专利名称：包含寡糖和中链脂肪酸的饲料添加剂的制作方法在当今的动物生产系统中，肠内菌群与其宿主之间存在微妙的平衡，破坏该平衡(例如通过细菌感染)对动物的总效率有不良影响(Eckel，1999)。了解动物中肠道微生物感染问题为受营养观念影响的生物调节方法、通过稳定肠内菌群降低腹泻频率甚至死亡频率的全新途径开启了大门。过去，通过向饲料中添加作为生长刺激剂的抗生素部分地解决 了这些感染问题。目前，在发现传统抗微生物剂(例如，青霉素)的数十年之后，许多细菌变得对抗微生物剂有抗性，并且在许多情况对多种抗微生物剂有抗性(Guillot，1989)。该抗性表现为每年致死数千人，并导致较高的医疗和经济成本(Barton，1998)。对抗微生物剂产生免疫的问题是普遍存在的，并且部分地由世界范围内在动物营养中使用抗微生物剂所引起，因为抗生物剂添加至食物配方中导致更高的效率(降低的饲料转化率(feed conversion)和更快的生长)(Dupont和Steele，1987)，以及因为超过所有抗微生物剂一半的使用与动物生产相关(Aarestrup, 1999)。在一些国家(例如在欧洲共同体中)，这已导致普遍禁止所有抗微生物剂在食物配方中用作生长增强剂(Muirhead，1998)。当今使用的大多数传统抗微生物剂和其他生长促进剂的问题是它们在胞内水平上攻击细菌(Guillot，1989)。特别地，它们抑制与合成细胞构件相关的关键酶。在该方法中，细菌可以在所涉及的酶中产生突变，或者它们可以产生将抗微生物剂迅速泵出细胞的机制。或者它们可以产生直接降解抗微生物剂的酶(例如，β -内酰胺酶)(Neu等，1980)。通过质粒转移(经微生物接合)，抗性可以从一个微生物细胞迅速地转移至另一微生物细胞(抗性的扩展)(Finland, 1971)。由于对将传统抗微生物剂用作动物营养中的生长促进剂的全球消极反应，所以进行研究以开发新型(天然的)抗微生物剂或生长促进剂(特别是基于替代方法的那些)(Mazza，1998)。目前，对替代(天然)抗微生物剂的寻找主要集中于使用数种(有机)酸(Eckel, 1997)、新的活性益生菌(probiotics) (Chiquet 和 Banc Hair, 1998)、益生元(prebiotics) (Olsen, 1996)、酶(Hruby 和 Cowieson, 2006)、一些植物(洋葱和大蒜)以及草药提取物(精油)(De Koning 和 Hongbiao, 1999)。目前，不同类型的寡糖用于多种应用中。W02006/022542描述了组合使用不消化的寡糖和可消化的半乳糖来治疗和/或预防呼吸道感染。W02004/074496描述了使用由半乳糖和葡萄糖组成的寡糖以产生在动物胃肠道中的有益细菌。JP2002226496描述了通过水解对大肠杆菌(E. coli)和弧菌(Vibrio)有抗感染活性的多糖(例如，岩藻多糖(fucoidan))而获得的寡糖。CN1370784描述了几丁质胺(chitinamine)寡糖，其可潜在地用于治疗癌症以及治疗肝功能障碍，改善肠道的功能并治疗和预防衰老。JP2002121138描述了使用来自鸡蛋黄的寡糖，特别是唾液酸寡糖(sialyloligosaccharide)、寡糖结合蛋白和寡糖肽以保护胃肠道不受感染。US6069137描述了通过施用与二氧化硅颗粒通过连接物共价结合的寡糖(包含β_半乳糖)来治疗由产肠毒素性大肠杆菌所导致的旅行性腹泻，其中所述颗粒由胃肠道分泌。ΕΡ1018342描述了使用可以从胃肠道排出的固体惰性亲和载体治疗SLT介导的肠道感染，所述载体与二糖共价结合且对SLT具有亲和力。US5939397描述了通过施用1-3寡糖治疗霍乱的方法，1-3寡糖对一种或更多种霍乱弧菌(V. cholerae)血清型有亲和力，其通过连接物与固体惰性载体结合。多种类型的MCFA也用于数种应用中。关于这点，EP1294371描述了特定MCFA作为微生物且特别是细菌和真菌污染和生长的抑制剂。具体地，EP1294371描述了使用基本等量的辛酸(CS)和癸酸(ClO)作为抗微生物剂，其主要在酸性环境(例如，胃)中有活性。本发明的目的是开发对微生物生态系统具有改善作用的饲料添加剂。具体地，本发明希望提高饲料添加剂的特异性和活性以及使其更快地发挥作用以改善肠微生物生态系统。本发明引入生长促进剂的特定组合，其对动物生产效率、饲料转化率、营养、个体的健康和福利(wellbeing)具有协同的有益作用。在这一点上，可以认为三和/或四寡糖与MCFA的组合使用是具有生长刺激特性的新的和创新的制剂。
首先，本发明涉及饲料添加剂，其包含-碳水化合物的寡聚体，优选碳水化合物组分的同三聚体、异三聚体、同四聚体和/或异四聚体，其衍生物或提取物，或者其混合物，其中所述碳水化合物组分选自戊糖(pentose saccharide)和己糖(hexose saccharide)、葡萄糖醒酸和半乳糖醒酸,其中所述碳水化合物组分通过α或β键连接；和-中链脂肪酸(MCFA)或者其盐或衍生物和/或混合物，其中所述MCFA选自己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)和月桂酸(C12)。本发明的发明人出乎意料地证明了组合使用上述寡糖和上述MCFA完全出乎意料地协同性地提高动物生产效率。这种协同作用以不同的方式示出。起初，所述饲料添加剂引起获得所施用的饲料添加剂之个体的日生长速率升高。所述饲料添加剂还提供升高的日摄食量。使用所述饲料添加剂还引起死亡率降低。此外，这允许显著地降低抗生素的使用。本文所述饲料添加剂的另一优点是使肠病原体特异性地灭活并将其清除，而有益的胃肠菌群不受不良影响。虽然本文所述饲料添加剂使日摄食量升高，以及使日增重升高，但是与单独使用寡糖和MCFA相比，组合使用本文所述的寡糖和MCFA完全出乎意料地通过降低饲料转化率(由日摄食量与日增重的比值确定的参数)引起效率提高。这意味着由于本文所述饲料添加剂的协同活性，与单独使用寡糖和MCFA相比，日生长速率的升高出乎意料地大于日摄食量的升高，导致效率的提高，因而导致饲料转化率下降。在一种饲料添加剂中相组合的本文所述寡糖和MCFA的协同作用还得到了免疫遗传学上的支持。其中单独施用所述寡糖和MCFA均引起免疫应答下降(通过失活和排泄肠病原体的提高)，施用寡糖和MCFA的组合制剂引起免疫活性的协同性降低。所述寡糖和MCFA的协同作用进一步得到只有组合施用才引起所述作用之观察结果的支持。相反，依次施用本文所述的寡糖和MCFA不引起所述协同作用。此外，组合施用所述寡糖和MCFA对于本领域技术人员而言是违反直觉的(counter-intuitive),这是因为MCFA是油溶性的，而寡糖是水溶性的。本发明的发明人出乎意料地发现，从溶解性的观点来看，本文所述的配制方法允许将不相容的构成组分组合成为一种组合物。不希望受到理论约束，本发明的发明人认为三和四寡糖与MCFA的协同作用是基于两种试剂的特定作用方式。例如，在胃中(其为酸性环境)和在小肠的近端部分(其为弱酸性环境)由MCFA清除特定肠病原体(例如，肠杆菌(Enterobacteriaceae)),然后在胃肠道中由三和四寡糖选择性地凝集和排泄存活的和/或有抗性的肠病原体，同时还阻止黏附至肠壁。之前从未描述用于家畜饲养(cattle breeding)中的其他类型生长促进剂的这种组合协同作用。所述寡糖和MCFA的互补作用方式完全出乎意料地引起对动物生产效率的协同作用。因所述寡糖和MCFA的不同机制，这种协同作用甚至是更出乎意料的，一方 面，在胃的酸性环境中由所述MCFA特异性失活肠病原体，另一方面在胃肠道中由所述三和四寡糖特异性地凝集和排泄肠病原体。可以预想这种其中本文所述饲料添加剂的组分之间未发生任何功能性作用的解稱作用机制(decoupled processing mechanism)不能引起本文所述的协同作用。另一方面，本发明涉及包含本文所述饲料添加剂的食物。另一方面，本发明涉及本文所述的饲料添加剂或食物在制备用于以下的组合物中的用途-改善动物胃肠道中的微生物生态系统，-选择性地控制和调节动物胃肠道中的肠病原体，-通过抑制和凝集特定肠病原体来优化胃肠道的微生物定植，-提高增重，降低饲料转化率，以及改善营养值、动物的健康和动物的福利，和/或-在家畜饲养中促进比生长(specificgrowth)。本发明还涉及通过施用所述食物或饲料添加剂来获得上述作用的方法。图I :三和/或四甘露糖寡糖使得A)病原体猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)凝集，但不使B)非病原性食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)凝集。发明详述本发明涉及改善胃肠道中的微生物生态系统以提高家畜生产效率(尤其是日增重、饲料转化率、营养值、动物的健康和动物福利)的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含-碳水化合物组分的寡聚体，优选为碳水化合物的同三聚体、异三聚体、同四聚体和/或异四聚体，或者其衍生物或其提取物，或者其混合物，其中所述碳水化合物组分选自戊糖、己糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，并且其中所述碳水化合物组分通过α或β键连接，和-中链脂肪酸(MCFA)或者其盐或衍生物和/或混合物，其中，所述MCFA选自己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)和月桂酸(C12)。除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术和科学术语)具有由本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导(包括术语定义)来更好地理解本发明的教导。如本文所使用的那样，下列术语具有下列含义除非上下文清楚地指出，否则本文所使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，“区室”是指一个或多于一个区室。本发明所使用的“包含”与“包括”是同义词，并且是包容式或开放式术语，其指明存在以下例如组分但不排除存在本领域技术人员已知的或本文中公开的其他未引用组分、特征、要素、成员、步骤。
通过端点引用的数字范围包括包含于该范围内的所有数字和分数以及所引用的端点。除非另有定义，否则在此和贯穿本说明书的表达方式“按重量计(重量百分比)是指各组份基于制剂总重量的相对重量。“饲料添加剂”是指以小量加入可食用组合物(如可以被动物和/或人食用的食物或营养物)以改善该可食用组合物的物质、制剂或组合物。该改善意指该可食用组合物对食用其的个体有有益作用。可以通过例如增重、摄食量、饲料转化率、感染压(infectionpressure)和/或感染程度、动物福利、动物健康等参数来确定所述有益作用。饲料添加剂意指其适于被动物或人消耗。在一个优选实施方案中，本文所述的本发明饲料添加剂使得可将胃肠微生物病原体的量降低超过25%、更优选超过50%、更优选超过75%和最优选100%。“碳水化合物组分的寡聚体”是指寡糖。可根据本发明使用的寡糖包含通过α或β键或者α与β键之组合共价键合的至少两个糖单体。根据本发明，可使用寡糖的L或D异构体。糖单体可以是非环形式或环形式的醛糖或酮糖。根据异头碳的OH基团的位置，环形式的糖单体可以是α或β异构体。可使用非环形式糖单体的L或D异构体。术语“寡糖”为技术人员所知晓，且意指短链的共价键合的糖(或糖或碳水化合物)单体。可根据本发明使用的寡糖包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖单体。寡糖可具有分支或无分支形式。本文所述的“分支”意指寡糖包含至少一个与多于两个其他单糖残基连接的单糖残基，其中至少一个所连接的单糖残基不位于寡糖的纵向上。本发明的发明人已证明病原体优选地被三和/或四寡糖所凝集。因此，在一个优选实施方案中，寡糖由三或四个糖单体组成。根据本发明，寡糖的实施方案是同三聚体、异三聚体、同四聚体或异四聚体。同寡聚体(同聚体)由相同的糖单体构成，而异寡聚体(异聚体)由不同的糖单体(尤其是2、3、4或更多种不同的糖单体)构成。本文所述寡糖的优点是可以使用它们而无需为它们提供(惰性)载体。此外，本文所述的寡糖仅对肠病原体有选择性作用而对非病原性胃肠微生物群落无作用。在一个实施方案中，所述寡糖的衍生物、提取物和/或混合物可用于饲料添加剂中。术语“衍生物”定义为经修饰的寡糖。作为一个非限制性实例，衍生物是氧化或取代形式的寡糖。例如，氧化寡糖的糖单体组分(其中糖单体是半乳糖)将导致形成半乳糖醛酸。根据本发明，“提取物”意指可作为包含寡糖之组合物的提取物或(经纯化)浓缩物而提供寡糖。在一个实施方案中，本发明描述了饲料添加剂，其中戊糖选自核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖(Iyxose)。在另一个实施方案中，本发明描述了饲料添加剂，其中所述己糖选自阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔洛糖(talose)、甘露糖(mannose)。本文所述的术语“碳水化合物”是指由碳原子、氢原子和氧原子组成的有机化合物。因此，该术语包括但不限于有机化合物，例如单糖、二糖或者羧酸(例如，乳酸、葡萄糖酸和葡萄糖醛酸)。
在另一个实施方案中，本发明描述了饲料添加剂，其中MCFA以以下形式提供游离MCFA，所述MCFA的甘油单、二和/或三酯，和/或该MCFA的NH4+-、Na+-、K+-和/或Ca2+-盐。甘油二酯中通过酯键与甘油键合的两个脂肪酸可以是相同的或者可以是不同的脂肪酸。甘油三酯中通过酯键与甘油键合的三个脂肪酸可以是三个都是相同的脂肪酸，或者可以是三个不同的脂肪酸，或者两个相同脂肪酸与一个不同脂肪酸的任意组合。本文所述的术语“中链脂肪酸”或“MCFA”是指具有中链长度的脂肪酸，并且其中所述脂肪酸可以是饱和或不饱和的。不饱和脂肪酸可包含顺式或反式构型。根据本发明，MCFA包含6至12个碳原子，尤其是己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(ClO)或月桂酸(C12)。在一个实施方案中，本文所述的MCFA的盐、衍生物和/或混合物用于根据本发明本文所述的饲料添加剂中。使用盐防止使用游离脂肪酸时可能发生的气味扩散。本文所述的术语“MCFA的衍生物”是指其中羧基可逆地转化为另一基团(除盐以外)的MCFA，优选但不限于酰胺、酯或甘油酯。本文所述的术语“游离MCFA”是指未被转化为盐或衍生物(例如，酰胺、酯或甘油酯)的MCFA。本文所使用的术语“MCFA盐”是指脂肪酸的盐。在一个实施方案中，MCFA被化学地修饰，并且它们提供有侧链，所述侧链包括但不限于一种或更多种烷基，优选Cl-Cio烷基，特别是甲基或乙基。在根据本发明的一个实施方案中，所述饲料添加剂包含如本文所述的附加原料(添加剂)和/或促生长物质。在一个优选实施方案中，所述添加剂选自香精和草药提取物。在另一个优选实施方案中，促生长成分选自抗生素、益生菌、益生元、精油、酶、月旨肪酸和(无机)有机酸。可用于本发明的一个实施方案中的有机酸的非限制性实例包括C1-C12羧酸，特别是未被取代的羧酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸；和/或取代羧酸如肥酸(adipic acid)、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、酒石酸，包括环羧酸如皮考啉酸(picolinic acid)。有机酸可以是一种或更多种取代或未被取代的羧酸及其混合物，以及饱和的、未饱和的、环羧酸和/或脂肪羧酸或其混合物，及其金属复合物和/或盐，及其外消旋体和/或对映体形式。可用于本发明的一个实施方案中的无机酸的非限制性实例包括小量的强酸如高氯酸(高氯酸氢)、碘化氢、溴化氢(氢溴酸)、氯化氢(盐酸)、硫酸和硝酸以及无机弱酸如磷酸、氢氟酸、次氯酸和亚硝酸。在根据本发明的一个实施方案中，所述饲料添加剂中的寡糖以液体或固体形式存在。在根据本发明的另一个实施方案中，饲料添加剂中的MCFA以液体或固体的形式存在。在根据本发明的另一个实施方案中，以固体或液体形式配制所述饲料添加剂。术语“固体”具体地定义为粉末。术语“液体”具体地定义为水溶液或油中的溶液。根据本发明所述的寡糖是水溶性的并且可以提供为粉末以及水溶液。根据本发明的本文所述MCFA是油溶性的并且可以提供为粉末以及油溶液。己酸也是水溶性并因此也可以提供为水溶液。本文所述的饲料添加剂可以包括寡糖粉末和MCFA粉末、寡糖粉末和MCFA油溶液、寡糖水溶液和MCFA粉末、寡糖水溶液和MCFA油溶液(其产生乳液)或者寡糖水溶液和MCFA水溶液(在MCFA是己酸的情况下)。在一个实施方案中，本文所述的寡糖的浓度为按饲料添加剂的重量计至少1、5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%。在另一个实施方案中，本文所述的MCFA的浓度为按饲料添加剂的重量计至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%。在另一个实施方案中，本文所述的寡糖的量(基于干重)为lg/100g饲料添加剂(按重量计I % )至50g/100g饲料添加剂(按重量计50% )，优选25g/100g饲料添加剂(按重量计25%)。在另一个实施方案中，本文所述 的MCFA的量(基于干重)为lg/100g饲料添加剂(按重量计1% )至70g/100g饲料添加 剂(按重量计70% )，优选35g/100g饲料添加剂(按重量计35% )。这意味着本文所述的MCFA和寡糖之组合制剂的浓度为最大等于按饲料添加剂重量计的100%。本发明还涉及可食用组合物，特别是包含本文所述的饲料添加剂的膳食(产品)、食物或食物组合物。在一个实施方案中，根据本发明并且如本文所述的食物包含按重量计至多1%的寡糖(或者提取物、衍生物或混合物)。在另一个实施方案中，根据本发明并且如本文所述的食物包含按重量计至多10%的MCFA (或者盐、衍生物或混合物)。在另一个实施方案中，所述食物包含以下量(基于干重)的本文所述寡糖(或者提取物、衍生物或混合物)
0.01g/100g食物(按重量计O. 01% )至2g/100g食物(按重量计2% )，优选O. 05g/100g食物(按重量计0.05%)。在另一个实施方案中，所述食物包含以下量(基于干重)的本文所述MCFA (或者盐、衍生物或混合物)0· 01g/100g食物(按重量计O. 01% )至lg/100g食物(按重量计1% )，优选0.07g/100g食物(按重量计0.07% )。根据本发明并且如本文所述，所述饲料添加剂或饲料可以用于控制、调节和/或特异性地清除动物或人胃肠道中的肠病原体。饲料添加剂或饲料通过本文所述寡糖和MCFA的双重且协同作用引起改善胃肠道中的微生物生态系统。在该过程中，肠病原体不仅被清除，它们还凝集并排出机体，从而使所杀灭病原体的毒性作用最小化。本发明的另一优点是仅清除和去除肠病原体，而保留有利的或非病原性的肠胃微生物群落(例如，乳酸菌)。与“有利的或非病原性肠胃微生物群落”相反，本文中将“(肠)病原体”定义为对宿主具有不利作用的微生物，特别是导致疾病或紊乱的那些。另一些形式的不利作用是降低日摄食量、降低日增重、提高饲料转化率以及通常降低健康和福利。 在根据本发明并且如本文所述的一个实施方案中，所述饲料添加剂或饲料可用于选择性地清除、抑制或调节选自以下的一种或更多种肠病原体丝状微生物和具有黏着结构的微生物、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、酵母和病毒。在另一实施方案中，肠病原体选自短螺旋体属(Brachispira)、弧菌属(Vibrio)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)(包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和Salmonella java)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)(包括但不限于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴区鸟弯曲杆菌(Campylobacter laris)和乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)、螺杆菌属(Helicobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)和梭菌属(Clostridium)的细菌病原体；优选猪痢疾短螺旋体；青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、头孢霉属(Cephalosporum)、酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、半知菌属(Fungi imperfecti)和半子囊菌属(Hemiascomycetes)的酵母和真菌病原体；以及诺如病毒属(Norovirus)和轮状病毒属(Rotavirus)的病毒病原体。一方面，本发明涉及通过施用根据本发明的本文所述饲料添加剂或饲料来抑制、清除、排泄、消灭(demise)、调节和/或控制上述肠病原体的方法。另一方面，本发明涉及通过施用根据本发明的本文所述饲料添加剂或饲料来提高个体的健康、日增重和日摄食量以及提闻词料转化率，以及通常提闻福利的方法。
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在一个实施方案中，根据本发明并且如本文所述，向选自以下的动物施用所述饲料添加剂或饲料鱼、两栖动物、爬行动物、鸟和哺乳动物，包括但不限于成年或幼年的反刍动物、绵羊、山羊、牛、猪、马、家禽、鸡、动物(例如，狗、猫、兔、仓鼠、豚鼠)，且优选选自家禽、猪、反刍动物和人。通过进一步说明本发明的以下非限制性实施例进一步描述本发明，这并非旨在也不应当解释为限制本发明的范围。认为本发明不受任何形式的前述实现方式的限制，并且可以向所表述的实施例中加入一些修改而无需重新评价所附的权利要求书。
实施例实验I :三 / 四半乳糖醒酸寡糖(tri/tetra-galacturon-oligosaccharide)和MCFA的混合物对猪之效率的影响用下列饲料饲喂3 X 147头小猪(I)补充有按重量计O. 05%三/四半乳糖醛酸寡糖的对照饲料；(2)补充有按重量计O. 07% MCFA的对照饲料，以及(3)补充有按重量计O. 05%三/四半乳糖醛酸寡糖和按重量计O. 07% MCFA之混合物的对照饲料。对照饲料是由适于饲喂动物之物质构成的膳食。不限量地提供水。在该实验期间，3周之后评估日增重、日摄食量、饲料转化率和死亡率。结果归纳于表I中。所使用的MCFA 是 C6-C12 MCFA。表I


本发明涉及饲料添加剂和包含该饲料添加剂的饲料，所述饲料添加剂包含1)选自以下的碳水化合物组分的同三聚体、异三聚体、同四聚体和/或异四聚体戊糖、己糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，和2)选自以下的中链脂肪酸(MCFA)己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(C10)和月桂酸(C12)。本发明还涉及使用所述饲料添加剂或饲料通过选择性清除肠病原体以改善动物生产的效率，例如增重、饲料转化率、营养值、健康和福利。