专利名称：：快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法：蛋白酶在有机相催化合成的多肽，广泛应用于食品工业，市场需求量巨大。但是，目前应用的蛋白酶对有机溶剂耐受性差，在有机相催化时酶活性迅速降低或失活，降低了生产速率，提高了生产成本，成为大规模催化合成多肽或酯类的瓶颈。通过酶的化学修饰、包埋、固定等化学酶工程手段可以提高酶对有机溶剂的耐受性。但这些方法成本高、操作复杂。如果蛋白酶本身在有机相具有高活性和高稳定性，则可以大大简化工序，降低成本，有利于大规模生产以满足市场需求。因此，筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物至关重要。目前，耐有机溶剂蛋白酶产生菌的筛选采用传统液体发酵方法。首先筛选蛋白酶产生菌，单菌分离，对所有菌株分别液体发酵产蛋白酶，测定蛋白酶耐有机溶剂特性，才能获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌(李霜，徐娴，羊亚平.溶剂稳定性蛋白酶产生菌的筛选和鉴定微生物学报，2007，47:1032-1037)。该方法成本高，周期长，劳动强度大。
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种成本低、操作简单、周期短、效率高的快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，其特点是，其步骤如下(1)样品采集用无菌取样瓶采集土壤或水样品，4°C保存；(2)富集培养取0.5g样品加入2216E培养基中，25°C，140rpm培养24h，得富集液；(3)平板制备LB平板制备每个直径9cm的平皿加入15mlLB固体培养基；有机溶剂、脱脂乳双层平板制备下层平板将甲苯、20g/LPVA按体积比1:3置于烧杯中，300W超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；20g/L琼脂、Ig/LMgSO4-IW2Q,Ig/LCaCl2,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，待温度降至约60°C，加入20%乳化液，混匀后加8mL到直径9cm的平皿；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2,pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加8mL到平皿中；脱脂乳双层平板制备下层平板20g/L琼脂、Ig/LMgSO4.IW2Q,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，每个平皿8mL；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加入8mL到平皿；(4)分离筛选对富集液进行梯度稀释，取50yL不同稀释度的稀释液涂布LB平板，25°C倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板，25°C倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。本发明方法可以快速的筛选分离分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物。与传统的液体发酵方法相比，该方法不用单独进行菌株的分离和液体发酵而直接快捷的筛选出分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物。整个过程耗时短，操作简单，劳动强度较小，为筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物提供了极大方便。具体实施方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，其步骤如下(1)样品采集用无菌取样瓶采集土壤或水样品，4°C保存；(2)富集培养取0.5g样品加入2216E培养基中，25°C，140rpm培养24h，得富集液；(3)平板制备LB平板制备每个直径9cm的平皿加入15mlLB固体培养基；有机溶剂、脱脂乳双层平板制备下层平板将甲苯、20g/LPVA按体积比1:3置于烧杯中，300W超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；20g/L琼脂、Ig/LMgSO4-IW2Q,Ig/LCaCl2,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，待温度降至约60°C，加入20%乳化液，混匀后加8mL到直径9cm的平皿；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2,pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加8mL到平皿中；脱脂乳双层平板制备下层平板20g/L琼脂、Ig/LMgSO4.IW2Q,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，每个平皿8mL；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加入8mL到平皿；(4)分离筛选对富集液进行梯度稀释，取50yL不同稀释度的稀释液涂布LB平板，25°C倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板，25°C倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。微生物菌株的培养特征及生理生化鉴定，参照《常见细菌鉴定手册》和《Bergey’smanualofdetrerminativebacteriology))(ninthedition)进行。实施例2，快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法应用实验。将淮海工学院海洋学院微生物研究室保存的耐有机溶剂蛋白酶产生菌BacillusaquaemarisDSl(房耀维,刘姝,徐伟枫,王淑军，吕明生,陈丽.一株有机溶剂稳定性蛋白酶产生菌的筛选与鉴定，2009，30:m~2Ql),BacillussphaericusDSll(YaoweiF，ShuL,Shujunff,MingshengL.Isolationandscreeningofanovelextracellularorganicsolvent-stableproteaseproducer,BiochemicalEngineeringJournal,2009,43:212-215)和非耐有机溶剂蛋白酶产生菌(吕明生，王淑军，李华钟，李丹，陈丽，房耀维.海洋细菌Z71SeytZoaJrterofflmasflavipulchraHH407产低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究，食品科学，2010，21:298-303)都接种到250ml三角瓶中装入的30mlLB培养基中，25°C，140rpm培养24h。用无菌水对培养液进行梯度稀释，取稀释IO7倍的稀释液50UL涂布LB平板，25°C倒置培养36h，分别用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板，22°C倒置培养值菌落36h，根据菌落特征，随即选取三种菌的10个菌落，测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板的比值。结果显示耐有机溶剂蛋白酶产生菌aquaemarisDSl和sphaericusDSll在有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板上透明圈直径的平均比值为99.3%和91.6%,普通脂肪酶产生菌flavipulchraHH407的平均比值为33.2%。权利要求1.一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，其特征在于，其步骤如下(1)样品采集用无菌取样瓶采集土壤或水样品，4°C保存；(2)富集培养取0.5g样品加入2216E培养基中，25°C，140rpm培养24h，得富集液；(3)平板制备LB平板制备每个直径9cm的平皿加入15mlLB固体培养基；有机溶剂、脱脂乳双层平板制备下层平板将甲苯、20g/LPVA按体积比1:3置于烧杯中，300W超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；20g/L琼脂、Ig/LMgSO4-IW2Q,Ig/LCaCl2,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，待温度降至约60°C，加入20%乳化液，混匀后加8mL到直径9cm的平皿；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2,pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加8mL到平皿中；脱脂乳双层平板制备下层平板20g/L琼脂、Ig/LMgSO4.IW2Q,10g/L脱脂乳，pH7.0，115°C灭菌20min，每个平皿8mL；上层平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0，115°C灭菌20min，待下层琼脂凝固后，加入8mL到平皿；(4)分离筛选对富集液进行梯度稀释，取50yL不同稀释度的稀释液涂布LB平板，25°C倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板，25°C倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。全文摘要本发明是一种快速筛选分泌耐有机溶剂蛋白酶微生物的方法，该方法以采集的土壤或水样品进行富集培养，制备LB平板、有机溶剂、脱脂乳双层平板和脱脂乳双层平板后，进行分离筛选，筛选时测定两个双层平板同样位置产生的透明圈直径，计算有机溶剂、脱脂乳双层平板上透明圈直径和橄榄油双层平板上透明圈直径的比值，比值越大，蛋白酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物。本发明能够快速、直观、高效的筛选到分泌耐有机溶剂蛋白酶的微生物，为耐有机溶剂蛋白酶的微生物的研究提供了极大方便。文档编号C12N1/00GK102643745SQ20121012741公开日2012年8月22日申请日期2012年4月27日优先权日2012年4月27日发明者刘姝,吕明生,房耀维,焦豫良,王淑军申请人:淮海工学院