C培养箱中培养24小时，然后取其培养菌液以1% (v/v)接菌量接入10毫升MRS培养基，再于37°C培养18小时后此菌液即为后续脱盐大豆糖液发酵培养的种菌。而后利用摇瓶培养，以500mL有沟摇瓶，盛装300mL浓度Brixl5的脱盐大豆糖液作为培养基，接入1% (v/v)种菌，于37°C培养24小时后，所得的发酵液经离心(3000rpm，10分钟)去除菌体，取得上清液后，以高效率液相层析仪搭配Hibar250-4LiChrosorb NH2 分离管柱及 ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)检测器，分析发酵液中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水苏糖等糖类的含量。结果被显示于表
I。从表I可以看出这些乳酸菌对脱盐大豆糖液中的葡萄糖有相当好的转化效果，可以完全消耗利用。果糖部分有22至62%的消耗量。而蔗糖的转化方面各乳酸菌消耗利用效率不一,其中Lactobacillus plantarum BCRC12327有较好的转化效果。棉子糖及水苏糖两种寡糖残留量，则各菌株至少都有76%以上。在棉子糖及水苏糖的重量和对总糖重量的比例部分，Lactobacillus plantarum表现相对较佳(参见表I)。
[0075]表1、比较几种乳酸菌的糖质转化效果
[0076]