专利名称：一种提取石斛总rna的方法从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行分子生物学方面研究，如cDNA 合成、Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、cDNA文库构建及体外翻译等的必要前提和关键。 许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题。多糖的许多理化性质与RNA很相似，很难将它们分开，在去除多糖的同时RNA也容易被裹携走，造成RNA产量的减少。在沉淀RNA时，也容易产生含有多糖的RNA凝胶状沉淀，这种RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。此外，多糖还可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的RNA提取方法中，SDS-盐酸胍处理可以去除一部分多糖；高浓度Na+或 K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；低浓度乙醇可以沉淀部分多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。
本发明目的是提供一种提取石斛总RNA的方法，该方法操作简单，提取成本低，重复性好，能获得高质量、高浓度的RNA。本发明采用的技术方案是一种提取石斛总RNA的方法，所述的方法为(1)将采集的新鲜石斛茎置于液氮中研磨成粉末，转入经焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理过的离心管中，加入含水饱和酚的RNA提取液中，混勻后剧烈振荡5 lOmin，再加入氯仿，振荡，抽提5 lOmin，室温下5000rpm离心15min，得上清液A ；所述含水饱和酚的体积用量是RNA提取液体积用量的30% ；所述RNA提取液由如下组分组成pH9. 0的 50mMTris-Cl, IOOmM NaCl, 1% SDS ；(2)取步骤(1)获得的上清液A加入pH为4. 8的KAc溶液，KAc溶液的浓度为 5mol/L，充分混勻，4°C放置15 30min，4°C下12000g离心20min，得上清液B ；所述KAc溶液体积用量为上清液A体积的1/3 ；(3)取步骤(2)获得的上清液B，加入等体积氯仿，用力振荡，抽提5 lOmin，室温下5000rpm离心15min，取上清液，重复抽提3 5次，最终得上清液C ；(4)取步骤(3)获得的上清液C，加1/3体积8M的LiCl，混勻，于4°C放置16h 20h沉淀RNA，然后4°C下IOOOOrpm离心20min，得沉淀D ；(5)取步骤(4)获得的沉淀D，用70%的乙醇洗涤后，吹干洗涤后的沉淀，用DEPC处理重蒸馏水(ddH20)溶解吹干后的沉淀，获得所述石斛总RNA，在-80°C中保存备用。进一步，优选步骤C3)所述等体积氯仿重复抽提3次。本发明所述石斛为石斛兰(Dendrobium)，采自杭州师范大学浙江省药用植物种质改良与质量控制重点实验室。本发明通过提取液分离RNA，醋酸钾(pH4. 8，5M)沉淀多糖，再经过3次的氯仿重复抽提去除蛋白和部分多糖，最后经过LiCl(SM)沉淀RNA，所得的RNA完整性好，纯度高，提取的RNA的数量也比较大。提取的RNA样品可以满足基本的分子生物学实验要求，可以用来进行RT-PCR和Northern杂交。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明先利用醋酸钾(PH4.8， 5M)沉淀多糖，在较低的pH下，高浓度的K+有利于将多糖沉淀至下层，而RNA则保留在上层溶液，从而去除RNA中的部分多糖，并造成上层RNA液相中高浓度的K+，有利于随后氯仿抽提，进一步去除RNA中的多糖成分，经过以上两个步骤以后，RNA中的多糖成分可以被去除很大一部分，最后再通过LiCl沉淀可以得到较高质量和数量的RNA;本发明操作简单，提取成本低，重复性好，能获得高质量、高浓度的RNA。图1琼脂糖凝胶电泳检测石斛组织总RNA，电泳后用凝胶成像系统拍照所得的效果图A为加样孔，B为^S RNA, C为18S RNA, D为5S RNA。(3)取步骤(2)获得的上清液，加入等体积氯仿，用力振荡，抽提5min，室温下 5000rpm离心15min，取上清液，重复抽提3次；(4)取步骤(3)获得的上清液，加1/3体积8M的LiCl，混勻，于4°C放置16h 20h 沉淀RNA，然后4°C下IOOOOrpm离心20min ；(5)取步骤(4)获得的沉淀，用70%的乙醇洗涤后，吹干沉淀，用DEPC处理重蒸馏水(ddH20)溶解沉淀，获得所述石斛总RNA，在-80°C中保存备用。4、RNA完整性检测取上述方法制备的2 μ 1 RNA，1 %的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。通过凝胶成像可以观测到比较完整的RNA，其中^S RNA的亮度大约是18S RNA的两倍，加样孔正常，无发亮拖尾现象(图1)。5. RNA质量检测取上述方法制备的2 μ 1 RNA，用DEPC水稀释到100 μ 1后，力卩入到 Nanadrop (Thermo Scientific, Wilmington, USA)样品台中测量 RNA 浓度和似60/A280 的比值，分析RNA质量。结果表明用本方法在含糖量较高的石斛茎中提取的RNA具有较高的质量和产量，其中A260/A^0 = 1.96士0. 07，产量为30士2. 9 μ g/g鲜重。


本发明公开了一种提取石斛总RNA的方法，本发明先利用醋酸钾(pH4.8，5M)沉淀多糖，在较低的pH下，高浓度的K+有利于将多糖沉淀至下层，而RNA则保留在上层溶液，从而去除RNA中的部分多糖，并造成上层RNA液相中高浓度的K+，有利于随后氯仿抽提，进一步去除RNA中的多糖成分，经过以上两个步骤以后，RNA中的多糖成分可以被去除很大一部分，最后再通过LiCl沉淀可以得到较高质量和数量的RNA；本发明操作简单，提取成本低，重复性好，能获得高质量、高浓度的RNA。