专利名称：降胆固醇剂,胆酸次级产生抑制剂,以及食品和饮料的制作方法图1是表示服用添加胆固醇的食物的试验组和服用未添加胆固醇的食物的试验组的血浆浓度。实现本发明的最好方式本发明的降胆固醇剂或食品和饮料中使用的酵母菌是属于假丝酵母属、伊氏酵母属、有孢汉逊氏酵母属、克勒克氏酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属或有孢圆酵母属的酵母菌。这些酵母菌可以单独使用或以两种或多种菌种结合的方式使用。上述酵母菌可以是活细胞、加热过的细胞、冻干产品、其碾磨产品，或其内含物。属于上述组的优选酵母菌实例包括乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、东方伊氏酵母(Issatrchenlcia orientalis)、Hanseniaspora(有孢汉逊氏酵母)uvarum、非洲克勒克氏酵母(Kloeckera africana)、马克斯克鲁维氏酵母(Kluyveromycesmarxianns)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、粉状毕赤氏酵母(Pichia fayinosa)和戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)。这些酵母菌中，最优选的酵母菌是下列酵母菌乳酒假丝酵母YIT 8237(FERM BP-7214，最初保藏日期为1999年，7月16日；保藏机构，国际贸易和工业部，国立生命科学和人体-技术研究所，工业科学和技术机构(地址1-3，Higashi1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本(下面都相同)))；Hanseniaspora uvarum YIT 8164(FERM BP-7212，最初保藏日期为1999年，7月16日)；东方伊氏酵母YIT 8266(FERM BP-7215，最初保藏日期为1999年，7月16日)；非洲克勒克氏酵母YIT 8165(FERMBP-7213，最初保藏日期为1999年，7月16日)；马克斯克鲁维氏酵母YIT 8292(FERM BP-7217，最初保藏日期为1999年，7月16日)；乳克鲁维氏酵母YIT 8263(FERM BP-7216，最初保藏日期为1999年，7月16日)；粉状毕赤氏酵母YIT 8058(FERM BP-7210，最初保藏日期为1999年，7月16日)；和戴尔凯氏有孢圆酵母YIT 8114(FERM BP-7211，最初保藏日期为1999年，7月16日)。自古以来，已知这些微生物是用于生产食品(酒、奶液、乳酪)的酵母菌，并且是对人体非常安全的菌株。上述菌株具有表1至表5中的所列特征。所述特征几乎与“TheYeast(酵母菌)，第三版”(N.J.W.Kreger-Van Rij，Elsevier SciencePublishers B.V.，Amsterdam，1984)中的公开的相似微生物的特征相同。表1菌株的特征 表2

表3

表4

表5

下面将描述在本发明次级胆酸产生抑制剂中使用的酵母。
对在本发明次级胆酸产生抑制剂中使用的酵母没有特别的限定。所述酵母包括培养所述酵母产生的活细胞、加热过的细胞、冻干产品、其碾磨产品，或其内含物。
从来没有关于本发明使用的酵母抑制胆酸或类似物质的7α-羟基的去除，由此来抑制次级胆酸如去氧胆酸的形成的报道。由于本发明利用了所述酵母抑制由初级胆酸到次级胆酸的转化，从强烈抑制7α-脱羟基化作用的角度看，对初级胆酸如特别是胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和鹅去氧胆酸具有强吸附力以及对提高短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸的肠内浓度具有很强作用力的酵母是优选的。
在次级胆酸的产生抑制剂中优选使用的酵母实例包括伊氏酵母属、克鲁维氏酵母属、有孢汉逊氏酵母属、糖酵母属、丝状毕赤氏酵母属、假丝酵母属、有孢圆酵母属、毕赤氏酵母属和接合糖酵母属。这些酵母可以单独使用或以两种或多种菌种结合的方式使用。
实例包括东方伊氏酵母、马克斯克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、耐热(thermotolerans)克鲁维氏酵母、Hanseniaspora uvarum、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大连(dairensis)糖酵母、微小(exiguus)糖酵母、单孢(unisporus)糖酵母、巴杨氏(bayanus)糖酵母、Hyphopichia burtonii、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、Candida etchellsii、涎沫(zeylanoides)假丝酵母、马铃薯(solani)假丝酵母、麦芽糖(maltosa)假丝酵母、热带(tropicalis)假丝酵母、Candida cylindracea、产朊(utilis)假丝酵母、戴尔凯氏有孢圆酵母、Pichia anomala、Pichia holstii和Zygosaccharomyces rouxii。其中，最优选的酵母是下列酵母东方伊氏酵母YIT 8266(FERM BP-7215)；马克斯克鲁维氏酵母YIT 8292(FERM BP-7217)；乳克鲁维氏酵母YIT 8263(FERMBP-7216)；耐热克鲁维氏酵母YIT 8294(ATCC 20309)；Hanseniasporauvarum YIT 8164(FERM BP-7212)；啤酒糖酵母YIT 8116(ATCC 48554)；大连糖酵母YIT 8191(CBS 3007)；微小糖酵母YIT 8109(CBS 3019)；单孢糖酵母YIT 8226(FERM BP-7209，最初保藏日期为1999年，3月25日；保藏机构，国际贸易和工业部，国立生命科学和人体-技术研究所，工业科学和技术机构(地址1-3，Higashi1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本(下面都相同)))；巴杨氏糖酵母YIT 8128(CBS 380)；Hyphopichia burtonii YIT 8299(CBS 2352)；乳酒假丝酵母YIT 8237(FERM BP-7214)；Candidaetchellsii YIT 8278(ATCC 60119)；涎沫假丝酵母YIT 8018(IFO0719)；马铃薯假丝酵母YIT 8023(CBS 1908)；麦芽糖假丝酵母YIT 8283(ATCC 28140)；热带假丝酵母YIT 8286(CBS 94)；Candidacylindracea YIT 8276(ATCC 14830)；产朊假丝酵母YIT 8204(ATCC9950)；戴尔凯氏有孢圆酵母YIT 8313(JCM 2204)和YIT 8133(IFO1172)；Pichia anomala YIT 8298(JCM 3587)和YIT 8297(JCM3583)；Pichia holstii YIT 8038(ATCC 58048)和Zygosaccharomyces rouxii YIT 8129(CBS 732)。
自古以来，这些酵母被用来生产食品(酒，乳酪)，并且对人体来说这些酵母被认为是安全微生物。其细胞是具有几微米粒径大小的微粒，与具有20μm或更大的微粒相比极易被吸收，后者被吸收时产生不舒服的感觉。上述酵母，例如东方伊氏酵母YIT 8266(FERMBP-7215)，具有如表6所示的特定特征。所述特征几乎与“The yeast，第3版”(N.J.W.Kreger-Van，Rij，Elsevier Science PublishersB.V.，Amsterdam，1984)中公开的相似酵母的那些特征相同。
表6 东方伊氏酵母YIT 8266的特征

本发明的酵母菌可以通过常规方法来制备；在含有酵母抽提物和聚胨的复合培养基中或在主要含有一种无机盐的合成培养基中进行培养。
由此产生的酵母菌能够以下面的形式进行应用活细胞、其冻干产物、通过加热或类似处理获得的死细胞、其碾磨产物或其内含物，药物组合物或食品和饮品。另外，还能使用通过商业途径获得的酵母。
通过常规方法和药学上可接受的载体，上述酵母能够形成多种药物泡沫体的药物组合物。如果制备口服的固体药物，上述酵母菌就与一种载体和可选择的添加剂如一种粘合剂、一种崩解剂、一种润滑剂、一种着色剂、一种调味剂和一种芳香剂相混合，并且通过一种常规的方法将得到的所述混合物制成片剂、包衣片剂、粒剂、粉剂或胶囊。本领域中使用的添加剂可被用作上述添加剂。实例包括载体如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、和硅酸；粘合剂如水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、磷酸钙和聚(乙烯吡咯烷酮)；崩解剂如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸甘油单酯和乳糖；润滑剂如纯滑石粉、硬脂酸盐、硼砂和聚乙二醇；和调味剂如白糖、桔皮、柠檬酸和酒石酸。
如果制备口服的液体药物，上述酵母菌就与添加剂如一种调味剂，一种缓冲液，一种稳定剂和一种芳香剂相混合，并且通过一种常规的方法将得到的所述混合物制成口服液体、糖浆和酏剂。也可以使用上述调味剂。缓冲液的实例包括柠檬酸钠，以及稳定剂的实例包括黄蓍胶、阿拉伯胶和明胶。
本发明的食品和饮料可以通过将上述酵母菌加到各种食品和饮料中来制备。优选的食品和饮料的实例包括发酵奶、果汁混合饮料、汤、米粉糕和饼干。动物饲料也被包括在食品和饮料中。
上述药物中加入的酵母菌的量随着药物形式和用药病人的状况而变化。通常，药物中的含量为1-100重量％是优选的。上述药物或食品和饮料的每日剂量随着病人的状况、体重、年龄、性别等而变化，而且不能被测定为固定值。通常，每个成人每日基于酵母的剂量大约是10mg至30g，优选地大约1-5g。所述酵母的用药优选地是以等分的形式每日一次或每日2-4次。
实施例本发明将通过下面的实施例更加详细地来进行描述，这些实施例不应解释为对本发明的限制。本文使用的“％”指的是“重量％”。
实施例1(A)酵母菌的制备将一铂环保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中的每一种不同的酵母菌接种到装在坂口烧瓶(500ml)中的表7中所示的培养基(100ml)中，该培养基在30℃下进行振荡培养(120rpm)。
开始培养两天后，所述培养物(相当于两个坂口烧瓶的量)被接种到10-升发酵罐(有效体积7L)中，并且在30℃下进行两天的有氧搅拌培养，培养条件是0.5vvm的通气速率，250rpm的搅拌速率和6.0的pH(通过5N的氢氧化钠自动调控)。
完成培养后，采用冷却离心机分离上清液和细胞，并用蒸馏水将所分离的细胞洗涤两次。经洗涤的细胞被放置在2-L的锥形瓶中，并加入蒸馏水(1L)。在高压消毒锅中将所述混合物加热到115℃保持10分钟。将这种经加热的细胞冻干。
表7用于预培养和培养的培养基组合物

(B)试验食物的制备通过利用(A)中制备的酵母菌，按照常规方法混合各组分来制备含有表8所示各组分的食物。每一种食物含有胆固醇；即，胆固醇(0.5％)和胆酸钠(0.25％)。为了制备含有酵母菌的食物，每一种类型的冻干酵母菌细胞的加入量为5％或10％。
表8食物组合物(％)

试验方法 降胆固醇的效果(1)试验食物使用实施例1(B)中制备的试验食物。
(2)动物和饲养方法a)食用了含10％酵母菌的食物的动物组用食物粉F-2(Oriental Yeast的产品)将雄性的、5周龄的Wistar大鼠(从日本的Clea获得)预养7天。所述大鼠被分为若干组，每一组有8只大鼠。每一组大鼠连续7天食用如表8所示的含10％酵母菌的食物。所述大鼠以组被饲养在铁笼中，并且允许随意食用施用的食物和水。
b)食用了含5％酵母菌的食物的动物组用食物粉F-2(Oriental Yeast的产品)将雄性的、5周龄的Wistar大鼠(从韩国的Nihon获得)预养7天。所述大鼠被分为若干组，每一组有8只大鼠。每一组大鼠连续14天食用如表8所示的含5％酵母菌的食物。所述大鼠被分别饲养在铁笼中，并且食用食物的量被限制在15g/天，但水是任意提供的。
(3)血脂的测量a)食用了含10％酵母菌的食物的动物组开始食用后第7天，在采用戊巴比妥钠进行麻醉的情况下(不禁食)，利用插管从每只大鼠的腹部主动脉中采集血，从而测定血浆的胆固醇浓度和血浆的HDL浓度。总胆固醇浓度通过利用生化自动分析仪(7170型，Hitachi)来测定。
通过采用Determiner HDL(Kyowa Medics的产品)沉淀不同于HDL的脂蛋白成分后，利用生化自动分析仪(7170型，Hitachi)来测定HDL胆固醇浓度。
b)食用了含5％酵母菌的食物的动物组开始食用后第7天，从每只大鼠的尾静脉中采集血，从而测定血浆的胆固醇浓度和血浆的HDL浓度。总胆固醇浓度通过利用生化自动分析仪(7170型，Hitachi)来测定。
通过采用Determiner HDL(Kyowa Medics的产品)沉淀不同于HDL的脂蛋白成分后，利用生化自动分析仪(7170型，Hitachi)来测定HDL胆固醇浓度。
4)肝内脂的测定利用生理盐水灌注肝脏后，摘取肝脏并进行冻干。利用氯仿∶甲醇(2∶1)按照Folch等的方法进行脂类的提取。将获得的下层氯仿浓缩成固体，并且通过稀释用乙醇再次稀释所述固体。对稀释样品进行含在肝脏内的脂类成分的测定。在肝脂中，用Determiner TC 555测定肝脂中的胆固醇的含量。
评估动物试验结果的方法(1)统计学对动物试验结果进行统计学分析，利用Bartlett方法检测差异的方差齐性。当发现方差是方差齐性时，以单向布局方式和Dunnett的多项比较试验进行方差分析，而当发现方差是异方差性时(通过Bartlett试验从中获得显著性差异的试验对象的显著性水平低于5％)，通过Kruskal-Wallis试验和Dunnett的多项比较试验进行方差分析。在Dunnett的多项比较试验中，显著性水平被设定为5％和1％，在每一显著性水平上进行所述试验。
(2)达到脂类百分含量降低的方法<血浆胆固醇百分含量的降低>
“血浆胆固醇100％的降低”的表达方式指的是一种血浆胆固醇的浓度被降低到属于一组食用了一种常规食物(未添加胆固醇的)的大鼠的血浆胆固醇浓度。“血浆胆固醇0％降低”的表达方式指的是血浆胆固醇的浓度被提高到属于一组食用了一种添加胆固醇食物(对照)的大鼠的血浆胆固醇浓度。
(3)致动脉粥样化指标致动脉粥样化指标(AI)通过下式表示AI＝(VLDL胆固醇+LDL胆固醇)/HDL胆固醇。
AI由总血浆胆固醇浓度和血浆HDL胆固醇计算得出；即，真实的血浆脂类测值，按照下式AI＝((总血浆胆固醇)-(血浆HDL胆固醇))/(血浆HDL胆固醇)。
致动脉粥样化指标标改善的百分率由每一含酵母菌食物的食用组的AI值和添加胆固醇食物的食用组(对照组)的AI值计算得出。“动脉粥样硬化指标100％的改善”的表达方式指的是AI值与未添加胆固醇食物的食用组的AI值相同。“动脉粥样硬化指标0％的改善”的表达方式指的是AI值与添加胆固醇食物的食用组(对照组)的AI值相同。
(4)体重测量对购买的大鼠进行体重测量。将这些大鼠分成几组以使各组间在体重方面不存在显著差异，然后开始预饲养。开始试验前和完成试验后分别测量体重。
上述试验方法被下列预试验和实施例所采用。
预试验食用了添加胆固醇食物后，从大鼠的尾静脉采集血；即，在第0天，第5天，和第8天。在第14天，在用戊巴比妥钠进行麻醉的情况下，从腹部主动脉中采集血。从每一采集的血样中分离血浆，并通过酶法测定所述血浆中的脂类成分。
如图1所示，添加胆固醇食物的食用组的血浆胆固醇浓度在第5天大约增加到最大值。此后，在第14天前都观察到了微小的增加量，但没有观察到显著的变化。未添加胆固醇食物(通过从添加胆固醇食物中除去胆固醇和胆酸钠而制备的食物)的食用组的血浆胆固醇的浓度在试验期间没有增加，并且观察到了浓度略微降低的趋势。
表9显示了开始食用添加胆固醇食物后的第14天的血脂浓度。未添加胆固醇食物的食用组的血浆胆固醇浓度是72.5mg/dL，而添加胆固醇食物的食用组的血浆胆固醇浓度是325.3mg/dL，表明大约有4.5倍的浓度增加量。相反，添加胆固醇食物的食用组的血浆HDL胆固醇浓度是45.9mg/dL，明显低于未添加胆固醇食物的食用组的血浆HDL胆固醇浓度(31.4 mg/dL)。
表9血脂浓度(第14)

**p＜0.01表10显示了开始食用添加胆固醇食物后的第14天的肝脂质含量。添加胆固醇食物的食用组的胆固醇浓度是未添加胆固醇食物的食用组的胆固醇浓度的20倍。
表10肝内脂质的含量(第14天)

**p＜0.01实施例2按照实施例1的方法进行罐培养，以便制备每种酵母菌的200g的冻干细胞(在110℃下加热10分钟)。每种细胞样品以10％的含量被混合到添加胆固醇食物中(表8中的10％酵母菌组)。将得到的食物给每一个由8只大鼠组成的组食用，随意食用7天。
表11至13显示了基于高胆固醇食物食用对照组的血浆胆固醇浓度，胆固醇浓度的降低百分比和动脉粥样硬化指标改善的百分比(％)。在试验组间没有观察到体重的显著变化。
表11血浆胆固醇的降低百分比和AI的改善百分比

表12血浆胆固醇的降低百分比和AI的改善百分比

表13血浆胆固醇的降低百分比和AI的改善百分比

实施例3按照实施例1(A)的方法进行罐培养，以便制备每种酵母菌的200g的冻干细胞，每种细胞样品以10％的含量被混合到添加胆固醇食物中(表8中的10％酵母菌组)。将得到的食物给每一个由8只大鼠组成的组食用，随意食用7天。表14显示了血脂测定结果。
表14血脂(10％的混合食用)

**p＜0.01通过食用添加胆固醇的高脂肪食物，对照组的总胆固醇浓度增加并且动脉粥样硬化指标增至7.97-9.62。然而，发现即使食用同样的高脂肪食物，已经食用了含有本发明的酵母菌细胞(10％)的试验组大鼠也显著地抑制所有分析项目值的升高。因此，酵母菌，即马克斯克鲁维氏酵母YIT 8292、乳克鲁维氏酵母YIT 8263、Hanseniasporauvarum YIT 8164、东方伊氏酵母YIT 8266、乳酒假丝酵母YIT 8237和粉状毕赤氏酵母YIT 8058明显地具有很高的血浆胆固醇降低百分率并且被发现能改善致动脉粥样化指标。
实施例45％的添加酵母菌食物施用试验除将每一冻干细胞样品以5％的含量混合到用于试验组的食物(5％的表8中的酵母菌组)中外，重复实施例3中采用雄性的、5周龄Wistard大鼠的过程；将所得的食物给由8只大鼠组成的每一个组食用；以限定量(15g/天)持续14天。
表15显示了血脂的分析结果。食用高脂肪食物的结果是，对照组的总胆固醇的浓度和致动脉粥样化指标增加了。然而，发现即使食用同样的高脂肪食物，已经食用了含有本发明的酵母菌细胞(5％)的试验组大鼠也显著地抑制所有分析项目值的升高。
表15血脂

**p＜0.01表16显示了肝脂的测定结果。在全部试验组中，与对照组相比，肝脏的总胆固醇浓度明显地增加了。因此，发现本发明的酵母菌能够作为抗胆固醇的有效物质，所述酵母菌通过口服能够有效降低血脂及肝脂。
表16

**p＜0.01实施例5 胆酸的吸附力试验方法；将胆酸(CA)，牛磺胆酸(TCA)，甘氨胆酸(GCA)，鹅去氧胆酸(CDCA)，去氧胆酸(DCA)，其每一种的钠盐(Sigma的产品)溶解在0.1M的磷酸缓冲液(pH6.7)或0.1M的磷酸缓冲液(pH7.5)中以使终浓度被调节到1mM。
将东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞(100mg)置于一支离心管(15mL)中，并加入上述配制的每一种胆酸溶液(3.5mL)。在37℃下振荡该混合物(120spm)。1小时后，通过离心(12000rpm，10分钟)使酵母菌沉淀，然后收集上清液。利用Enzabile II(DaiichiPure Chemical Co.，Ltd.的产品)定量分析含在上清液中的胆酸，胆酸吸附百分率按照下列公式计算。本文所采用的术语“胆酸吸附百分率”指的是被酵母吸附的胆酸的量与添加胆酸的总量的比值，并且该值作为酵母菌和胆酸间吸附强度的指标。
胆酸吸附百分率(％)＝[{添加的胆酸(nmol)-上清中的胆酸(nmol)}/添加的胆酸(nmol)]×100表17显示了胆酸吸附百分率。发现东方伊氏酵母YIT 8266吸附胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸或鹅去氧胆酸，对初级胆酸显示出很高的吸附力。酵母菌对胆酸的吸附百分率不取决于反应混合物的pH(6.7和7.2)。这些结果表明酵母菌紧密结合大肠肠道中的初级胆酸并且抑制由肠细菌引起的去结合和7α-去羟基化作用，因而抑制次级胆酸的产生。
另外，所述酵母菌紧密结合去氧胆酸-一种次级胆酸。这表明除了抑制次级胆酸产生外，所述酵母还吸附和固定形成的次级胆酸，因而降低其毒性。
表17东方伊氏酵母对胆酸的吸附百分率(％)

实施例6以与实施例5相类似的方式测定各种酵母菌对胆酸的吸附百分率。表18显示了所述结果。所有酵母菌对胆酸，即鹅去氧胆酸(初级胆酸)和去氧胆酸(次级胆酸)具有很强的吸附力。
表18酵母菌对胆酸的吸附百分率

实施例7 东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞对次级胆酸产生的抑制初步试验用食物粉F-2(Oriental Yeast的产品)将雄性的、5周龄的Wistar大鼠(从Nihon Kruea获得)饲养7天。所述大鼠被分为若干组，以使各组间不出现体重差异，每一组有8只大鼠。每一组大鼠连续14天食用如表19所示的食物。所述大鼠被分别饲养在铁笼中，并且允许随意食用食物和水。
表19食物组合物(％)成分 普通食物 高胆酸食物酪蛋白 22.30 22.30蔗糖 56.55 55.80无机盐 4.00 4.00维生素 1.00 1.00黄豆油 1.00 1.00猪油 10.00 10.00酒石酸氢胆碱 0.15 0.15胆固醇 0.00 0.50胆酸钠 0.00 0.25滤纸粉 5.00 5.00结束14天的饲养后，没有观察到普通食物食用组和高胆酸食物食用组之间食物消耗和体重增加的明显差异。
胆酸浓度将冻干的粪便(第12天到第14天)称重并放入螺帽试管中(15mL)，并加入内标物(5-β-孕烷-3α，17α，20α-三醇)(0.15μmol)和乙醇(5mL)。利用程序加热器(block heater)将混合物在70℃下加热两小时。通过离心(3000rpm，15分钟)沉淀产生的不溶性物质。将上清液转移到另一个试管中并在氮气流下干燥成固体。将提取物溶解到甲醇(0.5mL)中，利用滤器(0.45μm)(Nihon Millipore Ltd.的产品)除去所产生的不溶物质。在下述条件下利用HPLC系统(Jasco的产品)分离分析样品(10μL)。
表20分离胆酸的条件液体A乙腈/甲醇/30mM的乙酸铵(30∶30∶40)混合物液体B乙腈/甲醇/30mM的乙酸铵(20∶20∶60)混合物洗脱条件由100％的B+0％的A到0％的B+100％的A的成比例浓度梯度进行32分钟。然后利用100％的A洗脱13分钟。流速1.0ml/分钟柱温度25℃Bilepak-II(4.6mm内径×250mm)(分离柱，Jasco的产品)由分离柱得到的洗脱物以1.0ML/分钟的流速与反应混合物(0.3mM的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD+)，1mM的乙二胺四乙酸和10mM的含0.05％的2-巯基乙醇的磷酸钾缓冲液(pH7.8))混合。所述液体混合物被转移到一只酶柱(Enzymepak(4.6mm内径×35mm，Jasco的产品))中，该柱填装了3α-羟甾类脱氢酶，其中经胆酸脱氧产生的NADH(还原形式的β-NAD+)通过荧光检测仪进行监测(激发波长345nm，发射波长470nm)。
根据滞留时间参照标准来识别每种胆酸。由相应的峰面积获得胆酸浓度。在这种情况下，回收百分率通过内标物的峰面积进行校正。
表21显示了结果。这些结果表明胆酸的食用提高了初级胆酸到达大肠道的浓度，因而促进了次级胆酸的产生。因此，能够高灵敏度地提高次级胆酸产生抑制剂的效果。
表21排泄到粪便中的胆酸的浓度[μmol/天]普通食物 高胆酸食物初级胆酸α-鼠胆酸(Muricholic acid) 1.52±0.35 8.52±3.05**β-鼠胆酸0.20±0.09 8.48±1.55**猪胆酸 0.00±0.00 0.23±0.2*胆酸 0.00±0.00 29.20±7.44**鹅去氧胆酸 0.00±0.00 0.57±0.20**总初级胆酸 1.72±0.40 47.00±10.31**次级胆酸去氧胆酸 0.72±0.26 9.13±5.92**石胆酸 0.18±0.10 0.13±0.18n.s.猪去氧胆酸 0.01±0.03 1.06±0.54*总次级胆酸 0.90±0.35 10.32±5.84**注释t检验*显著水平5％**显著水平1％n.s.无显著性东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞对次级胆酸产生的抑制将东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞加到高胆酸食物中，连续14天食用所得到的食物(5％的混合食物)(表22)。每一种食物的能量级数通过调控酪蛋白、蔗糖、脂类或纤维素的量来进行平衡。在试验期间食用酵母菌细胞根本就没有对食物的消耗产生影响并且对体重的增加也根本没有产生影响(表23)。
表22食物组合物[％]成分 高胆酸食物添加酵母菌的高胆酸食物酪蛋22.30 20.56蔗糖55.80 54.15无机盐 4.00 4.00维生素 1.00 1.00黄豆油 1.00 1.00猪油10.00 9.85酒石酸氢胆碱0.15 0.15胆固醇 0.50 0.50胆酸钠 0.25 0.25滤纸粉 5.00 3.55加热干燥的酵母菌*0.00 5.00*东方伊氏酵母YIT 8266表23试验期间的食物消耗和体重增加高胆酸食物 添加酵母菌的高胆酸食物食物消耗[g/14天]236.0±8.6 227.8±21.5n.s.体重增加[g/14天]95.9±4.0 93.6±11.9n.s.
注释学生t检验n.s.无显著性如表24和25所示，通过东方伊氏酵母YIT 8266的食用，排泄到粪便中的次级胆酸浓度降低了大约82％，并且粪便中的次级胆酸浓度降低了大约84％。对于去氧胆酸和石胆酸观察到的这一趋势尤其明显。通过相应细胞的食用，排泄到粪便中的初级胆酸浓度和粪便中的初级胆酸浓度明显地增加了。
因此，东方伊氏酵母YIT 8266对初级胆酸向次级胆酸转化具有强烈的抑制作用。
表24排泄到粪便中的胆酸的量[μmol/天]高胆酸食物 添加酵母菌的高胆酸食物初级胆酸α-鼠胆酸(Muricholic acid)13.70±3.40 15.27±3.12n.s.β-鼠胆酸 7.32±2.07 11.60±2.48**猪胆酸0.12±0.17 0.29±0.15n.s.胆酸 24.37±5.86 35.30±2.55**鹅去氧胆酸1.10±0.41 1.34±0.27ns.总初级胆酸46.60±7.30 63.80±6.81**次级胆酸去氧胆酸 10.10±6.51 0.22±0.46**石胆酸0.35±0.31 0.00±0.00*猪去氧胆酸0.80±0.32 1.81±0.64n.s.总次级胆酸11.25±6.59 2.03±0.81**注释学生t检验*显著水平5％**显著水平1％n.s.无显著性表25粪便中的胆酸组成[％]高胆酸食物添加酵母菌的高胆酸食物初级胆酸α-鼠胆酸(Muricholic acid)23.58±5.32 23.11±3.47n.s.β-鼠胆酸 12.59±3.07 17.50±2.51**猪胆酸0.19±0.27 0.43±0.22n.s.胆酸 42.47±11.42 53.87±3.01*鹅去氧胆酸1.89±0.65 2.06±0.50n.s.总初级胆酸80.72±11.55 96.97±0.98**次级胆酸去氧胆酸 17.30±11.46 0.30±0.67**石胆酸0.59±0.53 0.00±0.00*猪去氧胆酸1.39±0.59 2.73±0.89**总次级胆酸19.28±11.55 3.03±0.98**注释学生t检验*显著水平5％**显著水平1％n.s.无显著性利用东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞降低盲肠中的pH将盲肠中的内含物(第14天)(0.5g)悬浮在纯水中(4.5mL)，并将10％的高氯酸水溶液(0.5mL)加到所述悬浮液中。将得到的悬浮液于4℃下保存过夜。该悬浮液进行离心(9000rpm，10分钟)，收集上清液并通过过滤器(0.45μm)(Nihon Millipore Ltd.)。如此制备的分析样品进行HPLC。
在下述条件下利用一种HPLC系统(Toa Dempa Kogyo的产品)进行短链脂肪酸的分析。通过检测器之前将pH缓冲液于洗脱物迅速混合。
表26短链脂肪酸的分析条件柱 KC-811 Shodex(Showa Denko)×2洗脱液(流量) 含有7％的乙腈的15mM的高氯酸溶液(1mL/分钟)柱温度 42℃pH-调节剂(液流)含有7％的乙腈和60mM的三(羟甲基)甲胺的15mM的高氯酸溶液(1mL/分钟)检测器 电导检测器(Toa Denpa Kogyo)细胞温度 45℃表27盲肠中的pH和短链脂肪酸内含物高胆酸食物 添加酵母菌的高胆酸食物盲肠中的pH6.65±0.08 6.46±0.20*短链脂肪酸内含物[mM]乙酸 26.6±8.4 37.5±4.0**丙酸 7.2±2.317.5±4.0**丁酸 2.2±1.43.9±0.8*乳酸 2.5±1.02.6±1.2n.s.琥珀酸15.5±7.3 21.8±7.4n.s.甲酸 1.1±0.61.8±1.3n.s.异丁酸0.7±0.60.4±0.4n.s.总短链脂肪酸 55.9±15.7 85.6±5.2**注释学生t检验*显著水平5％**显著水平1％n.s.无显著性高胆酸食物组的盲肠中的pH是6.65并且短链脂肪酸的总含量是55.9mM，而添加酵母菌(东方伊氏酵母YIT 8266)的高胆酸食物组的盲肠中的pH是6.46(显著性是5％)并且短链脂肪酸的总含量是85.6mM(显著性是1％)，表明盲肠中的pH降低了。因此，大肠pH条件变得更加酸性，因而使肠细菌的7α-脱羟基酶失活。
东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞对胆固醇代谢的抑制作用将粪便(第14天)(25mg)称重并放入螺帽试管中(15mL)，并加入内标物(5β胆甾烷)(0.1μmol)和含有1N的氢氧化钠的90％乙醇溶液(1mL)。利用程序加热器将混合物在80℃下加热。1小时后，加入蒸馏水(0.5mL)，利用石油醚(2.5mL)通过两次萃取得到中性甾醇。得到的萃取物用蒸馏水(7.5mL)冲洗，用硫酸钠脱水，并在氮流下干燥成固体。回收到的中性甾醇被三甲硅烷基化，并在下述条件下(表28)利用气相色谱进行分析。
表28色谱(GC)分析条件GC装置 5890型(Yokogawa-Hewlett-Packard)柱 SPB-1 FS-涂层的毛细管玻璃柱(Supelco)0.32mm内径×30m柱温 250℃，8分钟→270℃，10℃/分钟→270℃，15分钟载体(气流)氦(0.8mL/分钟)加样器Spilit，T＝230℃检测器FID，T＝280℃加样量1μL分析时间 25分钟通过食用东方伊氏酵母YIT 8266，粪便中的粪醇和粪酮的浓缩物明显降低了肠内的胆固醇代谢物(表29)。由于大肠中的这些胆固醇代谢物与疾病如结肠直肠(colovectal)癌的发病有关(Suzuki，K.，等Cancer Lett.，33，307-316，1986)，东方伊氏酵母YIT 8266被认为通过抑制胆固醇代谢物的产生能够防治多种疾病。
表29粪便中的中性胆固醇的组成[％]高胆酸食物 添加酵母菌的高胆酸食物粪醇25.7±12.5 9.2±11.9*粪酮1.9±2.5 0.4±0.6n.s.胆固醇 72.3±14.2 90.5±12.4*粪醇+粪酮 27.7±14.2 9.5±12.4*注释学生t检验*显著水平5％n.s.无显著性实施例8 东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物对次级胆酸的抑制细胞内含物的制备将东方伊氏酵母YIT 8266的冻干细胞悬浮在0.1M的磷酸缓冲液中(pH8.5)，该细胞用DYNO-MILL(Shinmaru Enterprises(企业)的产品)进行机械研磨。在研磨过程中，以0.45mm的玻璃株作为研磨剂，重复研磨操作直至通过显微镜观察证实95％或更多的细胞得到了研磨。磨碎的细胞液体进行离心(9000g，15分钟)，从而在上清液中分离到细胞内含物。收集并冻干该细胞内含物。
东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物对次级胆酸产生的抑制以类似于实施例7中采用的方式，证实了由东方伊氏酵母YIT8266制备的细胞内含物对次级胆酸产生的抑制作用。
表30显示了试验中采用的食物组合物。在试验期间食用酵母菌细胞内含物根本就没有对食物的消耗产生影响并且对体重的增加也根本没有产生影响(表31)。
表30食物组合物(％)成分 高胆酸食物 添加细胞内含物的高胆酸食物酪蛋白 22.30 20.78蔗糖 55.80 53.12无机盐 4.00 4.00维生素 1.00 1.00黄豆油 1.00 1.00猪油 10.00 9.77酒石酸氢胆碱 0.15 0.15胆固醇 0.50 0.50胆酸钠 0.25 0.25滤纸粉 5.00 4.43细胞内含物 0.00 5.00表31试验期间的食物消耗和体重增加高胆酸食物 添加细胞内含物的高胆酸食物食物消耗[g/14天] 232.8±9.9 220.7±6.5n.s.体重增加[g/14天] 95.9±4.0 88.4±4.5n.s.
注释学生t检验n.s.无显著性如表32和33所示，通过食用东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物，排泄到粪便中的次级胆酸浓度降低了大约76％，并且粪便中的次级胆酸浓度降低了大约70％。
因此，类似于冻干的东方伊氏酵母YIT 8266的情况，东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物对初级胆酸向次级胆酸转化也具有强烈的抑制作用。
表32排泄到粪便中的胆酸的量[μmol/天]高胆酸食物 添加细胞内含物的高胆酸食物初级胆酸α-鼠胆酸(Muricholic acid)8.56±1.85 6.80±2.04n.s.β-鼠胆酸 6.80±2.18 8.70±3.04n.s.猪胆酸0.20±0.15 0.25±0.06n.s.胆酸 28.96±11.9929.99±4.77n.s.鹅去氧胆酸0.44±0.29 0.64±0.35n.s.总初级胆酸44.96±13.1746.37±9.40n.s.次级胆酸去氧胆酸 9.87±5.46 2.01±2.26**石胆酸0.02±0.05 0.00±0.00n.s.猪去氧胆酸0.65±0.36 0.49±0.14n.s.总次级胆酸10.54±5.29 2.51±2.18**注释学生t检验**显著水平1％n.s.无显著性表33粪便中的胆酸的组成[％]高胆酸食物添加细胞内含物的高胆酸食物初级胆酸α-鼠胆酸(Muricholic acid)16.01±4.33 13.75±1.82n.s.β-鼠胆酸 12.39±3.19 17.30±3.29**猪胆酸0.34±0.200.51±0.09n.s.胆酸 51.04±10.63 62.47±6.95**鹅去氧胆酸0.76±0.341.27±0.56n.s.总初级胆酸79.82±8.31 94.02±3.61**次级胆酸去氧胆酸 8.29±8.903.64±3.76n.s.石胆酸0.04±0.110.00±0.00n.s.猪去氧胆酸1.13±0.381.07±0.44n.s.总次级胆酸20.18±8.31 5.98±3.61**
注释学生t检验**显著水平1％n.s.无显著性高胆酸食物组的盲肠中的pH是6.65并且短链脂肪酸的总含量是54.0mM，而添加细胞内含物的高胆酸食物组的盲肠中的pH是6.46(显著性是5％)并且短链脂肪酸的总含量是68.3mM(显著性是5％)。因此，酵母菌细胞内含物通过增加短链脂肪酸的含量使得大肠的pH条件变得更加酸性，因而使肠细菌的7α-脱羟基酶失活。
表34盲肠中的pH和短链脂肪酸内含物高胆酸食物 添加细胞内含物的高胆酸食物盲肠中的pH 6.65±0.08 6.46±0.20*短链脂肪酸内含物[mM]乙酸 26.2±9.0 30.2±7.1n.s.丙酸 7.2±2.514.3±2.2**丁酸 2.2±1.52.1±0.9n.s.乳酸 2.4±1.01.9±1.2n.s.琥珀酸 14.3±7.1 17.8±6.4n.s.甲酸 0.9±0.31.8±1.7n.s.异丁酸 0.7±0.70.2±0.2n.s.总短链脂肪酸 54.0±15.9 68.3±13.9*注释学生t检验*显著水平5％**显著水平1％n.s.无显著性作为食用东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物的结果，粪便中的粪醇和粪酮的浓缩物明显降低了肠内的胆固醇代谢物(表29)。因此类似于冻干细胞的情况，东方伊氏酵母YIT 8266的细胞内含物被认为通过抑制胆固醇代谢物的产生能够防治多种疾病。
表35粪便中的中性胆固醇的组成[％]高胆酸食物 添加细胞内含物的高胆酸食物粪醇 21.1±8.210.0±9.9*粪酮 2.0±1.6 0.5±0.5**胆固醇 76.9±9.689.6±10.2*粪醇+粪酮23.1±9.612.1±10.7*注释学生t检验*显著水平5％**显著水平1％实施例9通过利用上述实施例中使用的酵母菌细胞，制备下列组成的食品和饮料。
1)保持和促进健康的食品(片剂)含有下列添加剂的组合物被压片后制成片剂。
表36保持和促进健康的食品组合物(％)干酵母细胞 10植物提取粉 30蜂王浆粉5胶原粉 5乳糖25玉米淀粉20羟丙基纤维素4硬脂酸镁12)保持和促进健康的饮料按照下列配方制备保持和促进健康的饮料。
表37 保持和促进健康的饮料组合物(％)干酵母细胞 5蜂蜜 15柠檬酸 0.1dl-苹果酸 0.1植物提取物(肉桂) 20D-Solbitol液体(70％)10苯甲酸钠 0.05调味剂 适当量纯水平衡3)苹果汁混合饮料按照下列配方制备该饮料。
表38苹果汁混合饮料的组合物(％)葡萄糖液糖 33葡萄柚汁60干酵母细胞 5调味剂 适当量酸性试剂适当量4)发酵乳按照下列配方制备含有被加热的酵母细胞的发酵乳。
将属于乳酸杆菌的细菌接种到消毒过的10％的脱脂奶粉液体和5％的葡萄糖的混合物中来制备酸奶。将实施例1中得到的被加热的酵母细胞以0.1-20％的量加到所述酸奶中来制备发酵乳。
5)奶液将属于乳酸杆菌的细菌和实施例1中得到的被加热的酵母细胞同时加到消毒过的10％的脱脂奶粉液体和5％的葡萄糖的混合物中。将该混合物在37℃下静止培养48小时来制备奶液。
工业应用本发明的含有上述酵母细胞或酵母细胞内含物的降胆固醇剂能显著地降低血浆胆固醇和肝脏胆固醇，因而对预防由于胆固醇积累引起的动脉硬化和其它疾病十分有效。
本发明的次级胆酸产生抑制剂通过胆酸的吸收、大肠中的pH条件的酸性转化等强烈地抑制了次级胆酸的产生，因而对防治结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆汁管癌、胆石病等十分有效。
另外，本发明中使用的不具有病原性的酵母菌被认为是安全的，这一点可以通过自古以来这些酵母菌被用于生产乳酪、马奶酒、葡萄酒等的事实来证明。本发明的含有上述酵母细胞或酵母细胞内含物的降胆固醇剂被长期施用而不发生问题。这一点可通过以下发现来证实口服剂量为8g/kg的所述本发明降胆固醇剂的大鼠中没有观察到死亡情形。
因此，本发明的所述降胆固醇剂和次级胆酸产生抑制剂能被用作口服药物，并且通过对含有所述降胆固醇剂和抑制剂的食品的持续消耗来十分有效地保持健康和预防动脉硬化、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆汁管癌、胆石病等。


含有一种作为活性成分的酵母菌的次级胆酸产生抑制剂和降胆固醇剂。