人乳铁蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用的制作方法[0002]人乳铁蛋白(hLF)是一种多功能的糖蛋白。它的主要功能有:抑菌与杀菌、抗病毒、增强宿主防御和免疫调节工能、促进铁吸收、抗肿瘤生长和转移作用、影响自由基的生成等。作为机体防御组分的hLF不仅可用作药物治疗感染、癌症和免疫低下等病症，还可作为食品添加剂改善人民的健康。由于天然的人乳铁蛋白来源有限，目前还无法开发出产品来满足巨大的市场需求，科学家们正致力于利用转基因技术，特别是转基因动物-乳腺生物反应器生产重组人乳铁蛋白的研究。同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义务、维护国家形象的重要保障。[0003]乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。
[0004]本发明的目的是提供一种人乳铁蛋白单克隆抗体。[0005]本发明的另一目的是提供能分泌产生所述人乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[0006]本发明的再一目的是提供人乳铁蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人乳铁蛋白中的应用。[0007]本发明用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。
[0008]经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgGl+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白(bLF)反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。
[0009]杂交瘤细胞ZZY hLF 3D12的保藏号为:CGMCC N0.6394 ;保藏时间:2012年7月20日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。[0010]所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。Western Blot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。
[0011]本发明还提供以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到人乳铁蛋白多克隆抗体。纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到I: 200,000。
[0012]本发明还提供人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。
[0013]其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。
[0014]所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:
[0015]I)洗涤液；
[0016]2)底物显色液； [0017]3)反应终止液；
[0018]4)人乳铁蛋白标准品。
[0019]所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
[0020]所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。
[0021]所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤:
[0022]I)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；
[0023]2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；
[0024]3)加入底物显色液显色,加入反应终止液终止反应,测定0D450值；
[0025]4)以人乳铁蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。
[0026]具体包括以下步骤:
[0027]I IgG标准曲线的建立:
[0028]将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
[0029]II检测样品中人乳铁蛋白的含量:
[0030]将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；加入待检测样品，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
[0031]优选地，人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5 u g/mL,包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。
[0032]具体实施步骤如下:
[0033]I IgG标准曲线的建立:
[0034](I)包被:浓度为5 ii g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；[0035](2)封闭:加1501117孔封闭液，371:2小时后，洗涤3次，拍干，置41:冰箱保存备用；[0036](3)加标准样品:
[0037]混合转基因样品和非转基因样品制备人乳铁蛋白抗原标准品，标准品原始浓度为0.2mg/mL，分别按照 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 稀释，PBS作为阴性对照；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液IOOiI L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0038](4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0039](5)显色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C显色 15_30min ；
[0040](6)终止:加入终止液2M H2S0450 U L/孔；
[0041](7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
[0042]II检测样品中人乳铁蛋白的含量:
[0043](I)包被:浓度为5 ii g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；
[0044](2)封闭:加1501117孔封闭液，371:2小时后，洗涤3次，拍干，置41:冰箱保存备用；
[0045](3)加待测样品:
[0046]加入待测样品，100 U L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0047](4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0048](5)显色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C显色 15_30min ；
[0049](6)终止:加入终止液2M H2SO4 50 U L/孔;
[0050](7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
[0051]本发明的有益效果:本发明的人乳铁蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。本发明可用于转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白的定量检测，根据标准曲线在25~200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测，检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。



[0052]图1为免疫后小鼠血清WB检测结果图；其中Al:l#l:1000 ;A2:1#1:3000 ;A3:2#1:1000 ；A4:2#1:3000 ；A5:3#1:1000 ；A6:3#1:3000 ;A7:4#1:1000 ;A8:4#1:3000 ；A9:5#l:1000 ；A10:5#1:3000 ；
[0053]图2为腹水制备前细胞上清WB检测结果图；其中1:1C2 ；2:2G11 ；3:3A6 ；4:3D12 ；5:1C2 ；6:2G11 ；7:3A6 ；8:3D12 ；
[0054]其中，1-4道上样 hLF g ;5-8 道上样 bLF 4u g ；[0055]图3为SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度检测结果图；其中1:蛋白marker ；2:3D12小鼠单克隆抗体；
[0056]图4为单克隆抗体检测样品结果图；其中1:转基因牛奶；2:转基因牛奶；3:转基因牛奶；4:转基因奶粉(管壁)；5:转基因奶粉(管顶)；6:非转基因脱脂奶粉；7:非转基因脱脂奶粉；8:非转基因牛奶；9:非转基因牛奶；
[0057]图5为hLF多克隆抗体纯化考马斯亮蓝染色图；
[0058]其中，1-1:BSA2mg/mL ； 1-2:BSAlmg/mL ； 1-3:BSA0.5mg/mL ； 1-4:BSA0.25mg/mL ；
1-5:BSA0.125mg/mL ;1_6:BSA0.0625mg/mL:2~1:洗脱管 I ;2_2:洗脱管 2 ;2_3:洗脱管 3 ； 2-4:洗脱管4 ；2-5:洗脱管5 ；2-6:洗脱管6 ；
[0059]图6为hLF多克隆抗体效价图；
[0060]图7为hLF标准品检测标准曲线；
[0061]图8为模拟样品检测标准曲线。

[0062]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0063]转人乳铁蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室；日本大耳白兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人乳铁蛋白购自Sigma公司。
[0064]人乳铁蛋白(hLF)，牛乳铁蛋白(bLF)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司；四甲基乙二胺(TEMED)购自Amresca公司；96孔培养板、25孔培养板、6孔培养板、T-25培养瓶、T-75培养瓶、250mL培养瓶、2mL冻存管购自corning公司；超滤管购自Millipore公司；HAT、100XHT、PEG4000购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibico公司；石腊油购自BBI公司；HRP标记试剂盒(CatNo31488)购自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB (可溶型)购自天根生物公司；IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司。
[0065]层析柱购自Phamacia公司；涡旋仪，购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心机购自美国Sigma公司;ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDropl000紫外/可见分光光度计购自NanoDrop公司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、_80°C冰箱购自日本三洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BIO-RAD ;二氧化碳培养箱，购自SANYO ;蛋白电泳装置,购自BioRad公司；蛋白定量检测仪,购自AmershamBiosciences公司。
[0066]转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基因牛奶及脱脂奶粉购自超市。
[0067]实施例1hLF单克隆抗体的制备
[0068]1、小鼠抗体的制备
[0069]选择6周龄同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组，实验组5只(1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，对照组2只。实验组用hLF进行免疫，用PBS缓冲液代替hLF进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为100 u L用佐剂乳化好的抗原(250 u LPBS溶解400 u g抗原后与250 u L弗氏不完全佐剂混合，共500 u L，每只小鼠注射100 u L)。第一次基础免疫剂量为每只小鼠80 u g，加强免疫免疫剂量为每只小鼠40 ii g，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7天，尾静脉采血，检测血清中抗体滴度(间接ELISA法)，如滴度未达到1:104，ODl.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度达到I: IO4后的第10天眼眶采血，分离血清，-20°C保存备用。
[0070]2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平
[0071]以hLF作为包被抗原，包被浓度:20 u g/mL,利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ;对照组血清1:3000稀释。
[0072]hLF间接ELISA法测定的基本操作步骤如下:
[0073](I)包被:将hLF用包被液(磷酸缓冲液pH9.6)稀释至20 U g/mL，用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100 u L/孔，置4°C冰箱过夜。
[0074](2)洗涤:取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300 ii L/孔，静置Imin，重复操作3~5次。
[0075](3)封闭:用微量加样器按200 u L/孔加1%BSA，放入37°C温箱2h。
[0076](4)洗涤:同步骤2)。
[0077](5)加待检样本:用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ；对照组血清 1:3000 稀释，放入37°C温箱 Ih ；
[0078](6)洗涤:同步骤2)。
[0079](7)加酶标抗体:用PBST洗涤液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度1:5000，每孔加 100 u L，37°C温箱孵育 45min。
[0080](8)洗涤:同步骤2)。
[0081](9)加底物溶液:避光按100 U L/孔加入TMB底物溶液，室温孵育15min。
[0082](10)终止反应:室温下加终止液50 u L/孔,终止反应。
[0083](11)测0D450值:检测450nm波长下的OD值。
[0084]表1.经三次免疫后小鼠血清效价的测定结果
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