利用通过多磷酸分解作用(app)反应的活化聚合核酸的制作方法[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求在35U.S.C.§ 119(e)下,美国临时专利申请号61/422,477(其于2010年12月13日提交,并以其整体通过参考的方式并入本文)的优先权权益。[0004]本公开涉及核酸(或者核苷酸)的聚合方法,利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化。聚合作用可以使用具有3’ -末端以双脱氧核苷酸封闭的引物,在含有焦磷酸酯(PPi)和dNTP平衡的反应混合物中实现。这些方法已经先前在,例如,美国专利号6,534,269B2, 7,033,763B2, 7,238,480,7,105,298,7,504,221 和 7,919,253 中描述过。相似的方法也在USPN7,745,125中描述。这些方法也有许多应用,包括存在野生型等位基因时罕见等位基因的检测(例如,在存在IO6-1O9野生型等位基因时的一种突变的等位基因)。所述方法对于以下时有用的,例如,检测微小残留病致病剂(例如,在缓解期间罕见的剩余癌细胞,尤其是P53基因或其它先前确定肿瘤内的抑癌基因的突变),和/或测量突变负荷(例如,出现在正常组织中特定的体细胞突变的频率,如血液或尿液)。这些方法的其他应用对本【技术领域】的技术人员是已知的。[0005]那些在本【技术领域】的技术人员的期望进行这种方法的改进方法。已经令人惊讶地发现,其他一些化合物也能够解封闭核酸。本文所述的方法使用各种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzing agent)执行APP反应。从这种改进的方法的下面描述中,这些方法的优点将是显而易见的。`
[0006]图1.使用三磷酸酯-催化的APP滴定人类DNA。
[0007]图2.比较三磷酸酯-催化的APP与基于SYBR Green I的检测。
[0008]图3A,3B和3C.通过Power SYBR从质粒进行的扩增例子。
[0009]图4A,4B,和4C.从质粒DNA进行三磷酸酯_催化的APP扩增的例子。
[0010]图5.使用PA-10,比较三磷酸酯-和PP1-催化的反应。
[0011]图6A,6B, 6C, 6D, 6E和6F.三磷酸酯-和PP1-催化的反应示例性的扩增曲线和解
离曲线。
[0012]图7.以125pg人类DNA输入进行的PP1-催化的反应的解离曲线。
[0013]图8.使用PA-17,比较三磷酸酯-和PP1-催化的反应。
[0014]图9.A.线性扩增的动力图谱。B.使用完美匹配底物和错配底物的三种反应的线性扩增的相对率。[0015]图10.在存在多种浓度的TP情况下,通过Therminator III的线性延伸。
[0016]图11.通过RQY,使用Mn++作为辅助因子,ddC_封闭的引物的解封闭和延伸。
[0017]图12.四磷酸酯-引发的PCR。
[0018]图13.1DP-引发的 PCR。
[0019]图14.在常规PCR (填充的)中和在APP PCR (开放)中,具有4_(菱形)、6_(方形)、或者9-(三角形)碱基重叠的引物之间的扩增曲线。
[0020]图15.在常规PCR (填充的)中和在APP PCR (开放)中,48引物单独的扩增曲线。
[0021]图16.使用APP的数字RCR。
[0022]图17.使用传统基于染料的master mix的数字RCR。
[0023]图18.在使用APP和使用传统基于染料master mix的数字PCR中,阴性反应和阳性反应的Ct分布。
[0024]本文描述的是利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化,从测试样品扩增靶核酸的方法。在某些实施方案中,APP使用一种或多种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzingagent)实现。在一些实施方案中,所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公示I代表:
[0025]
利用通过多磷酸分解作用(app)反应的活化聚合核酸制作方法
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