专利名称：海洋微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法-半乳糖苷酶(3 -Galactosidase, EC3. 2. I. 23)又称乳糖酶、3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一种无毒副作用的生物酶制剂(张莉，东北农业大学学报，2009)。它能够 在特定的条件下水解P-D-半乳糖苷键(￠-1,4-糖苷键)，将乳糖水解成a D-葡萄糖和3D-半乳糖；同时乳糖酶具有转移半乳糖苷的作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半乳糖(卢丽丽等，微生物学报，2008)。早期￠-半乳糖苷酶生产方法主要是从哺乳动物组织和一些植物中提取，存在生产成本高、纯度低、生产工艺复杂等问题(张莉，东北农业大学学报，2009);利用微生物发酵生产3 -半乳糖苷酶工艺比较简单、生产成本较低、纯度高(周春雷等，极地研究，2010)。目前国内对微生物发酵生产￠-半乳糖苷酶的研究主要集中于中温酶，对低温酶的研究较少，主要是低温￠-半乳糖苷酶产生菌筛选、理化性质及酶分子特性的研究(刘文玉等，新疆农业科学，2007 ;李玉强等，食品添加剂，2001)。对海洋微生物发酵生产低温3-半乳糖苷酶的研究尚在起步阶段，产业化、规模化生产及应用还未见报道。与中、高温￠-半乳糖苷酶相比，海洋低温￠-半乳糖苷酶具有松散、柔顺的分子结构，使其在自然条件下具有更低的活化能、Km值及催化反应温度，这些特点可以加强其对底物的亲和力，提高底物利用率，从而降低能耗，缩短作用过程的时间；另外，低温￠-半乳糖苷酶对热很敏感，海洋低温￠-半乳糖酶上述这些特点有助于该酶制剂的推广和使用(李兴峰等，中国食品学报，2003)，这些优势是中、高温酶所无法比拟的。利用海洋微生物发酵生产的低温￠-半乳糖苷酶在降低生产成本和能耗方面的巨大优势，可从根本上摆脱中、高温酶应用的加热、冷却设备和工艺，从而减少工艺流程、降低生产成本、提高生产效率、改善并提高产品质量。该酶制剂开发对利用海洋资源，为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如疾病、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。因此，海洋微生物发酵生产的低温^-半乳糖苷酶具有广阔应用前景和巨大开发潜力。
本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶的方法，该方法主要是海洋微生物经过定向驯化后，按常规方法液体发酵生产低温3 -半乳糖苷酶，这种生产方法获得的海洋低温P -半乳糖苷酶活力可达120U/ml，如再经过分离和纯化可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂生成成本低、纯度高，应用操作简单、方便、快捷、 成本低，可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生￠-半乳糖苷酶的海洋微生物进行定向驯化，使其在自然条件下生长良好；(2)按常规方法将定向驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养48 84h时，即海洋微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶结束； (4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为P-半乳糖苷酶粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本项目中使用的菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。3 -半乳糖苷酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号1. 3或I. 11)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温P -半乳糖苷酶，驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在-80°C条件下可以长期保藏。(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。 实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸馏水I.0L, pH 值 7. 2，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基乳糖5. 0 15. Og,蛋白胨8. 0 12. Og,酵母膏5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸馏水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，琼脂 15. 0 25. Og,自来水 I. 0L，pH 值 7. 2，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 1.0 3.5g，自来水 1.01，？11值7.2，1211高压蒸汽灭菌30111111。(2)将产生P -半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种进行定向驯化，使其在常规压力、盐浓度条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌10 16°C培养24 36h，按5 8%接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5 7%接种量接入50L液体发酵培养基中，在12 14°C培养60 72h时，即海洋微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸馏水
I.0L, pH 值 7. 2，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种定向驯化培养基乳糖5. 0 15. Og,蛋白胨8. 0 12. Og,酵母膏5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸馏水 I. 0L，pH 值 7. 2，121 °C 高压蒸汽灭菌30mino
③液体种子培养基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，琼脂 15. 0 25. Og,自来水 I. 0L，pH 值 7. 2，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 1.0 3.5g，自来水 1.01，？11值7.2，1211高压蒸汽灭菌30111111。(2)将产生P -半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将⑵活化好的菌种进行定向驯化，使其在常规压力、盐浓度条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的P -半乳糖苷酶产生菌10 16°C培养24 36h，按5 8%接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的7 9%接种量接入200L液体发酵培养基中，在14 16°C培养48 60h时，即海洋微生物发酵生产低温P -半乳糖苷酶结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为P-半乳糖苷酶粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法，是将产生β-半乳糖苷酶的微生物进行定向驯化，使其在自然条件下生长良好；将定向驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养48～84h时，即海洋微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。