乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品的制作方法[0002]败血症是指致病菌或条件致病菌侵入血循环，并在血中生长繁殖，产生毒素而发生的急性全身性感染。40%左右的革兰阴性菌引起的败血症可以发生感染性休克。感染性休克，亦称脓毒性休克，是指由微生物及其毒素等产物所引起的脓毒病综合征伴休克，其主要原因是由革兰氏阴性菌释放的极低浓度的脂多糖(LPS)能非常有效的刺激巨噬细胞释放炎性细胞因子、花生四烯酸的代谢产物及其他的炎性介质，LPS侵入血循环，激活宿主的各种细胞和体液系统，产生的细胞因子和内源性介质，作用于机体各种器官、系统，影响其灌注，导致组织细胞缺血缺氧、代谢紊乱、功能障碍，甚至造成罹患败血症的病人多器官衰竭。[0003]目前对于这类感染性休克类型败血症患者的治疗主要是选用第3代头孢菌素与氨基糖糖甙类联合应用，染中毒症状严重者可在足量应用有效抗生素的同时给予肾上腺皮质激素短程(3~5天)治疗。由于这类感染致病菌株之间药敏差异大，对常用的抗菌药耐药现象严重，病死率高，预后差。因此，能够有效的抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎性细胞因子，并可联合抗生素用于革兰阴性菌引起的败血症治疗的抗体药物的研究成为了目前医学研究的热点。[0004]LPS的免疫识别受体主要包括LBP和CD14，TolI样家族的成员TLR2和TLR4以及整合素⑶11/⑶18。近年来，研究发现分泌型乳铁蛋白能够与LPS结合。乳铁蛋白(Lactoferrin, LTF)是一种分子量为80KD的铁结合性糖蛋白，一般情况下由中性粒细胞分泌，乳铁蛋白根据来源可分为分泌型乳铁蛋白(可溶性乳铁蛋白)和膜结合型乳铁蛋白(membrane-bound lactoferrin, mbLTF)。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中，如泪液、血液、唾液、精液等。乳铁蛋白含量最高的是乳汁，由乳腺细胞合成，成熟母乳和初乳的浓度中的乳铁蛋白浓度为I~7g/L。乳铁蛋白也是嗜中性粒细胞次颗粒的主要成分，为血液中乳铁蛋白的主要来源。该蛋白除了参与铁的转运，还具有抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抑制肿瘤细胞生长、消除炎症及参与免疫调节等多种生物学功能，在哺乳动物的固有免疫应答过程中起着重要作用。[0005]尽管分泌型乳铁蛋白能够与LPS结合，但它们结合后不能直接诱导细胞活化，因此分泌型乳铁蛋白不能被看做严格意义上的模式识别受体(PRR)，它可能作为PRRs的竞争者，或者某些情况下作为载体分子发挥作用。在对乳铁蛋白在小鼠巨噬细胞表达的基础上研究发现，膜结合型乳铁蛋白是一种新型的LPS受体，也参与了 LPS活化巨噬细胞的过程。虽然目前的研究 对分泌型乳铁蛋白的诸多功能已经有了足够多的认识，但对mbLTF的功能却知之甚少，仅有少数报道探讨了膜结合型乳铁蛋白在细胞上的表达。Cho JK等人通过亲和层析等方法从人乳脂肪球膜中纯化出了膜结合型乳铁蛋白，发现它的相对分子量，N端氨基酸序列与分泌性乳铁蛋白一致，但并未对膜结合型乳铁蛋白的功能进行研究。Butler Tff等人通过流式细胞术发现其在慢性B型淋巴细胞性白血病和扁桃腺来源的B细胞表面高表达，且在细胞不同的成熟阶段表达水平会发生改变。Lucy V.Deriy等人用针对人乳铁蛋白的单克隆抗体2B8及AHN-9对人外周血来源的中性粒细胞进行了表面染色，发现乳铁蛋白在人静息态中性粒细胞表面表达。但单克隆抗体2B8和AHN-9并不能识别人外周血单个核细胞(peripHeral blood mononuclear cell,PBMC)来源的单核细胞,不能作为探针检测单核巨噬细胞表面的mbLTF。因此，提供一种能够与mbLTF特异结合的单克隆抗体具有重要的现实意义。
[0006]有鉴于此，本发明提供了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品。该单克隆抗体M-860除了能很好地识别可溶性乳铁蛋白之外，可用于特异性区分变性与非变性乳铁蛋白，还可作为探 针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测，可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗，可用于辅助诊断类风湿关节炎。[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]本发明提供了一种乳铁蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂
交瘤产生。
[0009]蛋白质抗原的表位根据结构特点可分为构象表位和线性表位这两种类型。其中构象表位由抗原氨基酸序列上不连续排列、空间上形成特定构象的短肽、多糖残基或核苷酸所构成。本发明提供的单克隆抗体的纯度在95%以上，与乳铁蛋白具有较高的亲和力，且单克隆抗体M-860识别的是可溶性乳铁蛋白或膜结合型乳铁蛋白的构象表位。
[0010]研究发现，单克隆抗体M-860能够很好地识别人单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞表面的LTF，可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测，从而可进一步确定膜结合型乳铁蛋白的表达谱，为研究特定细胞上膜结合型乳铁蛋白的功能提供依据。另外，单克隆抗体M-860可作为工具研究膜结合型乳铁蛋白作为一种新型模式识别受体在LPS、β -葡聚糖活化免疫细胞如巨噬细胞中的作用。
[0011]研究发现，LPS能够竞争抑制单克隆抗体Μ-860与LTF的结合，表明Μ-860和LTF的结合位点，与LPS和LTF的结合位点相同；且单克隆抗体Μ-860能够在体外、体内均可抑制LPS活化巨噬细胞释放TNF- α，并可有效延长LPS诱导的败血症小鼠的寿命，且这种效应具有剂量依赖性，可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗。
[0012]类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，其病理特点为慢性进行性关节滑膜和关节软骨损伤，往往累及终生，形成长期病痛。类风湿关节炎患者体内存在多种抗自身抗体及免疫复合物，如类风湿因子、抗核抗体、抗角蛋白抗体、抗磷脂抗体及抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等。而抗乳铁蛋白抗体属于ANCA的一种，在部分RA患者血清中呈高表达。由于RA病人体内乳铁蛋白与其抗体均在血清中高表达，乳铁蛋白与其抗体结合后产生的LTF免疫复合物的含量明显升高。且该LTF免疫复合物能够刺激人单核细胞活化，释放TNF-α等炎性因子，在RA的疾病发展过程中发挥重要的作用，因此血清中LTF免疫复合物的含量可以成为一个良好的辅助诊断指标。研究发现，本发明提供的单克隆抗体Μ-860能够有效地结合血清中的LTF免疫复合物，结果表明该单克隆抗体用于类风湿关节炎病人血清中LTF免疫复合物的检测具有很好地特异性和敏感性，从而可用于辅助诊断类风湿关节炎。
[0013]在本发明中，该单克隆抗体为IgGl型。
[0014]在本发明中，该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO: 5所示，轻链序列如SEQ IDNO:6所示。
[0015]在本发明中，该单克隆抗体的重链⑶Rl序列如SEQ ID NO:7所示，重链⑶R2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO:10所示，轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0016]本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测可溶性乳铁蛋白产品中的应用；单克隆抗体由保藏号为 CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO:10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如 SEQ ID NO:11 所示。
[0017]本发明还提供了该单克隆抗体在区分检测变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品中的应用；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ IDNO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ IDNO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO:10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0018]本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测膜结合型乳铁蛋白产品中的应用；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0019]本发明还提供了该单克隆抗体在制备治疗败血症药物中的应用；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链⑶Rl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQID NO:11 所示。
[0020]本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测乳铁蛋白免疫复合物含量试剂盒中的应用；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO: 5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ IDNO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO:10所示，轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0021]本发明还提供了该单克隆抗体在制备诊断类风湿性关节炎试剂盒中的应用；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0022]本发明还提供了一种检测可溶性乳铁蛋白产品，包括本发明提供的单克隆抗体；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO: 5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0023]本发明还提供了一种区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品，包括本发明提供的单克隆抗体；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO:10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0024]本发明还提供了一种检测膜结合型乳铁蛋白试剂盒，包括本发明提供的单克隆抗体；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO: 9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0025]本发明还提供了一种治疗败血症的药物，包括本发明提供的单克隆抗体；；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0026]在本发明提供的一些实施例中，治疗败血症的药物还包括抗生素。
[0027]本发明还提供了一种检测乳铁蛋白免疫复合物含量的产品，包括本发明提供的单克隆抗体；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链⑶Rl序列如SEQ ID NO:7所示，重链⑶R2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0028]在本发明提供的一些实施例中，该检测乳铁蛋白免疫复合物含量的产品可以为检测乳铁蛋白免疫复合物含量的试剂或试剂盒。
[0029]本发明还提供了一种诊断类风湿性关节炎试剂盒，包括本发明提供的单克隆抗体；单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生；该单克隆抗体为IgGl型；该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示，轻链序列如SEQ ID NO:6所示；该单克隆抗体的重链CDRl序列如SEQ ID NO:7所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO: 9所示，轻链CDRl序列如SEQ ID NO: 10所示，轻链CDR2序列为GIS，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
[0030]本发明提供了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及乳铁蛋白单克隆抗体的产品。该乳铁蛋白的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生。荧光标记试验的结果显示，单克隆抗体M-860能够很好地识别人单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞表面的LTF，表明单克隆抗体M-860可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测；LPS竞争抑制试验的结果显示，LPS能够竞争抑制M-860与LTF的结合，结果说明M-860和LTF的结合位点，与LPS和LTF的结合位点相同；单克隆抗体M-860抑制LPS活化巨噬细胞试验的结果显示，单克隆抗体M-860能够在体内或内外明显抑制LPS诱导产生的TNF- α含量，并有效延长LPS诱导的败血症小鼠的寿命，且这种效应具有剂量依赖性，表明单克隆抗体Μ-860可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗；通过检测RA病人血清中LTF免疫复合物的含量，结果显示单克隆抗体Μ-860能够有效地结合血清中的LTF免疫复合物，表明该单克隆抗体用于类风湿关节炎病人血清中LTF免疫复合物的检测具有很好地特异性和敏感性，从而可用于辅助诊断类风湿关节炎。
[0031]生物保藏说明
[0032]分类命名:杂交瘤细胞株Μ-860，于2014年03月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址为湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C201448o



[0033]图1示实施例1中ELISA鉴定乳铁蛋白免疫效果；
[0034]图2示实施例2中SDS-PAGE鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860的纯度；
[0035]图3示实施例2中ELISA鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860的敏感性；
[0036]图4示实施例3中ELISA鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860亚型；其中，图4(a)示将IgGl作为二抗的吸光度，图4(b)示将IgG2a作为二抗的吸光度，图4(c)示将IgG2b作为二抗的吸光度，图4(d)示将IgG3作为二抗的吸光度；
[0037]图5示实施例5中ELISA鉴定单克隆抗体M-860识别乳铁蛋白的构象表位；其中，图5(a)示将未经处理的LTF作为包被抗原的吸光度，图5(b)示将加热处理后的LTF作为包被抗原的吸光度，图5(c)示将β -巯基乙醇处理后的LTF作为包被抗原的吸光度；
[0038]图6示实施例6中流式细胞术分析单克隆抗体Μ-860对人及小鼠单核巨噬细胞表面乳铁蛋白的识别；其中，图6 (a)示M-860对人外周血单核细胞表面染色结果，图6(b)示M-860对小鼠腹腔巨噬细胞表面染色结果；
[0039]图7示实施例7中LPS竞争抑制单克隆抗体M-860与乳铁蛋白的结合； [0040]图8示实施例8中单克隆抗体M-860体外抑制LPS活化巨噬细胞释放细胞因子TNF-α ;其中，图8(a)示同型对照抗体兔IgG(RbIgG)与多抗L3262对TNF-α的影响；图8 (b)示同型对照抗体鼠IgGl (mlgGl)与M-860对TNF- α的影响；
[0041]图9示实施例8中单克隆抗体Μ-860体内抑制LPS诱导释放细胞因子TNF- α ；[0042]图10示实施例8中小鼠的生存曲线；其中，图10(a)示空白对照组小鼠的生存曲线，图10(b)示腹腔注射生理盐水的小鼠的生存曲线，图10(c)示腹腔注射mlgG(50 μ g/只)的小鼠的生存曲线，图10(d)示腹腔注射M-860(50yg/只)的小鼠的生存曲线，图10 (e)示腹腔注射mIgG(200 μ g/只)的小鼠的生存曲线，图10 (f)示腹腔注射M-860 (200 μ g/只)的小鼠的生存曲线；
[0043]图11示实施例9中LTF免疫复合物在健康人血清和类风湿关节炎患者血清中的表达；
[0044]图12示实施例9中单克隆抗体M-860检测乳铁蛋白免疫复合物的含量。

[0045]本发明公开了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0046]说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下:
[0047]