一种构建再生的神经血管化骨、软骨、关节或体表器官的方法[0002]各种创伤、肿瘤等原因造成的组织、器官缺损和功能障碍是造成人体损伤的主要原因。而人体组织器官受到损伤后，如何使受损的组织器官结构、功能修复和重建是目前生物学和临床医学界面临的重大难题。重要组织、器官的缺损通常都需要采用自体或异体组织、器官移植进行修复，而自体、异体移植的方法各自存在很多无法避免的缺陷，如自体移植的供区来源不足，异体移植存在免疫排斥、伦理问题等。[0003]上世纪80年代提出了组织工程的概念。随之的提出、建立和发展，人们对体外组织构建有了更深入研究，并为体内重建奠定了基础。在此发展的基础上，人们对器官再生的研究掀起了新的热潮。并使医学研究进入了 “再生医学时代”。[0004]几十年来，组织工程的体外再生首先获得了广泛成功，如骨、软骨、皮肤、气管、神经、血管、肌腱、角膜等组织的构建与修复取得了举世瞩目的成绩，并被国内外广泛的报道与认可。但其在种子细胞、生物材料、信息因子三大核心领域存在着许多一直没法突破的缺憾,如:细胞来源、构建组织的体内相容性、安全性、免疫排斥、伦理性等。而且体外构建的组织普遍存在着无法构建血管神经化问题，这些问题都有待深入的探讨，同时这些问题也延缓了组织工程及再生医学在临床应用的脚步。[0005]“体内再生”、“体内生物反应器”概念的出现，将上述目标成为可能。“体内生物反应器”是利用生物体的自身能力再生所需的组织结构，并用来修复相应的组织缺损。应用“体内生物反应器”可以根据受体需要，预构定制形状的组织结构。由于是自体组织再生获得的器官，移植到受区不存在免疫排斥反应等问题。[0006]Warnke充分发挥人体潜能，以定制型钛网为轮廓支架，填充羟基磷灰石/rhBMP_7混合物，利用含胸背动脉的背阔肌肌袋作为生物反应器，构建血管化下颌骨体，用来修复自体下颌骨缺损，获得了较好的结果，实现了通过动物实验转化到人的体内组织预构。PaoloM等人，成功修复了左主支气管狭窄，使气道功能性修复，实验者将自体的健侧气管上皮细胞接种在异体脱细胞气管支架上，再利用体外“气液相”生物反应器在体外培养96小时，使细胞与支架充分粘附后，将细胞和支架的复合体移植在气管狭窄的区域，术后移植物成活良好，并获得了良好的功能性恢复。Chang H Lee等人，完全利用体内环境，通过细胞的归巢作用，自体修复关节部分缺损结构，作者利用三维CT成像和快速成型技术制造定制型TCP材料的兔肱骨上端肩关节缺损模型，在其支架材料上放置成软骨生长因子TGF-β 3，将其复合体种植入体内相应关节缺损模型内，6个月后，材料在体内细胞的迁移与自身的修复作用下，形成了相应的关节面软骨结构，关节功能逐渐恢复。[0007]基于以上前人的成功报道，学者们利用人体自身的组织结构作为生物反应器，实现了自体重建再生目的物的理念。这些突破性成就，对于构建血管神经化骨、气管、关节软骨，都体现了体内再生的巨大潜力。然而，一方面，这些方法仍然没有完全避免体外培养过程、外源性生长因子、外源性基因等参与。并且再生组织植入后，外源性细胞、材料、生长因子等极易引发排异反应、感染、囊肿形成、材料不能够降解、外露等并发症，该安全性问题一直没有完全解决，严重制约了以上构建的血管神经化骨、气管、关节软骨等在临床的应用。另一方面，目前所构建的组织难以神经血管化，因此其植入体内后发生退化、无法进一步与自体融合生长等等问题，仍不能满足其缺损修复和功能重建的要求。第三，关节或其他器官是由多种组织结构复合而成，单纯体外构建一种组织形态是远远无法满足机体的要求的。第四，组织或器官的损伤和缺失是多种多样的，我们需要通过精确设计，实现个性化的需求。[0008]综上所述，为促进组织和器官缺损或功能障碍的修复，尤其是推动其在临床的直接应用，提高手术满意度，亟需构建一种无外源性物质参与、形状精确、完全依靠体内构建获得神经血管化组织或器官的方法。
[0010]本发明的再一的目的是，提供一种再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官。
[0011]本发明的另一的目的是，提供所述的再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官的用途。
[0012]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
利用与缺损/缺失的组织/器官呈阴模形状的支架，构建神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官的方法，包括以下步骤:
a)获得欲构建的骨、软骨、关节或体表器官的阴模支架；
b)通过手术于机体内制备一个完整的骨膜和/或软骨膜面，将步骤a)的阴模支架放置于机体内的骨膜和/或软骨膜生发层上，固定缝合阴模支架边缘，使其形成一个闭合空间；
c)闭合步骤b)手术过程中形成的切口，待所述的骨膜和/或软骨膜面生发层侧再生出与阴模支架对应的阳模形状的骨、软骨、关节或体表器官后，完整取出神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官。
[0013]步骤a)所述的“获得预构建的骨、软骨、关节或体表器官的阴模支架”具体是:利用计算机辅助设计或制造技术，对缺损的组织或器官影像学扫描数据进行三维重建，构建缺损部位组织形态，再根据重建的数据，通过三维打印技术制作缺损组织阴模。
[0014]步骤b)中所述的“通过手术于机体内制备一个完整的骨膜和/或软骨膜面”具体是:于肋骨和/或软骨正上方逐层切开皮肤、皮下、肌肉层，并沿肋骨肋软骨膜中线处切开，小心剥离骨膜和软骨膜，结合阴模支架大小取出合适的肋骨和/或软骨，整个过程仔细保护骨膜和/或软骨膜的生发层，再连接缝合相邻骨膜和/或软骨膜，使其展平形成一个完整的骨膜和/或软骨膜面。
[0015]步骤b)中，所述的阴模支架的设计面面向骨膜和/或软骨膜生发层放置。[0016]步骤b)中所述的“机体”为动物体，所述的动物可以是人、猪、兔、狗、大鼠、小鼠等。
[0017]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官，所述的再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官由骨和/或软骨构成。
[0018]所述再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官形状与阴模支架正好相互补。
[0019]所述的再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官为再生的神经血管化的关节、颅骨、鼻骨或耳软骨。
[0020]为实现上述第三个目的，本发明采 取的技术方案是:
如上任一所述的再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官的用途，用于制备修复缺损或缺失的组织或器官。
[0021]如本文所用，所述的“再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官”还可以按照其组织类型划分为单纯骨、单纯软骨、以及骨和软骨的复合组织三种类型。
[0022]如本文所用，所述的“骨和/或软骨”是指骨、软骨、或骨和软骨的复合组织，所述的“骨和软骨的复合组织”优选为骨与软骨结合于一体的组织，该组织包含骨、软骨，以及骨和软骨的过渡区域。鼻、关节等均属于“骨和软骨的复合组织”范畴。
[0023]如本文所用，所述的“阴模”是指一种模具，该模具一面的凹凸形状特征与正常组织或器官对应面的凹凸形状特征相互吻合。所述的阴模支架可为羟基磷灰石、硅胶等材质，只要可制作成缺损组织阴模形状，并可植入体内起到组织再生时的塑形作用即可。
[0024]如本文所用，所述的“阴模支架的设计面”是指阴模支架用于让新生骨、软骨、或骨和软骨的复合组织附着生长的那一面，该面的形状是依据欲构建的骨、软骨、关节或体表器官的形状设计。
[0025]如本文所用，所述的“骨膜和/或软骨膜面”是指骨膜面、软骨膜面、或骨膜面和软骨膜面及二者的过渡区。
[0026]本发明中，所述的“关节”指骨与骨(如股骨和髋骨)之间的连接点，如指关节，膝关节，甚至局部关节缺损；所述的“体表器官”包括耳、鼻、指关节等器官。
[0027]本发明中，构建再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官时，如再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官其本质为单纯骨，则将所述阴模支架置于骨膜的生发层；如再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官其本质为单纯软骨，则将所述阴模支架置于软骨膜的生发层；如再生的神经血管化的骨、软骨、关节或体表器官其本质为骨与软骨的复合组织，则将所述阴模支架置于骨膜和软骨膜及二者交界处的生发层。
[0028]本发明优点在于:
本发明探讨建立了一种完全利用体内环境，构建个性化定制型神经血管化的组织或器官的方法，从而用来修复和重建组织及器官缺损，尤其是用来修复和重建自体组织及相应器官缺损。以此为患者提供最安全、有效、持久的治疗方案，并可成为临床广泛应用的坚实依据。
[0029]具体地，本发明利用计算机辅助设计/制造技术(CAD/CAM)，对缺损的组织或器官影像学扫描数据进行三维重建，构建缺损部位组织形态。根据重建的数据，通过三维打印技术制作缺损组织阴模支架。利用骨膜/软骨膜及其血管神经束作为“体内再生源”，将个性化的阴模支架放置于体内成骨/成软骨最重要的结构——骨膜/软骨膜(阴模凸起面面向骨膜/软骨膜生发层)， 并固定缝合材料边缘于骨膜/软骨膜。所形成的一个闭合空间用于自体构建缺损的组织或器官。这种方式构建的神经血管化组织及器官(如耳、鼻等)具有以下优点:①制作的是缺损组织或器官的阴模支架，将阴模支架置入机体后，能直接获得与所需组织或器官形状完全一致且不包含支架材料的再生组织或器官，相比于现有技术中使用阳模材料和/或体外培养细胞及生长因子共同置入机体，使组织或器官在其上再生的做法，更加安全，形状更加精确；②完全利用自体再生的潜能构建缺损的目的性组织或器官，在整个预构骨/软骨再生过程中，无体外细胞培养过程、外源性生长因子、外源性基因等参与，从而保证体内组织预构的安全性，克服了外源性细胞、材料、生长因子等植入体内而存在的后期排异反应、感染、囊肿形成、材料不能够降解、外露等并发症的缺陷，因此可以直接应用于临床最终所获得的再生组织或器官完全为骨和/或软骨，不含有任何支架材料，支架材料在体内组织再生过程中仅起到帮助塑形的作用，而非参与再生，在二期手术中可将支架材料取出，不会因其遗留体内而造成的后期感染、排异等并发症；④充分动员了体内骨/软骨生成的重要要素一骨膜/软骨膜，选择在肋骨/肋软骨的骨膜/软骨膜生发层置入阴模支架，再生的组织或器官有骨膜/软骨膜覆盖，其具有明确的血管神经蒂，不但可以保证预构组织或器官的神经血管化，同时也提供了可供吻合的血管神经，为组织移植、修复供区缺损提供了充分条件。并且骨膜软骨膜所形成的天然连接结构，为骨软骨复合组织所形成的关节过渡性结构提供了必要条件；⑤经CAD/CAM技术制作的阴模支架在体内组织预构过程中起到了精确的塑形作用，再生的骨/软骨组织无需重新雕刻，大大降低了对手术医生的要求，缩短了手术时间，减少了创伤，并且避免了正常组织或器官与人工雕刻的组织或器官形状上所存在的差异性。



[0030]图1.根据CT三维重建数据及计算机辅助设计/制造(CAD/CAM)技术，重建个性化患侧耳。
[0031]图2.根据重建数据，通过3D打印技术制作正常的患侧耳树脂模型。
[0032]图3.羟基磷灰石材料(HA)灌注耳形支架，获得其阴模。
[0033]图4.按图中A设计，将第6、7、8肋软骨取出，仔细保护骨膜和软骨膜的生发层。如图中B所示，缝合相邻软骨膜，使其形成一个完整的软骨膜。如图中C所示，将事先准备好的阴模凸起面向软骨膜生发层缝合，使其形成一个闭合腔隙，用于软骨组织再生。
[0034]图5.术后第3个月对预构组织进行影像学监测，可见预构软骨组织具有确切的影像学成像。
[0035]图6.预构的耳形软骨组织轮廓精确清晰。
[0036]图7.带软骨膜完整取出预构的软骨组织，进一步修剪再生软骨周围少量软组织。
[0037]图8.对修剪多余的再生软骨软骨组织进行阿里新兰染色，结果显示经典的软骨陷窝、软骨基质。II型胶原免疫组织化学染色可见典型的软骨基质。
[0038]图9.实施例1的体内预构软骨的弹性模量。
[0039]图10.实施例1的体内预构软骨的最大弯曲载荷。
[0040]图11.根据颅骨缺损，利用(CAD/CAM)技术，精确个性化的三维打印缺损骨组织的树脂模型。[0041]图12.根据树脂模型，制作HA阴模，用于预构缺损骨组织。
[0042]图13.根据阴模的大小，于第6、7、8根肋骨位置设计出预构的骨组织需要的相应肋骨骨膜面积及相应的肋骨位置。
[0043]图14.将第6、7、8肋相应阴模大小的肋骨取出，整个过程仔细保护骨膜的生发层。展开并连接缝合相邻骨膜，使其铺平形成一个完整的骨膜面(左)。将事先准备好的阴模，设计面面向软骨膜生发层放置，边缘缝合固定于骨膜上(中)，使其与骨膜形成一个闭合腔隙，用于骨组织再生(右)。
[0044]图15.于术后第3个月对预构组织进行影像学监测，可见预构组织具有确切的影像学骨组织再生证据。
[0045]图16.带骨膜完整取出预构的骨组织(如需要，可同时携带血管神经束共同取出供移植)。
[0046]图17.VG染色镜下可见典型的骨小梁骨髓腔及成骨细胞，髓腔内血管丰富。
[0047]图18.三色法染色、OC免疫组织化学染色可见典型的骨小梁样结构，丰富的血管布满骨髓腔。
[0048]图19.术后随访一年见，预构骨组织无明显吸收。面部形态良好。
[0049]图20.骨组织VG(A)、三色法染色⑶可见典型的骨小梁骨髓腔及成骨细胞，髓腔内血管丰富。OC免疫组织化学染色(D)可见典型的骨小梁样结构；阿里新兰染色，col II免疫组织化学染色(E)可见典型的软骨细胞及丰富的胞浆结构。甲苯胺蓝快绿染色(C)可见骨软骨复合组织的过渡结构。

[0050]下面结合附图对本发明提供的作详细说明。
[0051]实施例1体内耳形软骨预构及重建外耳 其具体方法通过以下技术方案实现:
(I)根据组织器官缺损，利用(CAD/CAM)技术精确个性化的三维打印需要构建组织形
状
为了对个性化小耳畸形患者行耳再造，于术前进行头部CT扫描。将CT资料以DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式输出，通过Medgraphics软件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)软件进行三维建模处理,得到耳的三维模型(图1)。采用镜像技术，按照正常侧耳形状，对患侧耳进行三维模拟重建处理，得到患侧正常耳的三维模型,然后通过立体光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作,得到患侧正常耳的树脂模型(图2)。考虑到扫描重建的耳廓组织包括了软组织覆盖，因此为了再造耳经皮肤覆盖后轮廓清晰，故本研究采用的SLA模型是将耳廓CT数据的精确结构加深1.16倍制作，预留并弥补了术后因皮肤覆盖而造成的耳部亚单位精细程度下降。将HA (羟基磷灰石)粉末(〈40目)与促凝剂按照4:6的重量比调和搅拌成液剂后注入树脂模型取其阴模(图3)。高压消毒后独立包装备用。
[0052] (2)体内组织预构
在自身预构过程中，我们动员体内成软骨的最重要结构——软骨膜及其血管神经束作为“体内再生源”，完全性自体再生精确形状的个性化耳廓软骨。按照术前设计(图4A)，于第7肋软骨正上方逐层切开皮肤、皮下、肌肉层，分别将第6、7、8相应阴模大小的肋软骨取出，整个过程仔细保护软骨膜的生发层。连接缝合相邻软骨膜，使其展平形成一个完整的软骨膜面(图4B)。将事先准备好的阴模凸起面面向软骨膜生发层放置，边缘缝合固定于软骨膜上，使其与软骨膜形成一个闭合空间，用于软骨组织再生(图4C)。将取出的软骨置于皮下，并放置引流，逐层组织缝合。
[0053](3)再生耳形软骨组织用于耳再造
分别在术后1、3个月对预构组织进行影像学监测，待预构组织具有确切的影像学证据后行二期手术(图5)。术中沿原切口逐层切开皮肤，将预置的HA材料小心取出。见预构的耳形软骨组织轮廓精确清晰(图6)。带软骨膜完整取出预构的耳形软骨组织(如需要，可同时携带血管神经束共同取出移植)。还纳埋置于皮下的肋软骨，留置引流。缝合皮肤。进一步修剪再生软骨周围少量软组织(图7)。
[0054]将修剪下的预构软骨行组织学及生物力学检测:
I)组织学检测:将少量修剪掉的再生软骨组织用4%多聚甲醛浸泡固定(ΡΗ=7.0-7.5的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小时更换一次，共3天。PBS冲洗，酒精梯度脱水。常规石蜡包埋进行组织切片(5 — 10 μ m)。并行HE、阿利新兰、免疫组化COL II (II型胶原蛋白)染色。于光学显微镜下观察新生成软骨细胞、胞浆形态。
[0055]结果显示:阿利新兰、免疫组化COL II (II型胶原蛋白)染色可见典型的软骨陷窝样结构，胞浆丰富(图8)。 [0056]2)生物力学测定:取预构的残余软骨标本，_20°C冷冻，测试前于室温条件下，PBS液浸泡，材料试验机测定软骨垂直最大压缩载荷和弹性模量等。并选择正常肋软骨作为对照组。
[0057]结果显示:预构的软骨在术后三个月时具有与正常肋软骨相似的弹性模量(为正常肋骨的90.5±3.9%)(图9)和最大压缩载荷(正常肋骨的86.4±4.9%)(图10)，显示再生组织的弹性模量与正常软骨之间无明显的统计学差异。
[0058](4)耳再造术
将预构的耳形软骨组织进一步修剪后，二期行耳再造术。按照术前设计的切口，处理预构的耳部皮肤和外耳道形态，植入预构耳形软骨组织。覆盖并缝合皮肤，留置引流。包扎固定。术后7天拆除缝线。3个月后行颅耳角成形术。分别于术后第1、3、6和12个月随访，行影像学检查，观察软骨组织成活情况。
[0059]术后随访结果显示:CT可见植入的预构软骨组织成活良好，术后随访一年见，预构软骨组织无明显吸收。耳部轮廓形态良好。
[0060]实施例2体内骨预构及重建颅骨缺损 其具体方法通过以下技术方案实现:
(I)根据颅骨缺损，利用(CAD/CAM)技术，精确个性化的三维打印需要构建的组织形状为了对个性化骨缺损患者行重建，于术前对患者骨缺损/畸形部位进行CT扫描。将CT 资料以 DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式输出，通过Medgraphics软件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)软件进行三维建模处理，得到骨的三维模型。按照正常侧骨组织形状，采用镜像技术，对患侧骨缺损处进行三维模拟重建处理，得到患处正常的骨形态三维模型，然后通过立体光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作，得到缺损骨组织的树脂模型(图11)。考虑到扫描重建的骨组织包括了软组织覆盖，因此为了重建后轮廓清晰，故本研究采用的SLA模型是将骨缺损/畸形CT数据的精确结构加深1.16倍制作，预留并弥补了术后因皮肤覆盖而造成的局部亚单位精细程度下降。将HA (羟基磷灰石)粉末(〈40目)与促凝剂按照4:6的重量比调和搅拌成液剂后注入树脂模型取其阴模。高压消毒后独立包装备用(图12)。并根据阴模的大小计算出需要的骨膜的面积。
[0061]同时，对患者行胸廓三维CT扫描，并进行三维重建。利用Minics 10软件重建出胸廓结构。根据阴模的大小，于第61根肋骨位置设计出预构的骨组织需要的相应肋骨骨膜面积及相应的肋骨位置。
[0062](2)体内组织预构 按照术前设计(图13)，于第7肋软骨正上方逐层切开皮肤、皮下、肌肉层，分别将第61肋相应阴模大小的肋骨取出，整个过程仔细保护骨膜的生发层。展开并连接缝合相邻骨膜，使其铺平形成一个完整的骨膜面。将事先准备好的阴模设计面面向骨膜生发层放置，边缘缝合固定于骨膜上，使其与骨膜形成一个闭合空间，用于骨组织再生(图14)。
[0063]( 3)预构骨组织的获取
分别在术后1、3个月对预构组织进行影像学监测，待预构组织具有确切的影像学骨组织再生证据后行二期手术(图15)。术中沿原切口逐层切开皮肤，将预置的HA材料小心取出。见预构骨组织轮廓精确清晰。带骨膜完整取出预构的骨组织(如需要，可同时携带血管神经束共同取出供移植)(图16)。术中保证胸膜和腹膜的完整性。还纳埋置于皮下的肋骨，留置引流。缝合肌肉、皮下组织及皮肤层。进一步修剪再生骨周围少量软组织及多余的预构骨组织。
[0064]将修剪下来的预构骨行组织学及生物力学检测:
O组织学检测:将少量修剪掉的再生骨组织用4%多聚甲醛浸泡固定(ρΗ=7.0-7.4的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小时更换一次，共3天。PBS冲洗，EDTA (10%)缓慢脱钙。三天更换脱钙液一次。待脱钙完全后，PBS冲洗，酒精梯度脱水。常规石蜡包埋进行组织切片(5 — ΙΟμπι)。并行HE、VG、快绿、三色法染色、免疫组化OC (骨钙蛋白)染色。于光学显微镜下观察新生成骨细胞、骨小梁、骨髓腔的形态及血管再生情况。
[0065]结果显示:VG染色镜下可见典型的骨小梁骨髓腔及成骨细胞，髓腔内血管丰富。三色法染色、OC免疫组织化学染色可见典型的骨小梁样结构、丰富的血管结构布满骨髓腔(图 17，18)。
[0066]2)生物力学测定:取预构的残余骨标本，_20°C冷冻，测试前于室温条件下，PBS液浸泡，测定软骨最大压缩载荷和弹性模量等。并选择正常肋骨作为对照组。
[0067]结果显示:预构的颅骨在术后三个月时具有与正常肋骨相似的弹性模量(为正常肋骨的88±5.6%)和最大压缩载荷(正常肋骨的108±3.4%)。显示再生组织的弹性模量与正常骨之间无明显的统计学差异。
[0068](4)颅骨缺损修复重建畸形矫正术
将取出的预构骨组织植入颅骨缺损部位，行二期颅骨缺损修复重建术。具体地:将修剪好的预构骨组织植入骨缺损部位。缝合皮肤，包扎固定。术后7天拆除缝线。分别于第1、
3、6和12个月随访，行影像学检查，观察骨组织成活及骨融合现象。[0069]术后随访结果显示:CT可见植入的预构骨组织成活良好，与上颌骨融合生长。术后随访一年见，预构骨组织无明显吸收，面部形态良好，轮廓明显改善。(图19)。
[0070]实施例3体内鼻形骨/软骨预构及重建鼻骨 其具体方法通过以下技术方案实现:
(I)根据骨缺损，利用(CAD/CAM)技术，精确个性化的三维打印需要构建组织形状为了对个性化骨缺损患者行重建，于术前对患者头部进行CT扫描。将CT资料以DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式输出，通过Medgraphics软件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)软件进行三维建模处理,得到头部软组织的三维模型。按照正常头部组织形状，对鼻缺损处进行三维模拟重建处理，得到与面部轮廓匹配的鼻形态。并与患者进一步沟通，了解患者对术后鼻部轮廓的要求，达到一致后行鼻再造术。
[0071]按照三维模拟的鼻部轮廓形态，三维打印出患者理想的鼻轮廓模型，然后通过立体光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作,得到缺损鼻部组织的轮廓树脂模型。考虑到扫描重建的骨 组织包括了软组织覆盖，因此为了重建后轮廓清晰，故本研究采用的SLA模型是将鼻轮廓软组织数据的精确结构增加至1.2倍制作，预留并弥补了术后因皮肤覆盖而造成的局部亚单位精细程度的下降。将HA (羟基磷灰石)粉末(〈40目)与促凝剂按照4:6的重量比调和搅拌成液剂后注入树脂模型取其阴模。高压消毒后独立包装备用。
[0072]同时，对患者行胸廓三维CT扫描，并进行三维重建。利用Minics 10软件重建出胸廓结构。根据阴模的大小，于第6、7根肋骨位置，按照阴模的大小计算出需要的骨膜和软骨膜的面积及预构组织的精确位置。
[0073](2)体内组织预构
按照术前设计，于第6、7肋骨软骨交界处正上方逐层切开皮肤、皮下、肌肉层，分别将第6、7肋相应阴模大小的肋骨和肋软骨取出，整个过程仔细保护骨膜和软骨膜的生发层。展开并连接缝合相邻的骨膜和软骨膜，使其铺平形成一个完整的骨膜和软骨膜面。将事先准备好的阴模设计面面向骨膜和软骨膜生发层放置，边缘缝合固定于骨膜和软骨膜上，使其与骨膜和软骨膜形成一个闭合空间，用于骨和软骨组织再生。将取出的软骨置于皮下，并放置引流，逐层组织缝合。
[0074](3)再生组织对供区的修复与重建
分别在术后1、3个月对预构组织进行影像学监测，待预构组织具有确切的影像学骨和软骨组织再生证据后行二期手术。术中沿原切口逐层切开皮肤，将预置的HA材料小心取出。见预构骨和软骨组织轮廓精确清晰。带骨膜和软骨膜完整取出预构的鼻形骨/软骨组织(如需要，可同时携带血管神经束共同取出，供移植)。术中保证胸膜和腹膜的完整性。还纳埋置于皮下的肋骨和肋软骨。留置引流。缝合肌肉、皮下组织及皮肤层。进一步修剪再生骨周围少量软组织及多余的骨软骨预构组织。
[0075]将修剪下的预构骨/软骨行组织学及生物力学检测:
O组织学检测:将少量修剪掉的再生骨和软骨组织用4%多聚甲醛浸泡固定(ΡΗ=7.0~7.5的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小时更换一次，共3天。PBS冲洗，EDTA(10%)缓慢脱钙。三天更换脱钙液一次。待脱钙完全后，PBS冲洗，酒精梯度脱水。常规石蜡包埋进行组织切片(5 — 10 μ m)。并行HE、VG、快绿-甲苯胺蓝染色、免疫组化OC (骨钙蛋白)、COL II染色。于光学显微镜下观察新生成骨细胞、骨小梁、骨髓腔、软骨细胞的形态。
[0076]结果显示:镜下可见典型的骨小梁骨髓腔及成骨细胞，髓腔内血管丰富。OC免疫组织化学染色可见典型的骨小梁样结构；典型的软骨细胞及丰富的胞浆结构。COL II染色可见软骨陷窝结构(图20)。
[0077]2)生物力学测定:取预构的残余骨和软骨标本，-20°C冷冻，测试前于室温条件下，PBS液浸泡，分别测定骨/软骨垂直最大压缩载荷和弹性模量等。并选择正常肋骨/软骨作为对照组。
[0078]结果显示:预构的骨/软骨在术后三个月时具有与正常肋骨及肋软骨相似的弹性模量(为正常肋软骨的81.3±6.4%)和最大压缩载荷(正常肋骨的108.7±5.7 %)。显示再生组织的弹性模量与正常骨/软骨之间无明显的统计学差异。
[0079](4)鼻缺损畸形重建矫正术
将预构的鼻形骨/软骨组织进一步修剪后，行二期鼻再造术。按照术前设计的切口，处理预构的鼻部皮肤和衬里，于鼻背部植入预构鼻形骨/软骨组织。边缘固定于上颌骨相应位置。覆盖并缝合皮肤，保证鼻背皮肤及鼻内衬里组织完全覆盖预构的鼻型组织。鼻管支撑。包扎固定。术后7天拆除缝线。分别于术后第1、3、6和12个月随访，行影像学检查，观察骨组织成活及骨融合现象。
[0080]术后随访结果显示:CT可见植入的预构骨/软骨组织成活良好，与上颌骨融合生长。术后随访一年见，预构骨/软骨组织无明显吸收。鼻部形态良好。
[0081] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。