专利名称：包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物的制作方法佐剂是可以用于产生抗原性增加的疫苗或者用于通过增加对抗原的非特异性免疫反应而达到治疗和预防目的的材料。由于抗原水平低时，佐剂用来在较长时间内维持针对抗原的强烈且快速的免疫反应，这些佐剂可以用于疫苗制备。此外，佐剂使得能够使用特殊抗原或者能够改变抗原水平，从而调节针对抗原的免疫反应或者控制针对抗原的抗体类型和亚类。此外，佐剂可以用以增强免疫反应，特别是对免疫不成熟或衰老的人，提高粘膜免疫性的诱导。大部分佐剂是通过反复实验而在许多天然材料中发现的。在1925年，世界范围内第一次对佐剂的报道中，Ramon(法国)报道，在食品中使用的木薯淀粉(Casaba)与白喉和破伤风类毒素混合，将有效地增加抗原特异性抗体的产生。从那时起，报道了铝佐剂的免疫增强作用，并开发了作为免疫调节剂的包含失活的灭活分枝杆菌的有效的乳液型佐剂。弗氏完全佐剂(FCA)被公认为非常有效的免疫调节剂，但是由于它的高反应原性，不适合人类使用。出于这个原因，英国开发并批准了不含分枝杆菌的弗氏不完全佐剂(FIA)。据报道， 革兰氏阴性细菌内毒素具有免疫增强作用，1974年Ellouz等人证实了胞壁酰二肽(MDP)的作用(Ellouz F. et al.，Biochem. Biophys. Res. Coomun. 59 1317-25，1974)。此后，有报道称卵磷脂、皂素及其类似物也可作为佐剂来增强免疫性。理想的佐剂应具有免疫增强作用并且应该是无毒、高度生物可降解、易于使用、易于获得且廉价的。迄今为止，已经报道了许多类型的佐剂，但只有几种类型的佐剂可以实际用于临床实践。这是因为，在开发用于疫苗的佐剂时，安全性是最重要的，应该有可靠的研究数据予以支持。疫苗有治疗和预防作用，可以使99%的疾病的发生率得以降低。因此，疫苗是具有较高性价比的药物。目前，疫苗的使用不仅仅局限于传染病，也正在扩展到各种难治的疾病，包括癌症和自身免疫疾病。此外，由于治疗性疫苗的出现，人们意识到发展疫苗是非常重要的。因此，佐剂作为疫苗相关产品的发展正与疫苗的发展一起得以促进。随着免疫相关疾病范围的扩展，人们意识到开发新型佐剂是很有前景的领域。同时，本发明的发明人取得了有关高分子量聚Y-谷氨酸及其应用的专利(韩国专利登记号399091)、关于使用枯草杆菌chungkookjang变种(Bacillus subtilis var. chimgkookjang) — 一种生产高分子量聚γ谷氨酸的耐盐性的菌株一生产聚Y _谷氨酸的方法专利(韩国专利登记号500796)以及有关抗癌组合物、佐剂、免疫增强剂和病毒感染抑制的专利(韩国专利登记号496606、517114、475406和0873179)。此外，本发明人报道了含有聚Y-谷氨酸的透明质酸酶抑制剂(韩国专利注册号582120)，并发现基于聚γ-谷氨酸的免疫增强作用的抗癌作用[Poo，H. R. et al. ,Journal of Immunology, 178 =775,2007, Poo,H. R. et al. ,Cancer Immunol Immunother (2009 年 3 月 18 日在线出版)]。也就是说， 本发明人进行了广泛的研究以开发聚Y-谷氨酸的应用，包括聚Y-谷氨酸的医药用途，从而找到了聚Y-谷氨酸的各种效果。同时，聚合物纳米颗粒，尤其是由可生物降解的聚合物，例如聚己内酯，制成的纳米颗粒，正由于其高度的生物相容性而受到极大的关注。然而，这些纳米颗粒的缺点在于它们在本质上是疏水的，因此不适合递送亲水性药物或抗原。已经报道了聚Y-谷氨酸在体内递送蛋白质或增强体液免疫的应用中的实例(Akagi, T. et al. , J.controlled release,108 226,2005 ；Uto, T. et al. ,, the J, Imuno 1.，178 :2979，2007)。然而，当聚Y -谷氨酸单独用作佐剂时，它不具有足够的产生抗体的能力。因此，需要进一步加强聚Y-谷氨酸诱导抗原特异性免疫的能力。壳聚糖是阳离子多糖，是脱乙酰形式的甲壳素，它无毒且具有高度生物相容性。此夕卜，已知壳聚糖是可以打开细胞间紧密连接的材料，因而在黏膜药物递送体系中是非常有效的。大多数壳聚糖具有50-2000kDa的分子量，且溶解于乙酸溶液(pH 4)。然而，为了使壳聚糖作为药用材料使用，壳聚糖应保持在中性PH的水溶液中。为了在生理pH值的阳离子水溶液中保持壳聚糖，有必要用纤维素酶处理壳聚糖，以降低分子量。聚Y-谷氨酸和壳聚糖纳米颗粒的复合物是离子键合的聚Y-谷氨酸和壳聚糖复合物，并用作口服递送的胰岛素的载体或DNA递送的载体，但是尚未有其应用于诱导免疫应答的报道(Lin, Y. et al.，Biomacromolecules,6 1104,2005 ；Lin, Y. et al.， Nanotechnology, 16 :105102，2007)。因此，本发明人进行了广泛的努力以克服现有技术中存在的上述问题，结果发现， 与聚Y-谷氨酸单独作为佐剂使用相比，当将包含有通过聚-Y谷氨酸和壳聚糖之间的离子键合而制备的纳米颗粒的佐剂与各种抗原一起给予小鼠时，产生的抗体显著增加，从而完成了本发明。
本发明的目的是提供具有优异的诱导抗原特异性免疫反应能力的含有聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物。本发明的另一个目的是提供含有聚Y -谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。本发明的再另一目的是提供制备包含聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗的方法。为了实现上述目标，本发明提供了含有聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物。本发明还提供了通过将佐剂组合物与抗原一起给予不包括人类的动物而提高针对所述抗原的抗体产量的方法。本发明还提供了包含聚Y-谷氨酸壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。本发明还提供了制备疫苗的方法，所述疫苗包含通过离子键结合到表面带负电荷的抗原上的聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤(a)将壳聚糖通过离子键结合到表面带负电荷的抗原上；以及(b)向键合到壳聚糖上的抗原中加入聚Y-谷氨酸，以在壳聚糖和聚Y-谷氨酸之间形成离子键，从而制备包括聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和所述抗原的疫苗。本发明还提供了制备疫苗的方法，所述疫苗包含通过离子键结合到表面带正电荷的抗原上的聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤(a)将聚Y-谷氨酸通过离子键结合到表面带正电荷的抗原上；以及(b)向键合到聚Y-谷氨酸上的抗原中加入壳聚糖，以在聚Y-谷氨酸和壳聚糖之间形成离子键，从而制备包括聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和所述抗原的疫苗。本发明还提供了通过向除人类之外的动物给予疫苗组合物，提高针对抗原的抗体产量的方法。通过下面的详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加显而易见。图1是聚Y _谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的显微照片。图2是一组聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的激光共聚焦荧光显微照片，其引入 FITC标记的OVA以考察依据蛋白质的添加顺序，抗原蛋白质的引入比率。图3示出为了观察OVA抗原对体液免疫的作用，将含有多种分子量的谷氨酸的聚 Y -谷氨酸(PGA)-壳聚糖纳米颗粒与OVA混合后，通过测量OVA特异性血清IgG，测定的 OVA-特异抗体的产生结果。图4示出向小鼠注射OVA与具有不同电荷的聚Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的混合物后，与弗氏佐剂比较，观察OVA特异性抗体产生和测量OVA特异性血清IgG产生的结^ ο图5示出由含有各种分子量的PGA的PGA-壳聚糖纳米颗粒活化的IFN- γ -分泌 CD8+T细胞的流式细胞仪分析结果，用来考察由于聚、-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，小鼠脾脏中的T细胞对OVA的细胞免疫反应。图6示出流式细胞仪分析的IFN- γ -分泌⑶8+Τ细胞分布的结果，用来考察经以不同混合顺序制备的聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒依据树突状细胞与T细胞的混合比例的T细胞活化。图7示出为考察AI蛋白特异性抗体的产生，向小鼠皮下注射AI蛋白和聚γ-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒混合物或者向小鼠鼻腔给予该混合物后，测量的AI特异性血清IgG结果。图8示出为了考察聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导中和抗体的能力，使用 HI (血凝抑制)测试方法，测量小鼠血清抗体滴度的结果。图9是示出为了考察纳米颗粒产生抗体的能力，皮下注射或鼻腔给予聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的死亡数目变化的图表。图10示出为了考察流感疫苗的抗原特异性抗体的产生，在向小鼠的肌肉中注射流感疫苗抗原与聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物后，测量疫苗抗原特异性血清IgG的结果。图11是示出为了考察混合物产生抗体的能力，肌肉注射流感疫苗抗原与聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的体重变化的图表。图12是示出为了考察混合物产生抗体的能力，肌肉注射流感疫苗抗原与聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的死亡数目变化的图表。发明的最佳实施方式本发明涉及包含聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物以及包含聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。在本发明中，将通过聚Y-谷氨酸羧基反应基团的负电荷与壳聚糖的氨基反应基团质子化的正电荷之间的静电相互作用而形成的纳米颗粒用作聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒。根据本发明的聚Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒是由简单的静电相互作用制备的， 不具有对人体有害的蛋白质之间的交联，因此，这些纳米颗粒具有很高的安全性和有效性， 从而适合作为佐剂使用。聚γ-谷氨酸是由D和L-谷氨酸通过Y -谷氨酰键连接组成的粘性氨基酸聚合物，并且是芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株产生的天然的氨基酸材料。在本发明的一个方面，聚 Y -谷氨酸通过发酵芽孢杆菌chungkookjang(Bacillus substilis chungkookjang) (KCTC0697BP)制备，并且具有1_15，OOOkDa的平均分子量。在本发明中，聚Y-谷氨酸可以通过合适的方法被切割成具有理想的分子量的片段，或者可以通过合适的方法被分离成具有理想的分子量的片段。根据本发明的包含本发明聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂是通过聚Y-谷氨酸与壳聚糖之间的简单的离子键合而不是通过化学结合来制备的，因而是具有高度的安全性、生物相容性和抗体产生能力的佐剂材料，所述聚Y-谷氨酸是通过发酵芽孢杆菌 chungkookjang生产的生物聚合物。用于制备本发明的聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的聚Y-谷氨酸的分子量优选是50kDa-15，OOOkDa0如果聚、-谷氨酸的分子量小于50kDa，其免疫增强作用将较低，而如果聚Y-谷氨酸的分子量大于15，OOOkDa，将会产生与其增加的粘度相关的问题。在本发明中，壳聚糖的分子量优选是500Da_l，OOOkDa。如果壳聚糖的分子量小于 500Da,将难以制备壳聚糖纳米颗粒，而如果壳聚糖的分子量大于1，OOOkDa，在中性水溶液中的溶解度将较低。在本发明中，可以通过在制备聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒时增加聚Y-谷氨酸的比率来制备表面带负电荷的纳米颗粒。在本发明中，所述聚Y-谷氨酸的表面可以是带负电荷的。根据本发明的聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒不是通过化学方法，而是通过简单的离子反应来制备的，因而毒性低且安全性高。在根据本发明的包含聚Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物中，基于重量 (干重)计的100份疫苗组合物，可以包含以重量计0.001-5份聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米6颗粒，优选以重量计0.01-3份。如果基于重量(干重)计的100份疫苗组合物中包含的聚 Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒以重量计，小于0. 001份，所述组合物将不具有产生抗体的能力，而如果包含的聚Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的量按重量计超过5份，所述组合物的粘度将大大增加。在本发明中，包含于疫苗组合物中的抗原，可以选自蛋白质、肽、核苷、核苷酸、病毒、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗生素和抗炎剂，等。在本发明中，疫苗组合物可以用于预防或治疗由选自禽流感病毒、猪流感病毒和新型流感病毒中的任何一种或多种病毒引起的疾病。此外，疫苗组合物可用于预防或治疗选自由子宫颈癌、黑色素瘤皮肤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、外阴癌、膀胱癌、脑癌和脑胶质瘤组成的组中的一种或多种疾病。在另一方面，本发明涉及制备疫苗的方法，所述疫苗包含与表面带负电荷的抗原离子键合的聚Y “谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤(a)将壳聚糖离子键合至表面带负电荷的抗原上；及(b)向已键合至壳聚糖的抗原中添加聚Y-谷氨酸，在壳聚糖和聚Y-谷氨酸之间形成离子键，从而制备包含聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫田ο在制备本发明的聚Y -谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒时，如果被键合的抗原或病毒带正电荷，那么聚Y “谷氨酸首先键合到所述抗原或病毒上，然后壳聚糖被键合，如果抗原或病毒带负电荷，那么壳聚糖首先被键合到所述抗原或病毒上，然后，聚Y-谷氨酸添加到其上，从而得到的聚Y“谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒可以更有效地起到佐剂的作用。在再另一个方面，本发明涉及制备疫苗的方法，所述疫苗包含与表面带正电荷的抗原离子键合的聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤(a)将聚Y-谷氨酸离子键合至表面带正电的抗原上；及(b)向已键合至聚Y-谷氨酸的抗原中添加壳聚糖，在聚Y-谷氨酸和壳聚糖之间形成离子键，从而制备包含聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗。在又另一个方面，本发明涉及通过向不包括人类的动物一起给予佐剂组合物与抗原，或通过向不包括人类的动物给予疫苗组合物来提高产生针对该抗原的抗体的方法。在本发明中，给药是通过选自由皮下注射、肌肉注射、皮内注射、腹腔注射、鼻腔给药、口服给药以及透皮给药组成的组中的任何一种而实现的。在包含聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物或疫苗组合物中可以包含的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、 淀粉、甘油、皂荚胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟苯酸酯、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。对于制剂，也可使用常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、膨胀剂、粘合剂、 润湿剂、崩解剂和表面活性剂等。非经肠道给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬剂、乳齐U、冻干剂、栓剂等。非水溶剂和悬剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、或可注射酯类如油酸乙酯来制备。包含本发明的聚Y _谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的佐剂的剂量可以随着受试者的年龄、性别和体重、给药途径以及疾病的严重程度而变化。此外，本发明的聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒可添加到包括用于预防和治疗癌症的预防或治疗性疫苗的药用组合物中，所述癌症尤其是皮肤黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、外阴癌、膀胱癌、脑癌、和神经胶质瘤，以及慢性非传染性疾病。
实施例下文将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而非用于限制本发明的范围。实施例1 超高分子量聚_ Y _谷氨酸的制备配制用作生产聚-Y-谷氨酸的基础培养基(补充3% L-谷氨酸；包含葡萄糖 3%，(NH4)2S04 1 %，KH2PO4 0. 27%, Na2HPO4 · 12H20 0. 17%, NaCl 0.1%,柠檬酸钠 0. 5%, 大豆蛋白胨0.02% ,MgSO4 ·7Η20 0. 7%，维生素溶液10ml/L，PH 6.8)并灭菌。将芽孢杆菌 chungkookjang(Bacillus subtilis var. chungkookjang) (KCTC 0697BP)的培养基(LB 培养基)以4%的浓度接种到5L发酵罐(工作体积3L)的培养基中，并以500rpm搅拌速度、 Ivvm吹气速率和37°C发酵48小时。接着使用小压滤机(1%硅藻土)移除细菌细胞，将剩余材料作为包含聚_ Y _谷氨酸的样品溶液使用。用2N硫酸溶液将包含聚-Y-谷氨酸的样品溶液的pH调节到2.0，然后于10°C或更低温度静置15小时，从而获得聚Y-谷氨酸沉淀。将得到的材料用足量的pH3. 5或更高的冷蒸馏水(10°C或更低)冲洗，然后通过Nutsche过滤器过滤，收集聚Y-谷氨酸，然后冷冻干燥，从而制备超高分子量聚Y-谷氨酸。实施例2 聚Y-谷氨酸_壳聚糖纳米颗粒的制备使用在实施例1中制备的聚Y-谷氨酸和壳聚糖(Amicogen有限公司，韩国)来制备作为佐剂的纳米颗粒。具体地，将聚Y-谷氨酸和壳聚糖溶解在0.85%的NaCl溶液中。将聚Y -谷氨酸溶液和壳聚糖溶液以1 1-8 1(聚Y-谷氨酸壳聚糖)的比例彼此混合，从而制备表面带负电荷的聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒。使用DLS(动态光散射)测量所制备的纳米颗粒的颗粒大小和表面电荷。结果看出，所制备的纳米颗粒具有200-300nm的颗粒大小和-20. SmV的表面电荷。此外，用电子显微镜观察所制备的纳米颗粒的表面形貌(见图 1)。[表1]聚Y-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的颗粒大小和表面电荷


本发明涉及包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物和包含该佐剂组合物的疫苗组合物，更具体地，本发明涉及包含通过在壳聚糖和安全性有保证的聚γ-谷氨酸之间进行离子键合而制备的纳米颗粒的佐剂组合物，以及包含该聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。包含该聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂的毒性和副作用很小或没有，并且被添加到预防和治疗病毒及细菌感染以及癌症的人类或动物疫苗中，增加抗体的产生。