Loc401296基因及其在调控细胞周期和细胞生长中的应用的制作方法 【技术领域】 [0001]本发明涉及一种L0C401296基因及相应的蛋白在调节细胞周期、控制细胞生长等方面的应用，属于基因工程【技术领域】。 [0002]细胞周期是进行连续分裂的细胞完成一次分裂开始至下一次分裂完成时为止的一段时期，被认为是细胞完整的生命过程，是维持细胞生长、增殖的基本生物学事件。细胞周期是一个连续变化过程，根据研究的需要被人为划分为间期和分裂期，间期包括Gl期、S期、G2期，分裂期指M期，另外，停止分裂的细胞被视为处于周期静止的GO期。其中，M期指染色体开始凝集浓缩、核膜崩解、遗传物质重新分配、一个母细胞分裂形成两个子细胞的一段时间，是细胞的“分娩”阶段。细胞周期过程，尤其是有丝分裂期在细胞生长、凋亡发生、肿瘤生长等生物学过程发挥重要作用，这些生物学过程受到多种基因的调控。 [0003]L0C401296是大规模基因组测序中发现的一个假想基因，该基因编码全长194个氨基酸的假想蛋白，目前对该基因未有任何功能报道。我们研究发现，L0C401296基因在多种细胞系中广泛表达，采用siRNA方法下调L0C401296表达可以促使细胞发生G2/M期阻滞，引起细胞发生有丝分裂异常，诱导细胞凋亡。进一步分析发现，下调L0C401296基因表达可以引起纺锤体形成异常，抑制HeLa、A549、MCF-7等多种细胞生长。

[0004]本发明提供一种调控细胞周期的基因:L0C401296基因。L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白可用于调控细胞增殖和凋亡的速度、调节细胞周期、制备抗癌药物、筛选鉴定抗癌药物。
[0005]本发明中的L0C401296基因对应的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。所述L0C401296基因编码的蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID N0.6所不。
[0006]本发明中的“抑制剂”可以是蛋白、RNA或小分子化合物等。优选地，抑制剂是一种蛋白，更优选地，抑制剂是一种抗体，该抗体能够结合L0C401296基因编码蛋白质，从而抑制L0C401296基因和/或它对应的mRNA和/或它对应的蛋白质。优选地，抑制剂是一种RNA，可以是干扰性RNA分子，所述干扰性RNA分子可以是双链RNA，例如siRNA (shortinterfering RNA)、miRNA (microinterfering RNA)等，或者单链 RNA,例如 shRNA (shorthairpinRNA)，它们能通过RNA干扰作用引起L0C401296靶基因mRNA的降解(例如siRNA或miRNA的情形)或者能够形成具有这种功能的分子(例如shRNA的情形)。更优选地，抑制剂是一种siRNA，所述siRNA的两条链的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
[0007]本发明中的癌症为包括但不限于卵巢癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。优选地，所述癌症是子宫颈癌、乳腺癌、肺癌。
[0008]本发明提供了一种调控细胞周期的方法，是通过调控L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。
[0009]本发明还提供一种调控细胞增殖的方法，是通过调控L0C401296基因的表达或调控L0C401296基因对应mRNA的表达或调控L0C401296编码的蛋白的表达量和活性，从而调控细胞增殖。进一步，本发明提供了一种抑制细胞增殖的方法，其特征在于，是通过抑制剂抑制L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性，从而抑制细胞增殖。
[0010]本发明还提供一种抑制细胞凋亡的方法，是通过表达或上调L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性，从而抑制细胞凋亡。
[0011]本发明还提供了一种诱导细胞凋亡的方法，是通过抑制剂抑制L0C401296基因的表达或抑制L0C401296基因对应mRNA的表达或抑制L0C401296编码的蛋白的表达量和活性。
[0012]本发明还提供了一种鉴定、筛选抗癌药物的方法，是利用L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白筛选能够抑制L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性的物质。优选地，将将待测试剂与细胞接触，进一步检测L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白，与对照细胞相比，L0C401296基因表达水平降低或其编码的蛋白活性降低时，指示待测试剂为抗癌或抗肿瘤药物。
[0013]本发明还提供了一种制备抗癌药物的方法，是采用抑制剂来制备抗癌或抗肿瘤药物，该抑制剂抑制L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白。
[0014]本发明还提供了一种L0C401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序列在抑制细胞凋亡中的应用，优选地，通过上调L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性，从而抑制细胞凋亡。
[0015]本发明还提供了一种L0C401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序列在鉴定和/或筛选抗癌药物中的应用，是利用L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白筛选能够抑制L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性的物质。优选地，将将待测试剂与细胞接触，进一步检测L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白，与对照细胞相比，L0C401296基因表达水平降低或其编码的蛋白活性降低时，指示待测试剂为抗癌或抗肿瘤药物。
[0016]本发明还提供了一种L0C401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序列在调节细胞周期中的应用，是通过调控L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。
[0017]本发明还提供了一种抑制剂在促进细胞凋亡中的应用，所述的抑制剂抑制L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。
[0018]本发明还提供了一种抑制剂在抑制细胞增殖中的应用，所述的抑制剂抑制L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。
[0019]本发明还提供了一种抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抑制剂抑制L0C401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。
[0020]本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物可以用于治疗癌症或肿瘤，该药物组合物可以用于促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，所述的药物组合物包含一种抑制剂，该抑制剂抑制L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白。该药物组合物还可以进一步包含其他物质，优选地，可以包含药学上可接受的载体、赋形剂，可以包含其他抗肿瘤药物、具有肿瘤靶向功能的配体等。
[0021]本发明又提供了一种预防、治疗或缓解L0C401296基因相关疾病或病症、例如肿瘤的方法，其包括对有此需要的个体施用一种抑制剂，该抑制剂抑制L0C401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白。优选地，向有此需要的个体施用本发明的一种或多种干扰性RNA、药物组合物。
[0022]本发明对功能未知基因L0C401296进行研究。经研究发现L0C401296基因在多种细胞系(HEK293、U937、Hela、Lo2、!fepG2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7 等细胞)广泛表达。抑制L0C401296基因表达可引起HeLa、A549、MCF-7肿瘤细胞生长抑制，这意味着能够抑制L0C401296基因表达的物质均有可能具有抑制肿瘤细胞生长的作用，L0C401296基因可作为筛选抗肿瘤药物的靶点分子。下调该基因表达后细胞生长受到明显抑制、凋亡增加、出现了明显的G2/M期阻滞，进一步研究证明L0C401296基因细胞有丝分裂进程和纺锤体形成过程，是一种新的细胞周期调控分子。本发明成果为后续功能研究提供奠定了基础。




[0023]图1为L0C401296mRNA在不同细胞系中的表达情况。
[0024]图2为靶向L0C401296的siRNA对L0C401296mRNA和蛋白表达的抑制作用。
[0025]图3为下调L0C401296对HEK293细胞形态影响。
[0026]图4为回转L0C401296表达挽救细胞形态改变。
[0027]图5为下调L0C401296表达对多种细胞生长的影响。(siRNA_NC代表转染siRNA-NC 对照组；siRNA-L0C401296 代表转染 siRNA_2# 的 L0C401296 表达下调组)。
[0028]图6为下调L0C401296表达对细胞凋亡的影响。(A: siRNA_2#转染HEK293细胞后2天、3天，检测细胞凋亡及统计分析；B:siRNA-2#转染Hela细胞后2天、3天，检测细胞凋亡及统计分析)。
[0029]图7为下调L0C401296对HEK293和HeLa细胞周期分布影响。
[0030]图8为下调L0C401296对HeLa细胞有丝分裂阻滞的影响。
[0031]图9为回转L0C401296表达挽救HeLa细胞有丝分裂阻滞。
[0032]图10为下调L0C401296对HeLa细胞有丝分裂进程的影响。
[0033]图11为下调L0C401296对HeLa细胞纺锤体形成的影响。


[0034]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。如果无特殊说明，本发明所用仪器、试剂和材料均可通过常规途径或手段获取。
[0035] 实施例1L0C401296基因的获得
[0036]提取人外周血总RNA，采用逆转录试剂盒获取外周血cDNA。根据NCBI提供的L0C401296基因(GenBank:BC132760.1)对应的cDNA全长序列设计引物(上游引物5 ‘atggactggggaggagg3’和下游引物 5 ‘tcagaaagtgcccgattccaag3’)。采用此引物对，以外周血cDNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物连接到T载体，经测序后与NCBI提供的序列进行比对，结果表明我们获取L0C401296基因的全长cDNA序列。
[0037]实施例2L0C401296基因在多种细胞中表达
[0038]采用常规方法培养HEK293、U937、Hela、Lo2、HepG2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7细胞。待细胞处于指数生长期分别收集细胞，提取总RNA，经逆转录反应获取上述细胞的cDNA。以上述 cDNA 为模板,米用 L0C401296 的引物对(上游:5‘acctgctctggggttgccat3’，下游:5 ‘acgtagccttgctgggtgtg3’ )进行 PCR 扩增，分析 L0C401296 基因的 mRNA 在上述细胞中的表达情况。结果表明在 HEK293、U937、Hela、Lo2、H印G2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7细胞中均检测到L0C401296基因的mRNA表达，表明L0C401296是一个广泛表达的基因(图1)。
[0039]实施例3L0C401296特异性siRNA抑制L0C401296的mRNA和蛋白表达
[0040]L0C401296特异性siRNA序列(siRNA-1#和siRNA-2#)和用于对照组的随机siRNA序列(siRNA-NC)如表1所示。按照Lipofectamine2000转染试剂说明书将siRNA分别转染HEK293细胞，siRNA终浓度为ΙΟΟηΜ。转染后48小时收集细胞，分别提取总RNA和总蛋白质，进行RT-PCR和western检测，分析siRNA序列对L0C401296表达的抑制作用。如图2所示，与siRNA-NC相比，siRNA_l#和siRNA_2#均能有效抑制L0C401296的mRNA和蛋白的表达。
[0041]表1siRNA 序列