专利名称：一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法及其应用的制作方法硬毛栓孔菌是中药和食品中用途广泛的真菌之一，含有十分丰富的营养物质，它具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇的特点，还富含有多种维生素和矿质元素等成分，如钾、钠、钙、铁、锌、镁、磷等。卷烟中添加一定的香料成分可以改善其吸食品质，目前很多天然提取物对烟草的加香作用引起了人们的重视。从硬毛栓孔菌菌丝体和发酵液中提取的多糖均具有极强烈的抑制癌细胞活性，抗氧化活性和免疫调节功能，是良好的免疫增强剂，可提高动物机体IgM的量等作用。目前很多天然提取物对烟草的加香作用引起了人们的重视，真菌多糖作为烟草添加剤，经高温裂解或梅拉德反应将会产生一定的香气。
本发明的目的是提供一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中达到加香的效果。本发明的技术方案是一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源5. 5飞g/L胰蛋白胨，碳源50 55 g/L麦芽糖，接种量为3 5%，起始pH为5，温度25 30で，搅拌发酵转速140 160转/分钟，发酵6 10天。所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法优选为氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麦芽糖，接种量为4%，起始pH为5，温度28°C，搅拌发酵转速150 r/min,发酵8天。一种硬毛栓孔菌胞外多糖的应用，将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. 02、. 1%。一种硬毛栓孔菌胞外多糖的应用，将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数优选为O. 04、. 6%。本发明的有益效果是本发明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可达10. 0982g /し烟丝中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在O. 02% O. 10%内变动时，其在卷烟烟气中的转移率也从I.58%到3. 39%逐渐增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟中起到到了烘托香气、増加烟气浓度风格的作用，有助于提高卷烟的品质。 一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源6 g/L胰蛋白胨，碳源55 g/L麦芽糖，接种量为5%，起始pH为5，温度30で，搅拌发酵转速160转/分钟，发酵10天。将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. 1%。、实施例2 一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源5. 5 g/L胰蛋白胨，碳源50 g/L麦芽糖，接种量为3%，起始pH为5，温度25で，搅拌发酵转速140转/分钟，发酵6天。将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. 02%。实施例3
一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源5. 5飞g/L胰蛋白胨,碳源5(T55 g/L麦芽糖，接种量为3 5%，起始pH为5，温度25 30で，搅拌发酵转速14(Tl60转/分钟，发酵6^10天。将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数为O. 02、. 1%。实施例4
一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麦 芽糖，接种量为4%，起始pH为5，温度28°C，搅拌发酵转速150 r/min，发酵8天。将硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷烟中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟烟丝中的添加质量分数优选为
O.04、. 6%。本发明菌株为硬毛栓孔菌，菌株保藏编号200800，购买自美国菌种保藏中心ATCC0单料烟丝云南宣威HClF ;散花成品烟重量O. 83g，烟支吸阻1050Pa，烟支规格84mmX 24. 5mm,滤嘴长30 mm ;重蒸酹(> 98%,索来宝科技有限责任公司);无水こ醇(北京化エ厂)、葡萄糖(索来宝科技有限责任公司)、氯化钠(天津市大茂化学试剂厂)和硫酸(北京化エ厂)等均为分析纯。Bruker TENSOR 27红外光谱仪(FT-IR，德国)；CXG-1电脑恒温层析柜(上海青浦泸西仪器厂)；WaterS 2487紫外检测器(美国water公司)；UV1700PC紫外可见分光光度计(Phenix公司);METTLER 4E200电子分析天平(上海沛欧分析仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；LM5+吸烟机(德国Borgwaldt)。I.硬毛栓孔菌发酵时间的确定
(I)斜面菌种培养配制改良的PDA固体培养基，改良的PDA固体培养基配方为250g/L 土豆，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，琼脂2%，琼脂的质量为土豆、葡萄糖和蛋白胨总质量的2%，分装试管，灭菌后制备斜面，划线接种硬毛栓孔菌后，在25 28で的条件下培养3飞天，冷冻保藏，得到硬毛栓孔菌株菌种；
从保存硬毛栓孔菌株菌种的试管中，使用接种钩在试管斜面取出O. 5平方厘米的一块，接种到PDA固体平板培养基中，PDA固体平板培养基的配方为葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，2%琼脂，琼脂的质量为葡萄糖和酵母粉总质量的2% ;接种时要使接种块上包含尽量少的培养基，ー个平板接两块，放入恒温培养箱，在25 28 V的条件下培养61天；
使用直径O. 5cm的打孔器，从PDA固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体，接种于液体种子培养基中(250ml三角瓶,50毫升培养液),液体种子培养基的配方为葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，在25 28°C，140 160 r/min条件下培养3 5天，然后以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养，基础培养基的配方为葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L ；每两天測定一次菌丝和EPS含量，确定硬毛栓孔菌最佳发酵时间。当发酵到第8d时，发酵液中胞外多糖含量为2. 50g/L。2.发酵产硬毛栓孔菌胞外多糖的分离纯化
硬毛栓孔菌发酵结束后，将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液，发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水こ醇，4°C过夜。10000r/min离心lOmin，得沉淀为粗多糖；称取O. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸馏水，用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量(g/L)。Sevag法脱蛋白称取Ig的粗多糖样品，室温下加入50mL蒸懼水溶解,加入1/4体积的氯仿一正丁醇(预先配制成体积比为4 I混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振摇30 min后,经离心机1000r/min离心5 min,然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿一正丁醇溶液，重复上述过程，共计重复二次。用硫酸-苯酚法对胞外多糖进行检测。纯化出的胞外多糖成分用旋转蒸发仪浓缩至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制硬毛栓孔菌胞外多糖纯品①和多糖纯品②，真空冷冻干燥保存。3.硬毛栓孔菌胞外多糖的红外和核磁分析
取多糖组分①和②各lmg，用溴化钾(KBr)压片后进行红外(IR)分析。对硬毛栓孔菌 胞外多糖组分①和②进行红外光谱监测得红外光谱图。从硬毛栓孔菌胞外多糖组分①和②的特征吸收波数可知，在3412CHT1有ー特征峰，因为O-H的伸缩振动在3600-3200 cnT1出现ー宽峰，在该糖中应存在-OH ;在波数2929CHT1处有ー特征峰，是C-H键的伸缩振动，是糖类的特征吸收；在I. 73 X IO3 cnT1和I. 25 X IO3 cnT1左右有吸收峰，说明有こ酰基的存在；多糖在1646 cnT1为C=O非対称伸缩振动，在1646 cnT1和1085 cnT1左右存在吸收峰，说明有羧酸存在，为酸性多糖，在796 cm—1处存在吸收峰，为甘露糖结构；910和880 cm—1处有吸收峰，说明多糖①和②有α和β糖
苷键。由硬毛栓孔菌胞外多糖的1H-NMR可知δ 5. 00及5. 03的共振信号，即Cl质子区的信号峰在5. O以上，进ー步证明糖苷键为α型；中心在δ 3. 78处的重峰表明存在一个亚甲基CH2，δ 3. 85为CH3-0的质子氢信号，说明在硬毛栓孔菌胞外多糖中可能存在着甲氧基的取代。经过红外光谱与核磁共振光谱分析可知，多糖①可能是ー种具有α-糖苷键的部分こ酰化的酸性多糖，多糖②可能是ー种具有β -糖苷键的酸性甘露聚糖，并具有甲氧基的取代。4.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在烟气中转移率的測定
称取0. Ig精制EPS溶于IOmL蒸馏水中，配成10mg/mL精制EPS储备液；取不同体积精制胞外多糖储备液(并加蒸馏水补充到0. 5mL，注射进散花成品烟中，使烟支中胞外多糖含量分别达到烟支质量的0. 02%,0. 04%,0. 06%,0. 08%,0. 1%，并做注射0. 5mL蒸馏水的空白对照，每组10支；放入恒温恒湿箱(温度22°C，湿度60%)平衡48 h ;然后用吸烟机对烟支进行抽吸；将抽吸后的剑桥滤片放入150mL三角瓶中，加入50mL无水こ醇超声lh，倒掉こ醇，然后加入50mL无水こ醇超声0. 5h,倒掉こ醇,再加入50mL蒸懼水超声两次,姆次Ih,合并滤液，用硫酸-苯酚法測定多糖含量，计算其在烟气中转移率在2. 3% 3. 3%之间变动，确定了硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟中使用的可行性。转移率=(实验组剑桥滤片上多糖量-対照组剑桥滤片上多糖量)/多糖添加量。多糖在烟气中的转移率随其在多糖中浓度的増加而增カロ，在多糖添加量为0. 02%时，转移率为I. 58%，在多糖添加量为0. 08%时，转移率为3. 28%。而多糖添加量超过0. 08%达到0. 1%时，多糖在烟气中的转移率为3. 39%。5.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟中的感官评价 表I硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟的感官评价结果


本发明公开了一种硬毛栓孔菌胞外多糖的发酵方法，氮源5.5~6g/L胰蛋白胨，碳源50~55g/L麦芽糖，接种量为3~5%，起始pH为5，温度25~30℃，搅拌发酵转速140~160转/分钟，发酵6~10天。本发明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可达10.0982g／L。烟丝中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在0.02%～0.10%内变动时，其在卷烟烟气中的转移率也从1.58%到3.39%逐渐增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷烟中起到到了烘托香气、增加烟气浓度风格的作用，有助于提高卷烟的品质。