专利名称：制备低铁乳铁蛋白的方法乳为新生的哺乳动物提供必需的营养物。它还含有用于调理肠胃和其他身体机能、抵御影响健康的微生物的生物活性组分。Lf是存于乳和初乳中的几种生物活性组分之一。它还存在于多数外分泌流体，包括泪液和唾液中。Lf具有多种生物功能，包括调节铁代谢、免疫功能和胚胎发育。Lf对多种病原体包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母和真菌具有抗微生物活性。Lf的抗微生物活性部分归因于其结合某些细菌生长所必需的铁的能力。Lf还通过结合细菌膜上的脂多糖(LPQ从而破坏细胞壁来发挥杀菌活性(Ellison等，1988)。LPS是疏水的、带负电荷的分子，也被称为内毒素。Lf可以在LPS分离过程中从其环境清除LPS。人们已经发现了从蛋白制备物(Franken 等,2000 ；Petsch 禾P Anspach, 2000 ；Ropp 禾P Murray, 2006 ；Magalhaes 等，2007)和从 Lf (Rowe 等，2006 ；Naidu, 2006 & 2008 ；Ward 等，2009)去除 LPS 的方法。Lf已被建议作为抗微生物剂用于乳制品和肉类工业(Payne等，1990 ；Naidu, 2001)。天然Lf是用铁部分饱和的(Reiter，1985)。一些研究人员(Bishop等，1976 ； Korhonen, 1977 ；Payne等，1990)报道Lf的抗微生物活性依赖于它的铁饱和度。Batish等 (1988)发现脱辅基-Lf(apo-Lf)的抗菌活性高于天然Lf，而且其他人证实了这一点。Lf是一种在N端部分(N-terminus lobe)具有一个铁结合位点且在C端部分具有另一个铁结合位点的铁-结合糖蛋白。在碳酸根离子的协同下，一分子的Lf具有可逆结合两个高自旋狗3+离子的能力。开域(domain opening)几乎可以肯定是从Lf释放铁的必要特征。三个因素引发此过程i)与特定的Lf受体相互作用，ii)结合的狗3+还原为狗2+，及iii)降低的pH。 使用水溶性铁螯合剂和低PH可以从Lf释放铁(Groves，1960 ；Masson和Heremans，1968 ； Law 禾口 Reiter, 1977 ；Mazurier 禾口 Spik, 1980 ；Chung 禾口 Raymond, 1993 ；Feng,van der Does 和BantjeS，199;3)。然而，完全去除铁是困难的，而且脱辅基-Lf的铁饱和度通常> 10% (Batish 等，1988 ；Payne 等，1990 ；Chung 和 Raymond, 1993)。由于 Lf 对铁的高亲和力， Kontoghiorghes (1986)无法在生理pH使用任何多种可溶性铁螯合剂从Lf中完全移动出铁 (Aisen 禾口 Leibman, 1972 ；Chung 禾口 Raymond, 1993 ；Kretchmar Nguyen, Craig 禾口 Raymond, 1993)。一些研究者在pH < 4使用不溶性树脂来螯合铁以制备脱辅基-Lf，但是脱辅基-Lf 仍然具有约15 %的铁饱和度(Payne等，1990 ；Chung和Raymond, 1993)。虽然Feng, van der Does和Bantjes (1995)在柠檬酸和其他缓冲液的存在下，在生理pH用铁-螯合树脂从Lf成功地除去了铁，但其方法复杂、缓慢而且使用的低Lf浓度，这使得将该工艺用于商业用途是不切实际的。Peterson等Q000)显示直到pH3. 5才开始释放铁。此外，由于铁去除过程通常在pH < 3. 5进行，这导致因蛋白质沉淀在溶液中产生浑浊(Chung和Raymond，1993)。有时观察到蛋白构象的修饰(Mazurier和Spik, 1980)。发明目的本发明目的在于提供一种制备低铁Lf的方法，或者至少给公众提供一种有用的选择。
本发明的第一个方面提供一种从液态Lf制备物制备具有改进的抗微生物活性的低铁Lf的方法，该方法包括使用水混溶性溶剂和使得pH低于约4. 5的合适的酸，然后除去铁、水混溶性溶剂和酸。优选地，合适的酸是以下任何一种或多种柠檬酸、酒石酸、草酸、氮川三乙酸或 EDTA加酸，例如HC1、H2SO4,以将其调整到优选的pH。优选地，最合适的酸是柠檬酸。优选地，合适的酸可由柠檬酸盐和一种或多种有机或无机酸形成。优选地，所述有机或无机酸选自HCl、H2SO4、乙酸等。优选地，柠檬酸盐是柠檬酸钠、柠檬酸钾等。优选地，pH在2. 5-约4. 5，更优选约3. 8_约4. 5，最优选约3. 9-约4. 2。优选地，水混溶性溶剂是醇溶剂。优选地，水混溶性溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或类似溶剂。优选地，使用超滤(ultrafiltration，UF)、渗滤(diafiltration，DF)和/ 或类似的常规手段去除铁、水混溶性溶剂和酸。优选地，产生的低铁Lf含有少于Hmg/100g的铁或10%的铁饱和度。本发明的第二个方面提供一种制备低铁Lf的方法，所述低铁Lf优选含有少于 Hmg/100g铁(Hmg/100g iron)或10%的铁饱和度，并具有比常规商业的Lf更高的抗微生物活性，所述方法包括a)将水性Lf制备物与醇溶剂和足够的酸溶液混合，使得溶液pH低至2. 5-4. 5，以从液态Lf制备物中的Lf释放铁；b)通过UF和/或DF去除释放的铁、酸和醇，以达到产物中处理pH >约5. 5和导电率<约2mS ；c)进一步处理步骤b)产生的低铁Lf产物以产生一种液态或干燥的低铁Lf产物。优选地，步骤c)中的低铁Lf产物是冷冻-干燥的或喷雾-干燥的。优选地，酸选自柠檬酸、酒石酸、草酸、氮川三乙酸或EDTA、或柠檬酸盐连同有机或无机酸。优选地，步骤a)中的pH降低至约3. 5_约4. 5，更优选约3. 9_约4. 2。优选地，用酸溶液处理步骤a)中的水性Lf制备物以释放铁，处理时间为约2小时-约3天，更优选约3小时-约M小时，更优选约5小时-约12小时，最优选约6小时-约10小时。优选地，步骤a)中使用的酸溶液的浓度是约5-20%，最优选约10%。优选地，在加入酸之前加入醇溶剂。优选地，醇溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或类似的醇中的任何一种或几种，更优选醇是乙醇。 优选地，以Lf制备物的约0. 2-约2. 5%，更优选约0. 5_约1. 5%，最优选约1 %的量加入醇溶剂。优选地，处理pH为约3. 5-约4. 5。优选地，步骤a)中的温度为约2-约30°C。优选地，步骤b)中的温度为约5-约10°C。优选地，水性Lf制备物中的Lf来自牛、人和其他哺乳动物的初乳、脱脂乳或乳清。优选地，水性Lf制备物中的Lf是通过任意常规方法，如通过层析、离子交换和分子筛，从实验室和商业上可得到的Lf分离的。优选地，水性Lf制备物中的Lf可为未干燥的提取物或溶液，或干燥的粉末。优选地，水性Lf制备物中的Lf的浓度为约0. 01-约35 % wt/vol，优选约5_约 25% wt/vol，最优选约 10-约 20% wt/voL·在第三方面，本发明提供根据本发明第一或第二方面产生的低铁Lf。在第四方面，本发明提供改进包含标准Lf组分的产物的抗微生物性质的方法，所述方法包括用低铁Lf至少部分地替代标准Lf的步骤。优选地，本发明第三或第四方面的低铁Lf含有少于约Hmg/100g铁或约10%的铁饱和度。在第五方面，本发明提供根据本发明第四方面的方法产生的产物。附图简述图1 显示从于不同Lf制备物温育的大肠杆菌(E.coli)或肺炎克雷伯氏菌 (K. Pneumoniae)释放的 LPS。图2 显示本发明中在不同pH的铁释放。图3 涉及此工艺中，在不同PH铁再结合回Lf，这影响最终产物铁饱和度。缩写cfu 集落形成单位DF 渗滤HPLC 高效液相层析Lf:乳铁蛋白LPS 脂多糖NZRM 新西兰参考培养物保藏中心医药部(New Zealand Reference Culture Collection, Medical Section)UF 超滤XRF :X射线荧光发明详述本发明提供一种制备具有改进的抗微生物活性的低铁Lf的方法，并还提供一种通过使用低铁Lf替代标准Lf在所述产物中的使用来改进产物的抗微生物活性的方法。使用本发明(酸+醇)的工艺，可以在温和pH(例如3. 8-4. 5)产生低铁Lf。此外， 只要在优选的工艺过程中能够降低Lf变性率(denaturation)，也可以使用更低的pH(例如 <约3. 5)。由于这样的方法相对简单和划算，为使用者提供了益处。6令人吃惊和重要的是，发明人发现通过本方法产生的低铁Lf与标准的商业上可获得的Lf相比，具有显著改进的抗微生物活性。结果，通过用低铁Lf至少部分地替代包含 Lf的产物中的标准Lf，能够改进所述产物的抗微生物活性。可以使用水混溶性溶剂，如醇溶剂(例如，甲醇、乙醇或类似的醇)，与合适的酸组合，例如柠檬酸、酒石酸、草酸、氮川三乙酸、或EDTA，或柠檬酸盐连同有机或无机酸，以除去铁，来从实验室的或商业的Lf提取物或制备物制备低铁Lf。pH是相对温和的(例如，低于约4. 5，优选约2. 5-约4. 5)。然后是使用常规的方法，例如UF和/或DF，去除铁和添加的溶剂和酸，并同样使用常规方法，例如冷冻_、喷雾-或以其他方式干燥产物来回收产物。使用上述方法所产生的低铁Lf与标准的Lf相比显示出增加的抗微生物活性，并且具有低于约Hmg/100g铁或约10%铁饱和度的铁含量。更优选铁饱和度低于约9%。本发明使用的Lf制备物含有来自牛、人或其他哺乳动物的初乳、脱脂乳和乳清的 Lf0使用任意常规方法，如通过层析、离子交换和分子筛，以实验室和商业规模从上述来源中分离Lf。本发明利用以下事实Lf能够在暴露于温和pH (低于约4. 5)及合适的螯合剂(柠檬酸是优选的试剂)和合适的水混溶性溶剂(醇溶剂，如乙醇是最优选的)时，以完全可逆的方式释放结合的铁。此外，当采用低PH 2. 5-3. 8时，加入合适的水混溶性溶剂(例如醇) 可防止Lf变性。优选地，使用单独的食品级酸或食品级酸的混合物，还使用食品级的水混溶性溶剂(如醇试剂)处理Lf。采用食品级别主要是由于其相对高的纯度，从而降低对最终产物的任何影响。然后是通过UF和DF除去由Lf释放出的铁，以及工艺助剂(酸和水混溶性溶剂)；再冷冻_、喷雾或以其他方式干燥产物，以产生最终的低铁Lf产物。铁释放用于治疗/处理的Lf制备物是通过在水中溶解Lf粉末而制备的。或者，可以直接使用新制备的水性提取物。已知通过在pH < 3. 5混合柠檬酸溶液和Lf溶液可以从Lf溶液中释放铁(例如 Peterson等，2000)，虽然许多专利和文献报道使用pH为2。在此铁释放条件下，尤其是低 pH，由于蛋白的凝集或变性可形成浑浊的溶液(Mazurier和Spik，1980 ；Chung和Raymond， 1993)。此外，在商业产物中，高Lf浓度(10-20%)和低温对于铁释放工艺通常是优选的， 因为较低温度能防止可能的细菌生长，而较高浓度可为更有效的。此外，发明人发现当使用较低温度(2-12°C )和较低pH < 3. 5时，可形成Lf凝胶和沉淀。相反地，发明人现在发现，加入适量的水混溶性溶剂(优选醇溶剂)有助于铁在中等pH(<4.5)的释放，也有助于防止沉淀或胶凝。结果，可实现低于Hmg/100g铁或10% 铁饱和度的铁浓度。令人吃惊的是，终产物具有显著改进的抗微生物活性，这不能仅通过去除铁来解释。Lf具有抗微生物活性是由于它具有结合对于某些细菌生长必需的铁的能力。一些研究者(Bishop等，1976 ；Korhonen, 1977 ；Payne等，1990)报道Lf的抗微生物活性依赖于它的铁饱和度。Batish等(1988)发现低铁Lf的抗菌活性比Lf高，这已经被其他人证实。 Lf还通过结合于细菌细胞膜上的脂多糖(LPQ以破坏细胞壁而具有杀菌活性(Ellison等， 1988 ； 1990 和 1991 ；Yamauchi，1993 等)。已经发现(参考下表2、3和4，尤其是表4)，低铁Lf和标准Lf均可有效地杀死多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。但是本发明的低铁Lf在来自其原始Lf形式的抗微生物活性上，改进超出了预期。不期望受限于任何特定的假说，发明人假设增加的抗微生物活性可能部分地归因于Lf破坏了外膜，而不仅仅是它的铁结合活性。先前的研究显示人和牛的Lf均导致结构性LPS的释放和提高对细菌杀伤 (Ellison 等，1988 ； 1990 和 1991 ；Yamauchi 等，1993)。Ellison 等(1991)报道人 Lf 具有直接与膜相互作用的能力，并结合于LPS分子。后来，Yamauchi等(1993)发现牛Lf也具有该特性。他们还指出牛Lf改变了革兰氏阴性细菌的外膜结构，从而释放LPS并杀死细菌。为检验(review) LPS相关假说，发明人测定了暴露于低铁Lf和标准Lf的细菌的 LPS释放水平(参考图1)。Lf诱导的细菌LPS释放与Lf诱导的细菌杀伤之间的正相关，表明Lf从细菌释放LPS的能力是改进的抗微生物活性背后的关键因素，而不是铁多价螯合。 得到观察支持的是，不同铁饱和度(5. 1和8. 7% )和不同铁饱和还原度(7. 9和3. 5% )的两种低铁Lf的杀伤能力相似，但是比它们的原始形式强得多(参考表4)。虽然确切的机制依然不清楚，但本发明的低铁Lf显示的改进的抗微生物活性可能是由于上述机制或其它机制，如还未确定的工艺。为从Lf释放铁，将生理可接受的铁螯合酸或者所述酸(合适的酸)的组合以良好的混合加入含有水性Lf制备物的罐，优选在合适的温度(通常约8至约25°C)以给出所需的PH。使用在465nm波长的吸光度变化监测铁的释放。铁释放与水溶的铁螯合剂和pH密切相关。在优选的反应混合物中，Lf溶液与生理可接受的酸或所述酸(如酸试剂和螯合剂)的组合，如柠檬酸、酒石酸、草酸、或乙二胺四乙酸(EDTA)，优选食品级，或者这些酸的盐(例如柠檬酸钠或柠檬酸钾)与其他生理可接受的无机或有机酸(例如HCl、H2SO4、乙酸等)的组合。最优选的选项是仅使用柠檬酸。加入的酸的浓度应该从约0. 1至55%，优选5-20%，最优选约10%。如果酸浓度过高，可能会在混合完成前使Lf变性。另一方面，如果酸浓度过低，将需要不方便的大体积酸溶液来稀释Lf。优选地，应将酸以良好的混合缓慢加入，以避免可使Lf变性的局部高浓度。释放的铁的量随低于7的pH的降低而增加。大多数释放的铁来自约pH < 4. 5。 此外，在约PH3. 8-4. 5，铁释放是相对缓慢的，而在pH < 3. 5，铁释放快得多。在两种情况下， 在较高PH将使用较少的酸及较长的时间；而较低pH，需要更多的酸但运行时间短。然而，在约温和pH3. 8-4. 5制成的低铁Lf具有比其较低pH对应物高得多的抗微生物活性。因此， 优选的PH低至约2. 5-约4. 5，优选约3. 8-约4. 5，最优选约3. 9-约4. 2的范围。将包含乙醇和柠檬酸的低色Lf溶液在纯水中稀释1至5倍，并调节pH值。在室温监测各种溶液在465nm的吸光度。典型结果示于图2。这显示铁释放如何受到不同pH水平的影响。优选的PH是小于约4. 5。加入水混溶性溶剂(优选醇溶剂)以协助防止酸引起的Lf的变性和沉淀，并协助促进铁释放。适量的水混溶性溶剂促进在中等pH(约3. 8-4. 5)的铁去除，并阻止Lf溶液在约 2. 5-3. 5的较低pH发生浑浊或胶凝。使用的水混溶性溶剂(优选乙醇)应优选先于酸加入。优选地，Lf制备物中使用的乙醇量为约0.2-约2.5%，更优选约0.5-约1.5%，最优选约1%。除了 pH和足量的柠檬酸(或其他合适的酸，优选食品级)，铁释放与反应时间密切相关。铁释放随混合时间增加而增加直至其到达平衡。因为在酸添加和反应时间之间存在反向关系，加入量越高(pH越低)，用于实现目标铁释放量的时间越短。然而，酸的加入受PH限制，所以如果将纯Lf产物与足量的柠檬酸混合，接触时间可为约10分钟-约3天以释放铁。在经典处理中，优选约3分钟-约M小时，更优选约30分钟-约12小时，最优选约6-约8小时。除了工艺条件，Lf的品质是重要的。例如，在多数商业化的Lf制备物中杂质水平是约 4-约 10%，变性为 10-25% (denaturation is in the order oflO-25% ) 因此，Lf 的杂质和变性水平将影响最终产物，因此起始Lf的选择是重要的，而且优选使用合适品质的Lf。熟练技术人员能够确定Lf的品质。本发明的方法中作为起始产物的Lf可以通过任意常规方式制备。起始Lf可以来自人、牛或其他哺乳动物的初乳、脱脂乳和乳清，而且可通过任意常规方法，如通过层析、离子交换和分子筛从实验室和商业上可得到的Lf分离。Lf可为液体(溶液)或固体(粉末) 形式。通过将添加剂(水混溶性溶剂、合适的酸)加入合适的水性Lf制备物中形成Lf 和添加剂的混合物。起始混合物的Lf浓度优选不高于约35%，优选约0. 01至约35% wt/ vol，更优选约5%至约25% wt/vol，最优选约10%至约20% wt/voL·在典型方法中，一旦达到铁释放的目标( <约Hmg/100g铁或约10%铁饱和度，更优选< 7mg/100g铁或约5 %铁饱和度)，通过使用UF和/或DF或其他合适技术去除释放的铁和加入的工艺助剂(酸和溶剂)。去除铁和处理助剂如果混合物的pH恢复到接近中性(参考图3)，柠檬酸(或其他合适的酸)和醇 (或其他水混溶性溶剂)从Lf释放的铁易于被再次摄取(take up)。因此在尝试进行Lf 的pH中和进一步处理前，可以使用脱盐方法去除铁，例如UF和/或DF或类似方法。由于Lf能够以完全可逆的方式释放结合的铁，应该(例如)通过UF和/或DF去除铁和化学品以防止在后续处理过程中铁的再结合。一个Lf分子可以非常高的亲和力结合两个!^3+离子。铁-Lf复合物在pH > 3. 5 不存在螯合剂时是稳定的。如上所述铁释放后，在足够低的PH通过UF和DF从Lf溶液去除铁的关键要求是存在柠檬酸(柠檬酸盐)或其他合适的酸，因为它可充当螯合剂和PH控制齐U。如发明人观察的，当PH提高时，释放的铁能够再结合于Lf(参考图3)。因此优选保持低的PH，直到去除了多于90%的释放的铁。Lf溶液的足够低的pH优选为约3. 8-约4. 5， 最优选约3. 9-4. 2。在图3中，用工艺助剂(1%乙醇和pH分别到4. 0,4. 2,4. 3,4. 45，4. 75， 5.0,5. 35和5. 8)处理样品，放置在96微孔板中，并在室温22°C温育。在0、30、60、90、120、 150以及960分钟测量吸光度。这显示在不同pH铁再结合于Lf，这会影响终产物的铁饱和度。高质量的水优选用于DF以避免Lf的污染。最重要地，水的铁含量优选为低的，优选<约0. 2ppm，并最优选<约0. lppm。水还应不含痕量的鞣质和内毒素。通过上述的脱盐方法，如通过UF，去除Lf混合物中!^3+铁和化学品(柠檬酸和乙醇)的程度可导致PH改变，所以应该密切监测(如果超出约4.0到约4. 6的优选pH范围， 可能需要使用酸/碱来修正处理的Lf的pH至优选约4. 2)。在通常的UF过程中，搅拌下加入工艺助剂并使其反应。反应完成后开始UF步骤。 加入水以帮助去除释放的铁及加入的工艺助剂。DF前使用UF有两个优势。第一，与使用 DF相比，使用UF可以加入和去除更大体积的水，这可有助于更快地出去铁和添加剂。第二， 使用UF步骤可以容易地控制pH。可以监测铁和添加剂的去除，当去除多于90%的铁并且获得合适浓度的Lf时，开始DF。因此，为后续的干燥过程获得了合适浓度的Lf。将Lf转化为有价值的、具有改进的生物活性，以及合适的传感性和储存性质的低铁Lf对于商业产物常常是优选的。为了获得这样的材料，使用DF纯化Lf，去除大多数杂质 (主要是加入的工艺助剂)。DF步骤主要是去除加入的酸和水混溶性溶剂而不是铁，渗滤Lf 溶液至PH约5. 0。根据希望获得的终产物种类，通过DF或加入碱pH可高至5. 5-6. 5和导电率anS/cm。如果需要良好的传感性产物，Lf可以渗滤至pH5. 5-6. 5。然而，传导性质不是关键的，可以用食品级的碱，如K0H、Na0H或类似碱，或者几种碱的混合物，优选包括NaOH 将PH调整到pH5. 5-6. 5。碱可以直接加入溶液但是优选溶解至0. 1_50%，优选1_10%，最优选至约2.5%。优选地，应为DF使用高品质水以避免Lf的污染。水中铁含量应该低，优选<0. 2ppm并最优选< 0. Ippm0水还应该不含痕量的鞣质和内毒素，因为Lf对这些有高亲和力。一旦反应处理，可将低铁Lf冷冻或喷雾干燥并包装。本发明的方法能够在温和pH(3. 8-4. 5)生产低铁Lf。此外，可以使用更低的pH
<3. 5，因为此工艺还能够有效降低/防止Lf变性。除了上述，令人吃惊和重要的是，最终的低铁Lf产物具有显著改进的抗微生物活性。因此本发明延伸到显示改进的抗微生物性质的低铁Lf。低铁Lf可被用于许多产物，例如婴儿配方、营养配制物、免疫增强产物、口腔护理产物和抗痤疮产物。在这些用途中，改进的抗微生物活性帮助降低有害的病原体因此改进产物的品质和/或有效性。尤其是，因为低铁Lf强烈结合于内毒素-LPS，产物还可以有助于使用者的免疫系统。因此本发明延伸到通过用低铁Lf至少部分地替代标准Lf在这些产物中的使用，改进并入(或者能够并入)Lf组分的产物的抗微生物性质。
实施例实施例1 用多种试剂处理乳铁蛋白在pH4. 0和25°C使用多种试剂处理含有1 %乙醇的6%水性Lf溶液的等分试样， 监测465nm吸光度的变化。通常结果示于表1。实施例2 以实验室规模制备低铁Lf由商业Lf重组成20、15、10和5%的溶液。IOOmL上述Lf样品中加入5mL 20%乙醇后，将Lf样品的pH调整到4.0。样品在20°C放置16小时以释放狗3+。通过使用分光光度计测量在465nm处吸光度来监测铁释放。16小时反应后，以1 20的比例用纯水或自来水渗析样品。每天换3次水渗析2天后，将样品冷冻干燥。生产的产物或者是白色，当使用纯水制备(HPLC测定为3. 89%铁饱和度，用X射线荧光(XRF)测定为4. 03% )；或者是浅乳白色(light cream)或苍白米色(pale beige)，当使用自来水制备(HPLC测定为3. 97%铁饱和度，用XRF测定为4. 08% )。所有得到的产物均与常规Lf (橙红粉色(salmon pink)) 易于区分。铁再结合结果表明低铁Lf没有损失任何铁结合能力。抗微生物结果显示用纯水或自来水渗析的Lf具有相似的抗微生物活性，但比常规的Lf强的多(参考表5)。实施例3 在商业工厂规樽制备低铁Lf将50L 20%乙醇加入1000L 15% Lf中后，将Lf溶液的pH调整至4. 1。在20°C 缓慢搅拌溶液以释放狗3+直到实现目标狗3+释放量(16小时)，然后通过UF和DF方法除去释放的狗3+和加入的工艺助剂。所得的产物呈浅乳白色或苍白米色，5.1%的饱和度(HPLC 测定)，而且与常规Lf易于区分。铁再结合结果表明低铁乳铁蛋白没有损失任何其铁结合能力。抗微生物结果显示其具有改进的抗微生物活性(参见表2和3)。铁饱和度检测通过将过量的新制的FeC13溶液加入70nM碳酸氢钠溶液(pH 7)中测试乳铁蛋白 (2%)的溶液中来测定乳铁蛋白制备物结合铁的能力。使用阳离子交换HPLC测定所得Lf 中的铁含量。使用盐梯度从柱上洗脱Lf，同时在280和465nm测定吸光度。当测定Lf浓度时考虑铁对^Onm吸光度的影响。使用XRF确认HPLC测定法。抗微生物活性使用选择的生物体的悬浮液测试下述多种乳铁蛋白溶液的抗微生物活性。a)分离自胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板的大肠杆菌(E. coli) (NZRM-916)、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) (NZRM-7441)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus) (NZRM-5)或金黄色葡萄球菌(S. aureus) (NZRM-87)的单菌落接种于IOmL胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中37°C温育过夜。b)将所得105-106Cfu/mL培养物的等分试样(100 μ L)加入ImL部分的Lf测试溶液，其包含，在第一实验中0. 4%和0. 8 % Lf,在第二实验中(仅大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌)0. 5%、0. 25%和0. 15%的Lf。混合物在37°C温育。C)温育混合物的样品(ImL)在2分钟，30分钟，4小时和M小时取出并放入含 9mL无菌水的管中。根据需要使用无菌水进行进一步十倍(1加入9mL)稀释以使细胞数在 104-105cfu/mL 的范围。d)将ImL稀释样品一式两份(in duplicate)转移于培养皿，与融化琼脂混合，并温育M-48小时。e)然后计数菌落。结果示于表1、2、3、4和5。低铁Lf反应比对照Lf更迅速且在更低浓度作用。LPS 释放Lf抗微生物活性主要涉及以下两种公知的机制一种是由对铁的高亲和力导致的铁-剥夺活性；另一种是它结合于细菌细胞膜以从细菌膜释放LPS，使膜更通透以杀死细菌(尤其是革兰氏阴性菌)的能力。Lf结合于细菌并从膜释放LPS的能力看起来与其直接的杀菌活性相关。本发明的低铁Lf比标准Lf具有大大改进的抗微生物活性，这不能用铁含量的降低来解释(这样的低铁Lf形成了本发明的一个创造性方面)，所以重要的是确定大大改进的抗微生物活性是否是由于结合于细胞膜并释放LPS。由于暴露于Lf导致的LPS从选择的生物体的释放测定如下
a)将从胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板分离的大肠杆菌(NZRM-916)或肺炎克雷伯氏菌(NZRM-7441)的几个菌落接种入ISOmL胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中，培养液在37°C 温育过夜。b)通过将培养物在50mL离心管中以IOOOg离心10分钟收获细胞。获得的沉淀分散于纯水中，并再次离心。c)将洗涤后的沉淀与40mL 0.8% Lf溶液混合并在37°C温育。d)0和30分钟时取样品，并在50mL离心管中以IOOOg离心10分钟。所得的澄清上清与3倍体积的99%乙醇混合。通过在IOOOg离心10分钟回收所得沉淀。e)用IOmL纯水溶解沉淀并再次离心，将上清以1 100比例对纯水进行两天渗析，每日换水两次。f)以硫酸苯酚测定法对渗析样品进行分析(Dubois等，1956)。使用葡萄糖作为标准物对LPS进行定量。时间0样品作为空白对照。结果示于图1。如可以清楚所见的，低铁Lf的抗微生物活性显著地、令人吃惊地高于标准Lf。这一发现得到了其它表(并参考上述)中所示结果的支持，即，低铁Lf比对照 Lf更迅速并在更低浓度下作用。表使用多种酸处理醇乳铁蛋白溶液时在465nm的吸光度变化。


本发明涉及用于产生具有改进的抗微生物活性的低铁Lf的方法，并涉及一种具有改进的抗微生物活性的低铁Lf。