专利名称：一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法锦鲤(Cryprinus carpiod)，以其绚丽的色彩、华丽的斑纹、雄健的身躯、温顺的习性而享誉世界，被人们称为“水中瑰宝”、“会游泳的艺术品”，是世界上最受欢迎的大型观赏鱼之一。锦鲤除具观赏价值外，还是营养丰富、肉质细嫩的食用鱼。近年来，随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀，锦鲤的病害问题日趋严重，各种传染性疾病尤其是病毒病的暴发，造成锦鲤死亡率逐年上升，极大地影响了锦鲤养殖业、观赏业、国际贸易出口业，经济损失严重。锦鲤疱疹病毒病由锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus, KHV)引起，主要感染锦鲤和鲤鱼，是锦鲤和鲤鱼养殖生产中发生的一种高致病性疾病，发病率和致死率均可高达80%-100%。1998年在以色列的Magan Michael地区暴发了锦鲤疾病，经鉴定其病原为KHV，导致渔场损失肉用鲤鱼600吨，出口损失近400万美元。随后该病传播与蔓延到美国、欧洲大陆、亚洲等；近年来我国已有该病毒病例的报道。 KHV非常特殊，只能在源自于原始宿主细胞中增殖，即在锦鲤细胞中增殖，很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中增殖。目前，国外常用锦鲤鳍条细胞系KF-I和普通鲤鱼脑细胞系CCB 进行该病毒培养，但国内未见报道。
本发明的目的是在于提供一种锦鲤鳍条组织细胞系的建立方法，即通过组织块移植法建立一种锦鲤鳍条细胞系。组织块的存在，为迁出细胞提供了良好的生长基质和环境， 对适应培养环境和促进细胞生长有重要作用，从组织块中迁移出来的细胞贴壁稳定、生长迅速，可生长成稳定的单层细胞；该方法具有操作方便、快速、效率高等特点，是常用的细胞原代培养方法之一。目前锦鲤疱疹病毒不仅感染锦鲤，而且已经在我国较大的范围内感染养殖鲤鱼，造成重大经济损失。在开展锦鲤疱疹病毒病原分离鉴定、疫病诊断与防控技术研究中，缺乏锦鲤疱疹病毒的敏感细胞系。本发明工艺科学合理，经这种方法建立的锦鲤鳍条细胞系，目前已传至60多代，对锦鲤疱疹病毒敏感，可望今后应用于锦鲤疱疹病毒的分离鉴定、病毒体外扩增、疫病诊断、病毒疫苗制备以及锦鲤疹病毒病的基础理论研究与免疫防治技术等方面的研究。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种锦鲤鳍条组织细胞系(Koi-Fin)的构建方法，其步骤是1.锦鲤鳍条组织块的制备首先将锦鲤放置在浓度为15-25克/升的高锰酸钾溶液中，消毒处理30-40min后再用70% (V/V)酒精擦拭鱼体表面，在II级生物安全柜(新加坡，ESC0)里无菌取出背鳍、腹鳍组织。用含450-550单位/毫升青霉素(Sigma)、450_550微克/毫升链霉素(Sigma)、12. 0-13. 0微克/毫升两性霉素B (Sigma)的磷酸缓冲液洗涤鳍条组织3 4次，用灭菌的眼科剪子将鳍条组织剪成约Imm3左右的碎块，均勻移植到25 毫升细胞培养瓶Oaring)里，于23-25°C培养箱里倒置干贴1. 5-2. 5小时。2.锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置取6. 8-7. 2毫升pH值为7. 0-7. 4 的MEM培养基(Sigma)，加入Iml胎牛血清(Hyclone)，为了促进锦鲤鳍条组织细胞的分裂和快速增殖，在上述培养液中添加0.01%。-0.02%。(W/V)的碱性纤维生长因子、 0. 01%。-0. 02%。(W/V)表皮生长因子。3.锦鲤鳍条组织细胞的原代培养将每瓶干贴后鳍条组织中添加专用增殖培养液，于23-25°C培养箱里培养，待观察到细胞从鳍组织周围迁出后，每隔3-5天半量更换锦鲤鳍条组织专用增殖培养液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2. 5ml培养液，以去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2. 5ml新鲜的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液。4.锦鲤鳍条组织细胞的传代培养待锦鲤鳍条组织细胞长成单层后，用移液管吸弃旧培养液，向每个细胞培养瓶里添加2毫升浓度为0.25-0. 4% (W/V)的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟左右，待细胞解离后，用手轻拍细胞培养瓶，每瓶加入2ml锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，轻轻吹打细胞；将细胞悬液吸至15毫升离心管(Coring)里，按照1000转 /分钟、离心5分钟；吸弃离心管里上清液，添加5ml新鲜锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，用移液管吹打细胞沉淀，制成细胞悬液，每个细胞培养瓶里添加2. 5毫升细胞悬液和2. 5毫升锦鲤鳍条组织细胞增殖培养液；待锦鲤鳍条组织细胞再次形成单层后，按照上述的锦鲤鳍条组织细胞的传代培养方法进行下一次传代培养。获得了一种分离的锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin。保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年10月沈日，分类命名锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin，保藏编号CCTCC NO C201199。锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin，首次传代细胞在4- 即可贴壁生长，大约5d能生长成汇合细胞单层，细胞呈典型的成纤维样；连续传代12次后，传代细胞约2d即可汇合成细胞单层，5d可形成致密细胞单层。通过三个实验分别比较了 Koi-Fin在四种不同培养基、四种不同培养温度、四种不同血清浓度中的细胞数目、细胞单层稳定性、增值速度等，确定Koi-Fin细胞的最佳培养基为MEME，最适血清体积分数为10% (V/V)，最适培养温度为 25°C。通过生长曲线，看到该细胞贴壁、生长、增殖前1. 5d为迟缓期，1. 5-3. 5d处于对数期， 3. 5-4. 5d为基本平台期，4. 5d后进入衰退期，大概6d即可完成一个生长周期，公式计算群体倍增时间为43.证。Koi-Fin细胞经液氮冷冻后复苏，通过染色，约80%的细胞具有细胞活性，并保持原有生长状态，目前该细胞已经稳定传代50多次。所用的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配方为pH值为7.0-7.4的 MEM培养基，30 % (V/V)胎牛血清，0. 01 0Z00 -0 . 0 2 0Z00 (W/V)的碱性成纤维生长因子、 0. Ol0Zoo -0. 02%。(W/V)表皮生长因子。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果经这种方法所获得的传代锦鲤鳍条组织细胞系可传至60代以上，主要特点为细胞形态清晰，细胞单层稳定，可连续稳定传代，能提供大量锦鲤鳍条组织细胞。细胞液氮冻存6个月以上复苏培养生长旺盛。该细胞对锦鲤疱疹病毒敏感，病毒感染Koi-Fin细胞可产生典型细胞病变效应，病毒滴度可达108TCID50以上，为锦鲤疱疹病毒的增殖提供了一个理想的细胞材料，对于研究锦鲤疱疹病毒的分离鉴定、病原检测、疫病诊断、疫苗制备与免疫预防技术研究有重要意义。5的碎块，均勻移植到25毫升细胞培养瓶里，于培养箱里倒置干贴2小时。2.锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置取7毫升pH值为7. 0或7. 1或7. 2 或7. 3或7. 4的MEM培养基，加入Iml胎牛血清，为了促进锦鲤鳍条组织细胞的分裂和快速增殖，在上述培养液中添加了 0. 01%。(W/V)的碱性成纤维生长因子、0. 01%。(W/V)表皮生长因子。3.锦鲤鳍条组织细胞的原代培养将每瓶干贴后的鳍条组织中添加专用增殖培养液，于培养箱里培养，待观察到细胞从鳍组织周围迁出后，每隔3或4或5天半量更换锦鲤鳍条组织专用增殖培养液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2. 5ml培养液， 以去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2. 5ml新鲜的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液。4.锦鲤鳍条组织细胞的传代培养待锦鲤鳍条组织细胞长成单层后，用移液管吸弃旧培养液，向每个细胞培养瓶里添加2毫升浓度为0.3% (W/V)的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟左右，待细胞解离后，用手轻拍细胞培养瓶，每瓶加入2ml锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，轻轻吹打细胞；将细胞悬液吸至15毫升离心管里，按照1000转/分钟离心5分钟；吸弃离心管里上清液，添加5ml新鲜锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，用移液管吹打细胞沉淀，制成细胞悬液，每个细胞培养瓶里添加2. 5毫升细胞悬液和2. 5毫升锦鲤鳍条组织细胞增殖培养液；待锦鲤鳍条组织细胞再次形成单层后，按照上述的锦鲤鳍条组织细胞的传代培养方法进行下一次传代培养。传代细胞约2天或3天即可铺满细胞培养瓶底部70% 左右即形成汇合细胞单层，5天或6天可形成致密细胞单层，即可进行下次传代培养。获得了一种分离的锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin。保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址 中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年10月沈日，分类命名锦鲤鳍条组织细胞系 Koi-Fin，保藏编号=CCTCC NO :C201199。实施例3 一种锦鲤鳍条组织细胞系的构建方法，其步骤是1.锦鲤鳍条组织块的制备首先将锦鲤放置在浓度为20克/升的高锰酸钾溶液中，消毒处理40min后再用70% (V/V)酒精擦拭鱼体表面，在II级生物安全柜里无菌取出背鳍、腹鳍组织。用含500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、12. 5微克/毫升两性霉素B的磷酸缓冲液洗涤鳍条组织3 4次，用灭菌的眼科剪子将鳍条组织剪成约Imm3 左右的碎块，均勻移植到25毫升细胞培养瓶里，于25°C培养箱里倒置干贴2. 5小时。2.锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置取7毫升pH值为7. 0或7. 1或7. 2 或7. 3或7. 4的MEM培养基，加入Iml胎牛血清，为了促进锦鲤鳍条组织细胞的分裂和快速增殖，在上述培养液中添加了 0. 02%。(W/V)的碱性成纤维生长因子、0. 02%。(W/V)表皮生长因子。3.锦鲤鳍条组织细胞的原代培养将每瓶干贴后的鳍条组织中添加专用增殖培养液，于25°C培养箱里培养，待观察到细胞从鳍组织周围迁出后，每隔3或4或5天半量更换锦鲤鳍条组织专用增殖培养液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2. 5ml培养液， 以去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2. 5ml新鲜的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液。4.锦鲤鳍条组织细胞的传代培养待锦鲤鳍条组织细胞长成单层后，用移液管吸弃旧培养液，向每个细胞培养瓶里添加2毫升浓度为0.4% (W/V)的胰蛋白酶消化液静置消化2分钟左右，待细胞解离后，用手轻拍细胞培养瓶，每瓶加入2ml锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，轻轻吹打细胞；将细胞悬液吸至15毫升离心管里，按照1000转/分钟离心5分钟；吸弃离心管里上清液，添加5ml新鲜锦鲤鳍条组织细胞专用培养液，用移液管吹打细胞沉淀，制成细胞悬液，每个细胞培养瓶里添加2. 5毫升细胞悬液和2. 5毫升锦鲤鳍条组织细胞增殖培养液；代锦鲤鳍条组织细胞再次形成单层后，按照上述的锦鲤鳍条组织细胞的传代培养方法进行下一次传代培养。传代细胞约2天或3天即可铺满细胞培养瓶底部70% 左右即形成汇合细胞单层，5天或6天可形成致密细胞单层，即可进行下次传代培养。获得了一种分离的锦鲤鳍条组织细胞系Koi-Fin。保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址 中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年10月沈日，分类命名锦鲤鳍条组织细胞系 Koi-Fin，保藏编号=CCTCC NO :C201199。本发明公开了一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法，步骤A、锦鲤鳍条组织块的制备将锦鲤放置在高锰酸钾溶液中，消毒处理，取鳍条组织转移至培养皿内，抗生素清洗，将鳍条组织块移植到细胞培养培养瓶里；B、锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置加入胎牛血清，在培养液中添加碱性成纤维生长因子、表皮生长因子；C、锦鲤鳍条组织细胞的原代培养将每瓶干贴后鳍条组织中添加专用增殖培养液，于培养箱里培养，添加锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液；D、锦鲤鳍条组织细胞的传代培养待锦鲤鳍条组织细胞长成单层后，制成细胞悬液，传代培养。方法易行，操作简便，工艺科学合理，建立的锦鲤鳍条细胞系，目前已传至60多代。