专利名称：一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法目前已报道能耐受亚硒酸钠的微生物主要有大肠杆菌、罗尔斯通氏菌CH34、深红红螺菌、荚膜红细菌、荧光假单胞菌、固氮红细菌、酵母菌等。但耐受硒的浓度不高，如罗尔斯通氏菌CH43可耐受亚硒酸钠的浓度为6mmol / L，大肠杆菌耐受亚硒酸钠的浓度最高为20mmol / L。王东亮等(2007)报告一株对亚硒酸钠具有高耐受 性，且能将亚硒酸钠还原为红色单质硒的光合细菌S3，经鉴定为固氮红细菌，其耐硒能力达125mM，高于此浓度就无法生长了。酵母具有较高富集和转化硒的能力，通常为300 μ g/g左右，通过梯度耐硒驯化、DES化学诱变和紫外诱变，对硒的耐受量可提高到1026. 96μ g/g。李子超等(2011)在进行沼泽红假单胞菌对亚硒酸盐还原脱毒的研究时，亚硒酸盐添加量为25mg/L。Grerbisu. et. al (1995)报告细菌在亚硒酸钠浓度为O. 6_5mM之间时，芽胞杆菌能将亚硒酸钠还原为单质硒。李瑞萍等(2005)报告芽胞杆菌H B S 4对亚硒酸钠有较高的生物耐受性，在亚硒酸钠浓度高达IlmM仍能生长，但随着硒浓度的增高，对细菌的抑制作用增强。某些微生物对硒有耐受性，原因是将无机硒转化成为无毒或低毒的胶体状态的红色单质硒。1985年，Nuttal就曾提出胶体状态红色单质硒在特定环境下具有生物活性的假说。近年来实验证实，生物还原得到的红色单质硒或红色元素硒是一种以蛋白质为核，红色单质硒为膜的硒一蛋白复合物，直径小于200nm，毒性小，对热稳定，被认为是硒生物解毒的方式。微生物在硒的代谢中通过一系列氧化还原反应，实现硒的不同价态的转换，起到对硒的解毒作用，并减少对细菌本身的毒害。这种红色单质硒在免疫调节、抗氧化、延缓衰老和抑制肿瘤等方面都有很好的生物活性，体外清除羟基自由基效率为无机硒的5倍，有机硒的2. 5倍，且毒性只有亚硒酸钠的1/7，在硒的生物活性利用方面具有较高的研究和应用价值。郑青山等(2002 )研究发现，红色单质硒能明显抑制烟草特异性亚硝胺类化合物诱发人支气管上皮细胞产生的活性氧自由基，并能直接或间接清除人胚肺上皮细胞癌变过程中产生的02和H202，揭示红色单质硒对烟草特异性亚硝胺类化合物所致细胞的氧化损伤有保护作用。
本发明的目的是提供一种安全有效的利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法。本发明一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法，其特征在于包含以下步骤a.选育目标菌株将2克一5克取自硒矿区的硒矿渣、土壤等样品，加入到500毫升肉汤培养基中置于35°C进行增菌培养6小时，用接种环挑取肉汤菌液接种到营养琼脂培养基上，置35°C培养24—48小时，分离单个菌落并分别进行革兰氏染色，在1000倍油镜显微镜下选取革兰氏阳性杆菌，具有椭圆形芽胞，芽胞位于菌体中央，不膨大或稍膨大的芽胞杆菌属细菌为目标菌株；b.制备含硒培养基 在营养琼脂培养基中添加I. 0%葡萄糖，以增加碳的供应量，按每毫升培养基含硒800 Ug剂量添加亚硒酸钠制成固体培养基；c.接种与培养将步骤a选定的目标菌株用接种环分别接种到含硒800 ug/ ml、含糖1%的营养琼脂培养基上，置35°C温箱中培养，48小时产生红色单质硒的菌株定为工作菌株；d.制备红色单质硒将步骤c培养基上红色菌株接种到100毫升肉汤培养基中，置35°C培养6小时，进行再增菌；e.生产红色单质硒将增菌液接种到含硒量800ug/ml、含葡萄糖I. 0%的营养琼脂培养基上，置35 V培养24— 72小时，至菌落变大，红色单质硒堆积、整个培养基变红时便可收获；f.产品收获将培养基上红色菌苔刮下置65°C烘箱中干燥既可得产品。本发明从高硒区硒矿床带样本中分离到的菌株对亚硒酸钠普遍具有较高的耐受性，其中2株超耐硒芽胞杆菌,对硒的耐受和还原能力分别超过46500ug/ml和33000ug/ml,实属罕见，说明生长在高硒区、特别是生长在硒矿床带上微生物，为适应高硒生存环境，对硒具有天然的超强耐受性和还原能力。本发明一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法系采用在高硒环境下能正常生存的超耐硒微生物，具有将无机态的元素硒还原为红色单质硒的特性，制备低毒及纳米级的有机硒，具有广阔的应用前景。本发明从高硒区硒矿床带上采集检材，在肉汤培养基中进行富集、分离和选择性培养获得单个菌株。然后进行耐硒能力测试，将能耐受高浓度硒并能将培养基中的硒还原为红色单质硒的芽胞杆菌属菌株筛选出来，用于制备红色单质硒的工作菌株。本发明所分离的菌株最终鉴定为地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌，都是自然环境中广泛分布的细菌，对环境和人及动物有益无害。进行革兰氏染色，在1000倍显微镜下观察，将革兰氏染色阳性杆菌，有芽胞，芽胞位于菌体中央，菌体不膨大或稍膨大的菌株，确定为目标菌株。称取 3. 2克营养琼脂培养基于250ml三角瓶中，加蒸馏水100 ml，加热溶解；再加入O. 18克亚硒酸钠(含硒O. 08克，即每ml培养基含硒800微克)、加入I克葡萄糖，混匀，加塞，常规高压灭菌，分装5个无菌培养皿，制成含硒固体培养基。用接种环选取营养琼脂培养基上的目标菌株，以无菌生理盐水制成菌悬液，以划线法分别接种至含硒营养琼脂培养基上，置35 °C培养24— 72小时，培养基上长的红色菌落定为工作菌株。将工作菌株用肉汤培养基(方法同前)进行再增菌，将增液以划线法接种至含硒营养琼脂培养基上(制法同前)，置35 °C培养24— 72小时，细菌菌落呈鲜红色并融合成片状菌苔。从培养基上刮下红色菌苔，置65°C烘箱中干燥得干品。本发明生产的生物红色单质硒检测结果如下恩施州质检SH20120502003号报告硒含量 19667. 80ug/g。本发明涉及一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法，其特征在于包含以下步骤a.选育目标菌株；b.制备含硒培养基；c.接种与培养；d.制备红色单质硒；e. 生产红色单质硒；f.产品收获。本发明一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法系采用在高硒环境下能正常生存的超耐硒微生物，具有将无机态的元素硒还原为红色单质硒的特性，制备低毒及纳米级的有机硒，具有广阔的应用前景。