专利名称：液体发酵制备生物农药的方法二十世纪八十年代以来，我国蔬菜种植业迅猛发展，种植面积由1980年的316万公顷增长到2008年的1787万公顷。蔬菜多为连年种植，从而导致某些病害的病原菌大量积累，加上大棚种植的推广，给蔬菜病害的发生、发展提供了适宜的条件。一些土传性病害，如黄瓜枯萎病、茄子黄萎病和青椒疫病等，会导致作物减产30%、甚至绝产。长期以来，在蔬菜病害防治方面，化学农药由于其见效快，杀菌谱等特点，在病害 防治中占据了主要位置。但是长期大量使用化学农药会导致土壌中有益微生物群落減少，破坏生物群落结构，造成环境污染，并导致病原菌产生耐药性和抗药性，从而化学农药用量逐年増加，带来更加严重的环境问题，以至于许多化学农药被禁用或即将被禁用。利用生物防治的方法防治蔬菜病害不仅避免了化学农药带来的一系列问题，而且安全、有效和持久，不容易使病原菌产生抗药性，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留。随着人们对生态环境和自身健康的日益关注，生物农药将逐步取代传统的化学农药，成为防治蔬菜病害的主要产品。如专利KR20090035368A公开的预防大白菜根肿病的芽孢杆菌组合物，专利KR100896041B1公开的预防番茄和马铃薯枯萎病的葡萄球菌组合物，专利KR100890013B1公开的能够杀灭南瓜疫病菌的枯草芽孢杆菌组合物，专利HU225133B1公开的Erwinia anylovora ATCC15580菌株用于预防植物病原菌和昆虫的危害。木霉菌(Trichoderma spp.)是ー种分布广泛的土壤习居菌,具有对植物病原菌真菌的拮抗作用，可利用各种简单或复杂的碳源和氮源，甚至具有转化和降解ー些有害或持久存在的污染物的能力。木霉菌能够够产生多种拮抗作用，如竞争作用、重寄生作用、产生抗生物质和溶菌酶类、促进植物生长等，是ー种广谱性生防菌，尤其适用于防治土传疾病，如专利CNlO 1861879A公开的木霉菌分生孢子可湿性粉剂，另外国外已有商品化的木霉菌制剂，如美国TopShield (主要成分哈茨木霉T22)，以色列Trichodex (主要成分为哈茨木霉T39)。目前国内木霉菌生产エ艺主要以固体发酵为主，专利CN101024816B公开的木霉菌分生孢子粉尘剂的制备方法，采用麦麸、秸杆粉或玉米渣、稻壳等制成培养基；专利CN101485336A公开的防治作物土传病害的木霉菌制剂，采用谷壳、玉米粉和麦麸制成培养基；专利CN101565688A公开的木霉孢子菌剂，采用农副产品和磷肥等组成培养基；专利CN101195807A公开的木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法,也是米用固体发酵的方式；王英姿等在《緑色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选》(植物保护，2007年第33卷第2期，61飞3页)一文中利用廉价农副产品为原料进行固体发酵，并进行正交试验筛选出最佳组合配方。但是固体发酵エ艺繁琐，工作量大，不利于エ业上大規模生产。虽然目前也有关于单菌液体深层发酵的报道，但主要以生产分生孢子为主，如专利CN101671625A公开的液体深层发酵方法和装置。但是分生孢子保存期较短，导致产品货架期短；同时由于受到培养液等条件限制，使得通常的发酵罐液体深层培养发酵条件下，不具备产孢条件。
本发明提供了ー种液体发酵制备生物农药的方法，可以实现多个菌种或菌株同时发酵，生产厚垣孢子的活性孢子粉，相对于固体发酵，本发明エ艺简单、设备投资小；相对于液体发酵的现有技术生产的分生孢子，本发明产品货架期长；而且多个菌种或菌株同时发酵制备的产品，应用范围更广。本发明液体发酵制备生物农药的方法，步骤包括 步骤I，菌种接种于培养基(如PDA固体培养基)中，恒温培养； 步骤2，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液； 步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子； 步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。本发明还提供了ー种多菌种同时发酵制备生物农药的方法，步骤如下 步骤1，測定各种菌种的生长速度和相容性，并选择相容性好和生长速度相同或相近的菌种；
步骤2，各种菌种分别接种于培养基(如PDA固体培养基)中，恒温培养；
步骤3，将选择的菌种分别转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；
步骤4，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中混合均匀，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；
步骤5，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。其中，本发明所述“多菌种”指的是不同的多个菌种或同一菌种的多个不同菌株，所述“相容性好”和“生长速度相同或相近”的含义对本领域技术人员来讲是明确的。本发明步骤I中所述“培养基”和步骤2、3中所述“培养液”，在没有特别说明的情况下，本领域技术人员可根据不同菌种采用现有技术进行选择和配制。优选地，本发明所述培养液组分包括蚕豆粉、葡萄糖、酵母提取物、混合果蔬汁；具体地，所述培养液优选为
蚕豆粉2wt% ；
葡萄糖0. 2wt% ；
酵母提取物 0. 4wt% ；
混合物果蔬汁3wt% ； pH 值7.5。其中，所述混合果蔬汁为市场采购水果和蔬菜采用现有技术在不加水的条件下进行榨汁得到。根据本发明所述方法的ー种优选实施方式，采用拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和绿色木霉菌作为菌种进行发酵制备生物农药，步骤如下
步骤1，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和緑色木霉菌分别接种于土豆汁培养基，所述土豆汁培养基组分包括
土豆汁20wt% ；
葡萄糖0. 2wt% ；
琼脂1.8wt%。
25 30°C条件下恒温培养3飞天，观察三个菌种的相容性和生长速度，三个菌种相容性和生长速度符合生产要求，进行下ー步骤；
步骤2，拟康氏木霉菌、哈茨木霉菌和緑色木霉菌按照步骤I所述方法进行培养；
步骤3，将三个菌种分别转移至装有本发明上述培养液的摇瓶中，25 30°C和18(Tl85rpm转速条件下培养，获得分生孢子液；
步骤4，发酵罐中投入本发明上述培养液，高温高压灭菌；发酵罐保持正压降温至25 30°C，倒入步骤3获得的三个菌种的分生孢子液进行混合；25 30°C、0. 4^0. 5kg压力、180(T3500L/h空气流量和18(Tl85rpm转速条件下发酵获得厚垣孢子；
步骤4，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。步骤I中測定各种菌种的生长速度和相容性的方法优选为哈茨木霉，緑色木霉菌和拟康氏木霉菌采用点接法均匀的接种到土豆汁培养基培养皿的四周，在25-28°C条件下培养3-5天以后观察三个不同菌种的相容性。步骤2中所述培养方法具体优选为将拟康氏木霉，哈茨木霉和绿色木霉在无菌条件下分别接种在所述土豆汁培养基茄形培养瓶内，塞上无菌棉花塞，然后将茄形培养瓶放入恒温培养箱中，在25-28°C条件下培养3-5天。步骤3所述摇瓶培养方法优选为将拟康氏木霉，哈茨木霉和绿色木霉在无菌条件下分别转移至装有300ml所述培养液的IL摇瓶中，将所述摇瓶放在摇床上，26 28°C、180rpm转速条件下培养3天。根据本发明所述方法的一种更优选实施方式，步骤如下
步骤1，測定各种菌种的生长速度和相容性，具体操作可參照上述方法；
步骤2，按照上述培养方法培养菌种；
步骤3，按照上述摇瓶培养方法进行摇瓶培养，得到分生孢子液(即ー级种子)；
步骤4，配制所述培养液，并投入中级发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至25 30°C，倒入步骤3得到的三个菌种的分生孢子液进行混合，25 30°C、0. 4^0. 5kg压力、180(T2100L/h空气流量和18(Tl85rpm转速条件下发酵，得到ニ级种子；
步骤5，配制所述培养液，并投入大体积发酵罐中，高温高压灭菌，发酵罐保持正压，冷却至25 30で，将步骤4中得到的ニ级种子转移至所述大体积发酵罐，25 30°C、0. 4^0. 5kg压力、36 42m3/h空气流量和18(Tl85rpm转速条件下发酵，获得厚垣孢子；
步骤6，厚垣孢子粉与硅藻土混合均匀，过滤分离得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述硅藻土厚垣孢子混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。其中，上述中级发酵罐指的是大于IL而小于I吨规格的发酵罐，大体积发酵罐指的是大于等于I吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。步骤4中所述中级发酵罐发酵方法优选为65L所述培养液投入100L规格的发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至28°C，倒入步骤3得到的三个菌种的分生孢子液进行混合，28±0. 5°C、0. 4 0. 5kg压力、180(T2100L/h空气流量和185rpm转速条件下发酵，得到ニ级种子。步骤5中所述大体积发酵罐发酵方法优选为1200L所述培养液投入2吨规格的发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至28°C，将步骤4中得到的ニ级种子转移至所述大体积发酵罐，28±0. 5°C、0. 4^0. 5kg压力、36 42m3/h空气流量和185rpm转速条件下发酵，获得厚垣孢子。上述方法中所述高温高压灭菌优选为121°C温度、15磅压カ下灭菌25分钟。 上述方法中，优选地，所述高温高压灭菌前，向所述发酵罐内投入消泡剂，所述100L规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为100ml，所述2吨规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为1000ml。上述方法中所述硅藻土颗粒大小优选为700目，所述硅藻土与所述厚垣孢子体积比优选为1:1。上述方法中所述过滤优选为采用板框压滤机过滤分离。上述方法中所述硅藻土厚垣孢子混合物干燥温度优选为35°C。本发明提供了ー种液体发酵制备生物农药的方法，エ艺简单、设备投资小；本发明还提供了一种多菌种同时液体发酵制备生物农药的方法，产品应用范围更为广泛。本发明还提供了ー种上述液体发酵制备生物农药的方法制备的生物农药，所述生物农药生物活性成分为厚垣孢子，如拟康氏木霉厚垣孢子、哈茨木霉厚垣孢子和緑色木霉厚垣孢子中的ー种或任意几种的混合物。同时本发明提供了一种新的液体发酵培养液，采用常见的蚕豆、水果和蔬菜为原料，成本低，制备简单，而且解决了传统液体深层发酵无法形成孢子的难题。本发明上述制备生物农药的方法，产品为活性厚垣孢子粉，抵御外界不良环境能力強，寿命长，因此可长时间储存，货架期长。

步骤2，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；
步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；
步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。其次，本发明还提供了一种多菌种同时液体发酵制备生物农药的方法，步骤如下
步骤1，測定各种菌种的生长速度和相容性，并选择相容性好和生长速度相同或相近的菌种；
步骤2，各种菌种分别接种于培养基中，恒温培养；
步骤2，将选择的菌种分别转移至培养液进行摇瓶培养，得到分生孢子液；
步骤3，发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的分生孢子液倒入发酵罐中混合均匀，加压通入无菌空气，进行发酵，得到厚垣孢子；
步骤4，厚垣孢子发酵液中加入硅藻土，搅拌均匀，过滤得到硅藻土厚垣孢子混合物，所述混合物经过干燥粉碎得到活性厚垣孢子粉。优选地，上述方法中所述培养液组分包括蚕豆粉、葡萄糖、酵母提取物、混合物果蔬汁。下面通过具体实施例对本发明上述方法进行详细介绍和描述，以使更好的理解本发明，但是下述具体实施例并不限制本发明范围。实施例I
哈茨木霉菌无菌条件下接种于装有土豆汁培养基的茄形培养瓶内，塞上无菌棉花塞，然后将茄形培养瓶放入恒温培养箱中，在25 28°C条件下培养3-5天。土豆汁培养基主要组分如下


本发明涉及一种液体发酵制备生物农药的方法，所用液体发酵培养液包括蚕豆粉、混合果蔬汁、葡萄糖和酵母提取物。采用本发明方法和培养液制备的产品为活性厚垣孢子粉，货架期长；而且本发明可以实现多菌种同时液体发酵，因此产品应用范围更为广泛。