专利名称：使用经丙烯酸水溶液洗涤的微生物催化剂生产丙烯酰胺的方法 工业上传统的生产丙烯酰胺的方法是通过用还原状态的铜作为催化剂对与其相应的丙烯腈进行水合。最近，已经开发了一种使用微生物催化剂而不是用铜催化剂的方法，且该方法的一部分已经得到实际应用。使用微生物催化剂等的生物催化方法有望成为工业生产方法，因为这种方法的反应条件温和且几乎没有副产物，因此可以为该方法设计非常简单的工艺。因此，到目前为止已经发现了很多具有通过水合可催化(转化)丙烯腈生成丙烯酰胺的酶(酶名称腈水合酶)的微生物。这些微生物的例子包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)、芽孢不动菌属(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)[以上微生物参见日本专利公告(Kokoku)No.62-21519 B(1987)]，棒杆菌属(Corynebacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)[以上微生物参见日本专利公告(Kokoku)No.56-17918B(1981)]，假单孢菌属(Pseudomonas)[参见日本专利公告(Kokoku)No.59-37951 B(1984)]，红球菌属(Rhodococcus)和微杆菌属(Microbacterium)[以上微生物参见日本专利公告(Kokoku)No.4-4873 B(1992)]，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)[参见日本专利公告(Kokoku)No.6-55148 B(1994)]和红球菌属(Rhodococcus)[参见日本专利公告(Kokoku)No.7-40948 B(1995)]的微生物菌株。使用以上微生物作为微生物催化剂生产丙烯酰胺的方法的例子包括在日本专利公开(Kokai)Nos.11-123098 A(1999)和7-265091 A(1995)以及日本专利公告(Kokoku)No.56-38118 B(1981)中的方法。反应方法的一个例子是日本专利公开(Kokai)No.11-89575 A(1999)中的方法。此外，已经做了很多研究以提高反应中酶的活力或抑制酶活力的下降(失活)。这种研究的例子包括在低温，低于冰点15℃下进行反应的方法[参见日本专利公告(Kokoku)No.56-38118 B(1981)]、从多个加料口依次加入低浓度的底物的方法[参见日本专利公告(Kokoku)No.57-1234B(1982)]、用有机溶剂处理微生物或其处理产物的方法[参见日本专利公开(Kokai)No.5-308980 A(1993)]、在高不饱和脂肪酸存在的条件下进行反应的方法[参见日本专利公开(Kokai)No.7-265090 A(1995)]和用戊二醛等将微生物细胞进行交联处理的方法[参见日本专利公开(Kokai)Nos.7-265091 A(1995)和8-154691 A(1996)]。同时，通常已知的洗涤微生物催化剂的方法包括用生理盐水、缓冲液(如磷酸盐或Tris盐酸盐的水溶液)洗涤以抑制酶活力的下降。然而，把洗涤组分对丙烯酰胺聚合物的物理性质和单体的贮存稳定性的影响考虑在内的洗涤微生物催化剂的方法还未见报道。如上所述，利用微生物催化剂生产丙烯酰胺的方法有望成为工业生产方法，因为该方法采用温和的反应条件且几乎不产生副产物，因此无需纯化并且可以设计非常简单的工艺。尽管以上生产方法在酶反应的条件下不会产生副产物，但是它们具有一个缺陷，即当对所要使用的微生物催化剂进行洗涤时，由洗涤产生的杂质的污染可影响丙烯酰胺聚合物的物理性质和丙烯酰胺单体的贮存稳定性。为了解决这个问题，可进行纯化(如结晶、离子交换)或蒸馏。然而，由于使用了这些纯化方法，使用微生物催化剂的生产方法的一个突出的特点，即反应时几乎不产生副产物，却不能被利用。此外，考虑到能源和环境问题，使用这些方法也是不利的。发明概述经过为解决上述问题而进行的广泛研究，我们已完成了本发明，发现在使用含有得自微生物的酶-腈水合酶的微生物催化剂从丙烯腈生产丙烯酰胺的方法中，通过使用经丙烯酸水溶液洗涤的微生物催化剂，可以制备丙烯酰胺，在所制得的丙烯酰胺中，丙烯酰胺聚合物的物理性质和丙烯酰胺单体的贮存稳定性得到了改善。
也就是说，本发明是使用可将丙烯腈转化成丙烯酰胺的微生物催化剂生产丙烯酰胺的方法，其使用经丙烯酸水溶液洗涤的微生物催化剂。
可用于本发明的微生物催化剂可以是任何催化剂，条件是其是从具有将丙烯腈转化成丙烯酰胺的催化活性(腈水合酶活性)的微生物制备而得。优选的这种微生物类别包括那些属于芽孢杆菌属、芽孢不动菌属、微球菌属、短杆菌属、棒杆菌属、诺卡氏菌属、假单孢菌属、微杆菌属、红球菌属、无色杆菌属和假诺卡氏菌属的微生物。可以使用这些微生物中的一种或使用这些微生物的组合。
此外，在此可使用的转化株是通过获取来自以上微生物的腈水合酶基因、然后直接将所述基因或人工改良的基因导入自由选择的宿主中而制备。
优选的以上转化株的例子包括已被转化而具有无色杆菌属腈水合酶的大肠杆菌MT10770(FERM P-14756)(日本专利公开(Kokai)No.8-266277 A(1996))、已被转化而具有假诺卡氏菌属腈水合酶的大肠杆菌MT10822(FERM BP-5785)(日本专利公开(Kokai)No.9-275978 A(1997))或已被转化而具有玫瑰色红球菌属腈水合酶的微生物(日本专利公开(Kokai)No.4-211379 A(1992))。
以上微生物可以通过任何适合于给定微生物菌种的方法培养。
在本发明中，从微生物制备的微生物催化剂指的是通过培养微生物而得到的培养液、通过收集过程等得到的细胞、通过超声等而被破裂的细胞，或者是那些在细胞破裂后所制备的包括粗酶、部分纯化的酶或纯化酶的物质。必要时可将这些微生物催化剂固定在载体如聚丙烯酰胺凝胶、藻酸盐、角叉藻聚糖或离子交换树脂上。可以根据酶的稳定性、生产规模等适当地选择使用微生物催化剂的方式。
本发明中的术语“洗涤”指的是洗涤经培养的微生物细胞和/或反应中将要使用的微生物催化剂。因此，经培养的微生物细胞和反应中将要使用的微生物催化剂都可以用丙烯酸洗涤，或者只有反应中将要使用的微生物催化剂可以用丙烯酸洗涤。例如，反应中将要使用的微生物催化剂可用水或缓冲液等洗涤一次，然后在反应前用丙烯酸洗涤。微生物催化剂可在反应开始之前的即刻用丙烯酸洗涤。
此外，可使用任何洗涤方法。在此可阐明的这种方法的例子包括反复洗涤并离心的方法，以及用中空纤维膜洗涤的方法。此外，固定化的微生物催化剂可以通过在洗涤过程中反复搅拌和沉淀固定的催化剂并除去上清液进行洗涤。
考虑到洗涤效率、酶稳定性等因素，可适当地设定任何洗涤方法和任何洗涤次数。
将被用于洗涤的丙烯酸的浓度优选为其在丙烯酸水溶液中的浓度以质量计为0.01％至10％，更优选地，以质量计为0.05％至1％，最优选以质量计为0.1％。
当丙烯酸的浓度以质量计为0.01％或更少时，将增加洗涤时间和洗涤次数，从而使该步骤复杂化。此外，洗涤的次数增加在洗涤过程中可引起细胞破裂、已固定细胞发生崩溃等。以质量计10％或更多的浓度是不利的，因为它可引起酶活力的下降并且在经济上也是不利的。
用氢氧化钠、氨水等可调节丙烯酸水溶液的pH值。优选将在此使用的溶液的pH值调节到5至11，更优选地6至10，最优选地为7。
如上所述制备的微生物催化剂在悬浮或分散于丙烯酸水溶液的状态下或者处于易于固-液分离的状态下时，可用作微生物催化剂。
本发明的最佳实施方式以下实施例将对本发明进行更为具体的描述，但并不意味着限制本发明的范围。
实施例1(1)制备经培养并洗涤的微生物细胞的方法在30L发酵罐(Takasugi Seisakusho)中、30℃下，将具有腈水合酶活性的玫瑰色红球菌J-1(FERM BP-1478)(日本专利公告(Kokoku)No.6-55148 B(1994))置于含有浓度为以质量计2％的葡萄糖、以质量计1％的尿素、以质量计0.5％的蛋白胨、以质量计0.3％的酵母提取物和以质量计0.05％的氯化钴的培养基(pH7.0)中，在有氧条件下培养60小时。
将20L上述培养液通过一个交叉流动型中空纤维膜组件循环过滤。培养的细胞是通过依次将体积和滤液体积相当的、浓度以质量计为0.7％的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)加到培养液中进行洗涤，从而得到了经洗涤的微生物细胞。
(2) 制备固定微生物的载体向500g(1)中所得的经洗涤的细胞的悬浮液(当转化成干细胞重量时浓度以质量计为20％)中加入500g含有浓度以质量计分别为20％、2％和2％的丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺和2-二甲氨丙基甲基丙烯酰胺的单体混合物溶液，以使其充分悬浮。向悬浮液中加入浓度以质量计为5％(2g)的过硫酸铵和浓度以质量计为50％(2g)的N，N，N，N-四甲基乙二胺以进行聚合和胶凝。将产物切成约1-mm的立方体，从而得到固定微生物的载体。
对通过上述方法得到的固定微生物的载体进行20次循环处理，每个循环由下面步骤组成(1)在浓度以质量计为0.1％的丙烯酸钠溶液(pH7.0)中悬浮并搅拌，(2)静置，沉淀，和(3)除去上清液。
(3)酰胺化反应将3200g的0.2g/L的丙烯酸钠水溶液置于另外一个内容积为5升的烧瓶中。向丙烯酸水溶液中加入3g(2)中制备的固定化的微生物。搅拌溶液并保持pH7.0，温度20℃。
向所述溶液中连续加入丙烯腈以保持丙烯腈的浓度以质量计为2％，然后进行聚集反应直至丙烯酰胺的浓度以质量计达到50％。
反应结束后，将溶液用孔径为0.45μm的膜过滤器过滤以除去催化剂。
(4)评估聚合物的物理性质的方法将以质量计20％的实施例1(3)中得到的丙烯酰胺溶于以质量计80％的水中。调节pH 8.0后，将溶液转移至杜瓦瓶中，然后将系统中的空气替换为氮气。然后，加入0.0004％的过硫酸铵、0.0004％的硫酸铁和0.01％的4，4’-偶氮双-(4-氰基戊酸)进行聚合。将这样得到的含水凝胶状聚合物用碎肉机切成直径为几毫米的颗粒。然后将这些颗粒在80℃下干燥10小时，然后用Wiley碾磨机将其磨碎得到粒径为2mm或更小的颗粒，从而得到聚合物粉末。
将这样得到的聚合物粉末用500g水配制成浓度为0.2％的溶液，室温搅拌4小时使其溶解。然后测量布鲁克菲尔德粘度(B型粘度计，转子的转速30rpm，1号转子)。然后，溶液经过80目的金属网过滤，测定用水洗涤后保留在网上的不溶物质的质量。
(5)评估单体贮存稳定性的方法将50g实施例1(3)中得到的50％的丙烯酰胺单体水溶液和铁测试片置于100ml由聚乙烯制成的瓶子中，然后用盖子封瓶以防止挥发。将瓶子保存在50℃的高温盒中，然后根据聚合产物的产生与否确定其稳定性。
实施例1(4)和(5)的结果见表1和表2。
比较实施例1比较实施例1和实施例1类似地进行，只是在实施例1(2)中制备固定微生物的载体这一步中使用了0.7％的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)而不是以质量计0.1％的丙烯酸钠水溶液(pH 7.0)。结果见表1和表2。
表1聚合物的物理性质

表2贮存稳定性

此处引用的所有出版物、专利和专利申请都完整地引入作为参考。
工业适用性如上所详述，在用微生物催化剂生产丙烯酰胺时，使用经丙烯酸洗涤的微生物催化剂使得可以获得具有高贮存稳定性和优良质量的丙烯酰胺。


本发明所提供的是使用微生物催化剂生产具有良好的贮存稳定性和改良的丙烯酰胺聚合物物理性质的丙烯酰胺的方法。用丙烯酸水溶液洗涤具有将丙烯腈转化成丙烯酰胺的催化活性的微生物催化剂，然后将经洗涤的微生物催化剂用于转化反应以完成上述丙烯酰胺的生产。