专利名称：神经氨酸苷酶的纯化方法N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，俗称唾液酸(Sialic acid, SA)，主要分布于哺乳动物体内，血管内皮细胞内含量尤其丰富。人体血清中总唾液酸 (total sialic acid，TSA)含量约为1. 5 2. 5mmol/L，包括游离唾液酸和结合唾液酸。其中游离唾液酸的含量较低，约为1 3ymol/L;与脂蛋白和糖蛋白结合的唾液酸即结合唾液酸，是血清中唾液酸的主要存在形式。正常代谢时，人体血清中唾液酸含量稳定。当组织细胞恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血， 是血液中唾液酸含量升高的原因之一。许多研究发现带瘤动物及肿瘤患者的瘤体及血液中唾液酸含量增加并随病情的加重而升高、随病情的缓解而降低，因此在临床检验中唾液酸常被作为恶性肿瘤存在和发展监控的一个指标，被广泛地应用于很多肿瘤的诊断和监控中。目前，在临床检验中，通常通过神经氨酸苷酶(Neuraminidase，ΝΑ)来进行检测血清样本中的唾液酸含量。其反应原理为神经氨酸苷酶催化水解与糖蛋白、寡糖连接的N-乙酰神经氨酸残基，使唾液酸糖苷键断裂生成游离的N-乙酰神经氨酸，N-乙酰神经氨酸在神经氨酸醛缩酶的作用下生产成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸与NADH在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸和NAD+，而NADH在340nm有特异性吸收，通过检测NADH的减少量就可以检测出血清样本中的唾液酸含量。其反应过程如下神经氨酸苷酶唾液酸(结合型)-^ N-乙酰神经氨酸神经氨酸醛缩酶 N-乙酰神经氨酸- N-乙酰甘露糖胺+丙酮酸LDH丙酮酸+ NADH + H+- 乳酸+ NAD+该检测方法具有操作简单快捷、准确安全、可自动化分析等优点，被广泛应用于临床医学检验中。但由于血清中N-乙酰神经氨酸与糖蛋白、寡糖可以α 2_3、α 2_6、α 2_8、α 2_9键等多种形式连接，而目前神经氨酸苷酶由于纯度不高等原因，使其底物特异性结合能力低， 不能和全部的与糖蛋白、寡糖连接的N-乙酰神经氨酸残基特异性结合，从而导致N-乙酰神经氨酸残基不能全部从糖蛋白、寡糖上解离下来，最终影响了该检测方法的检测精确度。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种神经氨酸苷酶的纯化方法，该方法纯化得到的神经氨酸苷酶纯度高、底物特异性结合能力高，用该神经氨酸苷酶进行检测人体血清中唾液酸含量精确度高。
本发明所采用的技术方案为
一种神经氨酸苷酶的纯化方法，包括以下操作步骤
(1)超滤浓缩量取产脲节杆菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的发酵液上清1 20L,进行膜超滤，用缓冲液A对超滤后的浓缩液进行稀释至0. 5 10L，稀释具体为进行对半稀释操作3 5次；
(2)硫酸铵沉淀缓慢加入226 516g硫酸铵，搅拌20 40min后静置1 5h， 5000 15000g离心10 30min，去上清，沉淀用缓冲液B溶解到100 1000ml，搅拌充分后透析过夜，透析后样品电导< 1. 5ms/cm ；
(3) DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析DEAE琼脂糖凝胶FF柱用缓冲液B平衡后，将透析后样品进行上样，缓冲液B平衡，缓冲液C洗脱，收集洗脱样品；
(4)苯基琼脂糖凝胶FF柱层析往收集的洗脱样品中加入(NH4)2SO4使终浓度达到 0. 6 0. 8M，然后苯基琼脂糖凝胶FF柱用缓冲液D平衡，将加入了(NH4) 2S04的洗脱样品进行上样，缓冲液D平衡，缓冲液E洗涤，缓冲液F洗脱；
(5)将步骤(4)得到的洗脱样品进行超滤浓缩后用缓冲液B进行换液，然后冻干。
以上操作均在0 5 °C条件下进行。
以上缓冲液々、8、(、03、？分别是
缓冲液A 10 IOOmM Tris-HCl, 100 500mM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；
缓冲液B :10 IOOmM Tris-HCl, ρΗ 6. 5 8. 5 ；
缓冲液C :10 IOOmM Tris-HCl, 10 IOOOmM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；
缓冲液D 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 7 0. 9M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；
缓冲液E 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 4 0· 6M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；
缓冲液F 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 2 0· 4M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5。
经过实验表明，通过本发明纯化方法得到的神经氨酸苷酶纯度高、底物特异性结合能力高，用该神经氨酸苷酶进行检测人体血清中唾液酸含量精确度高。


附图所示的是本发明神经氨酸苷酶的纯化方法中神经氨酸苷酶的SDS-PAGE电泳图。其中，条带1 对照例2的神经氨酸苷酶样品；条带2 对照例1的神经氨酸苷酶样品； 条带3 实施例1的神经氨酸苷酶样品；条带4 实施例2的神经氨酸苷酶样品；条带5 实施例3的神经氨酸苷酶样品。

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1
一种神经氨酸苷酶的纯化方法，包括以下操作步骤
(1)超滤浓缩量取产脲节杆菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的发酵液上清1L，进行膜(中空纤维膜，型号uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超滤，用缓冲液A对超滤后的浓缩液采用对半稀释操作4次的方法进行稀释至0. 5L ；
(2)硫酸铵沉淀缓慢加入226g硫酸铵，搅拌30min后静置lh，5000g离心lOmin， 去上清，沉淀用缓冲液B溶解到100ml，搅拌充分后在IL缓冲液B中透析(透析袋CMW8000) 过夜；
(3) DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析DEAE琼脂糖凝胶FF柱(25mmX 15cm)用缓冲液B 平衡后，将透析后样品进行上样，缓冲液B平衡，缓冲液C洗脱，收集洗脱样品；
(4)苯基琼脂糖凝胶FF柱层析往收集的洗脱样品中加入(NH4)2SO4使终浓度达到0.6M，然后苯基琼脂糖凝胶FF柱(25mmX15cm)用缓冲液D平衡，将加入了(NH4)2SO4W 洗脱样品进行上样，缓冲液D平衡，缓冲液E洗涤，缓冲液F洗脱；
(5)将步骤(4)得到的洗脱样品进行超滤浓缩(P2B010A05，MILLIP0RE)后用缓冲液B进行换液，然后冻干。
以上操作均在O 5 °C条件下进行。
以上缓冲液A、B、C、D、E、F分别是
缓冲液A =IOmM Tris-HCl, IOOmM NaCl，pH 6. 5 ；
缓冲液B =IOmM Tris-HCl, pH 6. 5 ；
缓冲液C =IOmM Tris-HCl, IOOmM NaCl，ρΗ6· 5 ；
缓冲液D =IOmM Tris-HCl, 0. 7M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 ；
缓冲液E =IOmM Tris-HCl, 0. 4M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 ；
缓冲液F =IOmM Tris-HCl, 0. 2M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5。
取冻干的样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见附图中条带3。
将上述方法纯化得到的神经氨酸苷酶对待测血清样品1 5中的唾液酸进行检测，采用的方法如下取100 μ 1血清加入到880 μ l，pH 7. 5,0. IM Tris-HCl缓冲液(Sigma) 中，加入Img上述方法纯化得到的神经氨酸苷酶和1 μ 1 N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Roche)， 37°C水浴孵育lOmin，空白调零，再往反应杯中加入0. 6mg β -NADH(Sigma)，混勻，读取 340nm吸光度值(Atl)，加入1 μ 1乳酸脱氢酶(sigma)，混合均勻，37°C水浴孵育lOmin，记录 340nm吸光度(A1)，神经氨酸酶对血清中结合唾液酸的解离活性以A1-Atl表示，结果见表1。
实施例2
一种神经氨酸苷酶的纯化方法，包括以下操作步骤
(1)超滤浓缩量取产脲节杆菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的发酵液上清20L， 进行膜(中空纤维膜，型号uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超滤，用缓冲液A对超滤后的浓缩液采用对半稀释操作4次的方法进行稀释至IOL ；
(2)硫酸铵沉淀缓慢加入516g硫酸铵，搅拌30min后静置釙，15000g离心 30min,去上清，沉淀用缓冲液B溶解到IOOOml，搅拌充分后在IOL缓冲液B中透析(透析袋 CMW8000)过夜；
(3) DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析DEAE琼脂糖凝胶FF柱(25mmX 15cm)用缓冲液B 平衡后，将透析后样品进行上样，缓冲液B平衡，缓冲液C洗脱，收集洗脱样品；
(4)苯基琼脂糖凝胶FF柱层析往收集的洗脱样品中加入(NH4)2SO4使终浓度达到0.8M，然后苯基琼脂糖凝胶FF柱(25mmX15cm)用缓冲液D平衡，将加入了(NH4)2SO4W洗脱样品进行上样，缓冲液D平衡，缓冲液E洗涤，缓冲液F洗脱；
(5)将步骤(4)得到的洗脱样品进行超滤浓缩(P2B010A05，MILLIP0RE)后用缓冲液B进行换液，然后冻干。
以上操作均在0 5 °C条件下进行。
以上缓冲液A、B、C、D、E、F分别是
缓冲液A =IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl，pH 8. 5 ；
缓冲液B IOOmM Tris-HCl, pH 8. 5 ；
缓冲液C IOOmM Tris-HCl, IOOOmM NaCl，ρΗ8· 5 ；
缓冲液D IOOmM Tris-HCl, 0. 9M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5 ；
缓冲液E IOOmM Tris-HCl, 0. 6M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5 ；
缓冲液F =IOOmM Tris-HCl, 0. 4M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5。
取冻干的样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见附图中条带4。
将上述方法纯化得到的神经氨酸苷酶对待测血清样品1 5中的唾液酸进行检测，检测方法同实施例1，检测结果见表1。
实施例3
一种神经氨酸苷酶的纯化方法，包括以下操作步骤
(1)超滤浓缩量取产脲节杆菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的发酵液上清5L， 进行膜(中空纤维膜，型号uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超滤，用缓冲液A对超滤后的浓缩液采用对半稀释操作4次的方法进行稀释至2. 5L ；
(2)硫酸铵沉淀缓慢加入361g硫酸铵，搅拌30min后静置lh，IOOOOg离心 15min,去上清，沉淀用缓冲液B溶解到500ml，搅拌充分后在IOL缓冲液B中透析(透析袋 CMW8000)过夜；
(3) DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析DEAE琼脂糖凝胶FF柱(25mmX 15cm)用缓冲液B 平衡后，将透析后样品进行上样，缓冲液B平衡，缓冲液C洗脱，收集洗脱样品；
(4)苯基琼脂糖凝胶FF柱层析往收集的洗脱样品中加入(NH4)2SO4使终浓度达到0.8M，然后苯基琼脂糖凝胶FF柱(25mmX15cm)用缓冲液D平衡，将加入了(NH4)2SO4W 洗脱样品进行上样，缓冲液D平衡，缓冲液E洗涤，缓冲液F洗脱；
(5)将步骤(4)得到的洗脱样品进行超滤浓缩(P2B010A05，MILLIP0RE)后用缓冲液B进行换液，然后冻干。
以上操作均在0 5 °C条件下进行。
以上缓冲液A、B、C、D、E、F分别是
缓冲液A :20mM Tris-HCl, 150mM NaCl，pH 7. 5 ；
缓冲液B :20mM Tris-HCl, pH 7. 5 ；
缓冲液C :20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl，ρΗ7· 5 ；
缓冲液D :20mM Tris-HCl, 0. 8M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5 ；
缓冲液E :20mM Tris-HCl, 0. 5M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5 ；
缓冲液F :20mM Tris-HCl, 0. 3M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5。
取冻干的样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见附图中条带5。
将上述方法纯化得到的神经氨酸苷酶对待测血清样品1 5中的唾液酸进行检测，检测方法同实施例1，检测结果见表1。
对照例1 用市售的神经氨酸苷酶(来源于Arthrobacter ureafaciens)进行 SDS-PAGE电泳，电泳结果见附图中条带2，并对待测血清样品1 5中的唾液酸进行检测， 检测方法同实施例1，检测结果见表1。
对照例2 用市售的神经氨酸苷酶(来源于Clostridium perfringens)进行 SDS-PAGE电泳，电泳结果见附图中条带1，并对待测血清样品1 5中的唾液酸进行检测， 检测方法同实施例1，检测结果见表1。
由附图可知，实施例1、实施例2、实施例3纯化的得到的神经氨酸苷酶蛋白SDS-PAGE电泳条带清晰、杂带鲜见，与市售神经氨酸苷酶(来源于ArthrcAacter ureafaciens，对照例1)类似，说明经过本发明的纯化方法得到的神经氨酸苷酶纯度高。
表

本发明提供了一种神经氨酸苷酶的纯化方法，它包括超滤浓缩；硫酸铵沉淀；DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析；苯基琼脂糖凝胶FF柱层析；然后换液，冻干。以上操作均在0～5℃条件下进行。用该方法纯化得到的神经氨酸苷酶纯度高、底物特异性结合能力高，用该得到的神经氨酸苷酶进行检测人体血清中唾液酸含量精确度高。