一种交替单胞菌及其在抑制赤潮藻生长中的应用制作方法

周进, 蔡中华, 詹五根, 陈璐

2012年7月25日

2012年3月21日

2012年3月21日

清华大学深圳研究生院

A01N63/02GK102604868SQ201210075599

藻生 单胞菌 赤潮 交替 抑制

1.交替单胞菌(Alteromonassp.) 18#，其保藏号为 CGMCC NO. 58042.一种制备权利要求I所述交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804胞外提取物的方法，包括如下步骤1)发酵交替单胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCC NO. 5804，离心收集上清液；2)用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有机相，即得到胞外提取物3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤I)中，所述发酵的温度为30°C，所述发酵的时间为24-36h ;所述离心的转速为 8000r/min,所述离心的时间为20min,所述离心半径为13. 5cm ；步骤2)中，所述上清液和乙酸乙酯萃取体积比为I 2，所述萃取的时间为2h-3h4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于在步骤2)中，在所述收集有机相后还依次包括去除所述有机相中的乙酸乙酯和溶解的步骤；在所述步骤I)和步骤2)之间还包括过滤所述上清液的步骤5.由权利要求2_4的方法制备的所述交替单胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCCN0. 5804 胞外提取物6.权利要求I所述的交替单胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCC NO. 5804或权利要求5 所述的胞外提取物在防治赤潮中的应用7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述防治赤潮通过抑制赤潮藻生长实现8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述抑制赤潮藻生长体现在如下 I)-4)中4种或者其中任意一种1)降低赤潮藻密度；2)降低赤潮藻的叶绿素含量；3)降低赤潮藻的光合效率；4)改变了赤潮藻中蛋白表达谱9.根据权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于所述应用为向赤潮藻的生长体系中加入权利要求I所述的交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或权利要求5 所述的胞外提取物，以抑制赤潮藻生长；所述赤潮藻具体为亚历山大藻10.一种赤潮藻抑制剂，其活性成分为权利要求I所述的交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或其胞外产物；所述赤潮藻具体为亚历山大藻

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种交替单胞菌及其在抑制赤潮藻生长中的应用

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到f/2培养液具体配方如下(每升海水中含无机盐质量)=NaNO3 37. 5mg, NaH2PO4 2. 5mg, Fe-EDTA 2. 5mg (FeCl3 I. 6g+EDTA 0. 9g)，盐酸硫铵素 5 μ g, Biotin VH O. 025 μ g, VB12 O. 025 μ g, CuSO4. 5Η20 O. 0098 μ g, ZnSO4. 7Η20 O. 022 μ g, CaCl2. 6Η20 O. 01 μ g, MgCl2. 4Η20 O. 180 μ g，Na2MoO4. 2Η20，O. 0063 μ g亚历山大藻(Alexandrium catenella)(香港株，中国科学院海洋研究所提供，产品目录号Algae20060309)实施例I、交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#的筛选及鉴定一、交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18# 的筛选2011年4月21日，南中国海近岸(深圳蛇口港)发生局域赤潮(深圳蛇口港赤潮发生区表层)，此次赤潮的原因藻为弯角藻(Eucampia zoodiacus Ehrenberg)(图I)，属于娃藻门 BaciIIariophyceae，脆杆藻科Fragilariaceae Schroder,海线藻属 ThalassionemaGrunow从该区域取回水样,水样带回实验室后经纱布过滤,除掉水中杂质和大型颗粒物； 随后经100 μ m金属网格过滤，除掉水中的有机碎屑；最后经10 μ m滤膜过滤除取藻细胞，滤液进行涂布和筛菌将上述准备好的滤液进行倍比稀释，取30 μ L涂布于2216Ε海水固体培养基上 (配方蛋白胨5. 0g，酵母膏1.(^，磷酸铁0.018，陈海水1000ml，琼脂20g，调pH至7. 8)， 过夜培养，直至长出清晰的单克隆共挑选出100株可培养细菌随后挑取单克隆在2216E液体培养基中(ImL)，摇床上30°C培养12小时，备用将挑选的单克隆菌株以IX IO6个/mL的量加入亚历山大藻培养液(将亚历山大藻在f/2培养液中培养得到的培养液)中作为实验组，连续监测I周内对藻类生长的抑制情况，以不加入单克隆菌株为对照组，在双筒显微镜下计数(4X10倍)检测藻密度，每个样品计数3次， 结果取平均值其中编号为18#细菌对藻类抑制的结果如图2所示，可以看出，添加菌液一天后即能抑制藻类的生长，两天后实验组的藻细胞密度下降为对照组的52. 6%，至三天时， 实验组的藻类基本停止生长与分裂，90%的藻类生长被抑制，藻类生物量与对照组相比显示极显著差异(P <0.01)因此，认为初步筛选得到菌株18#二、18#菌株的鉴定I、生理生化特征鉴定I. I形态观察采用2216E固体培养基，将纯化后的18#单克隆菌株于30°C下培养24h，并进行革兰氏染色及菌体形态的显微镜观察(油镜，放大倍数1000倍)染色方法参照《微生物学检验实验指导》的方法进行(作者桂芳，出版社中国医药科技出版社，出版时间2009年 8月，ISBN =9787506742238)实验结果表明菌株为革兰氏阴性菌；形态为两端钝圆的小杆菌，具鞭毛，菌体大小为(O. 4 O. 5) X (I. O 2. O) μ mI. 2生理生化特征生理生化特征的检测采用变形杆菌套装生化鉴定试剂盒进行(上海丽臣ELISA试剂盒厂，产品编号20214)实验结果显示硫化氢阳性，苯丙氨酸脱氢酶阳性，脲酶阳性2、分子鉴定提取菌株18#的DNA，利用16SrRNA通用引物(正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； 反向引物CTGAGCCAGGATCAAACTCT) PCR扩增出PCR产物即为16S_rRNA的编码基因，将PCR 产物进行电泳检测，结果如图3所示，1-8泳道为8个平行，将得到条带大小为1300bp的产物送去测序，结果该PCR产物(16S-rRNA的编码基因)具有序列表中序列I所示的核苷酸经序列比对后证明，菌株18#的16S_rRNA的编码基因与Y -变形杆菌纲(Gammaproteobacterium),交替单胞菌目(Alteromonadales),交替单胞菌科 (Alteromonadaceae),交替单胞菌(Alteromonas sp.)的 16S_rRNA 的编码基因有 98% 的相似性(Genbank AF529061)因此上述菌株18#为Y-变形杆菌纲(Gammaproteobacterium),交替单胞菌目 (Alteromonadales),交替单胞菌科(Alteromonadaceae),交替单胞菌属(Alteromonas)菌株，已于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 5804，其分类命名为交替单胞菌(Alteromonas sp.)实施例2、交替单胞菌(Alteromonas sp. ) 18#在抑藻中的应用一、交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#抑藻的方法I、交替单胞菌(Alteromonas sp. ) 18#的发酵培养及胞外产物的获得将由实施例I 得到的交替单胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804 在 200mL 三角瓶中进行一级培养(2216E液体培养基，配方蛋白胨5.0g，酵母膏l.Og，磷酸铁 0. Olg,陈海水IOOOmL,调ph至7. 8)，培养条件为30°C，转速200r/min,时间14h，待菌株密度接近OD6tltl = 2时，将培养液转入2000mL的三角瓶中进行二级培养(2216E液体培养基， 配方蛋白胨5. 0g，酵母膏1.(^，磷酸铁0.018，陈海水IOOOmL,调pH至7. 8)，培养条件为 30°C，转速200r/min，时间36小时，直至培养基基本耗尽，细胞密度不在增加为止收集发酵培养液，离心(4°C，8000r/min, 20min,离心半径13. 5cm)，取上清液将上清液进一步用0. 22 μ m的滤膜进行过滤，以除掉期间未能离心去除的菌液和少量杂质 将滤液收集到干净的玻璃容器中，按照I 2的体积比例加入乙酸乙酯进行萃取，用磁力搅拌器充分混匀，持续混合萃取3h之后用分液漏斗将水相和有机相分开，收集水相进行第二次萃取将两次萃取的有机相合并，装入IL容量的蒸馏烧瓶中，进行旋转蒸发(55°C)，待液体蒸发完毕用甲醇将蒸馏物进行溶解，所得溶液即为胞外产物(图4)2、实验用藻细胞的培养实验所用藻种为亚历山大藻(Alexandrium catenella)(香港株)取实验室传代培养的藻种(初始密度为0. 3X IO4个/mL)，分装于15个IOOOmL的三角瓶中(每瓶装液500mL)，分装后培养连续监测，待藻处于对数生长期的前期时，即藻密度在0. 6 X IO4个/ mL(藻在藻培养液中的密度)时，进行如下分组试验，试验设五个实验组，每组3个平行藻的培养条件如下温度为21±1°C，光照时间L D = 12h 12h，光照强度 3000Lxo五个实验组分别如下空白组(不含甲醇溶剂，不含细菌胞外产物)，继续培养；对照组(含甲醇溶剂，不含细菌胞外产物)，再向三角瓶中加入无水甲醇，甲醇的终浓度为0. 05% (v/v)，继续培养；胞外产物Ippb (含甲醇溶剂，含细菌胞外产物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外产物，使胞外产物的终浓度为lppb (m/v)，继续培养；胞外产物IOppb (含甲醇溶剂，含细菌胞外产物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外产物，使胞外产物的终浓度为IOppb (m/v)，继续培养；胞外产物IOOppb (含甲醇溶剂，含细菌胞外产物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外产物，使胞外产物的终浓度为IOOppb (m/v)，继续培养将上述各组加入各种物质记作继续培养的第O天二、检测I、胞外产物对藻的杀灭效果将上述5组的培养产物在双筒显微镜下(4X 10倍)进行藻细胞计数，每个样品计数3次，结果取平均值结果如图5和图6所示，图5为6天时不同剂量胞外产物对藻细胞的生存状态的影响，可以看出Ippb时，藻细胞均匀分布，藻培养液呈浅黄色；100ppb时，藻细胞碎裂、溶解， 部分细胞沉底，藻培养呈白色图6为不同剂量胞外产物对藻密度影响的效果曲线，可以看出，空白组在0、2、4、6、8、10 天的藻密度(个/mL)分别为 6000、6100、6300、6800、 8600、12000对照组在0、2、4、6、8、10 天的藻密度(个/mL)分别为 6100、6150、6200、6700、 8300、11000胞外产物Ippb在0、2、4、6、8、10天的藻密度(个/mL)分别为6050、6160、6300、 6800、7200、8900胞外产物IOppb 在 0、2、4、6、8、10 天的藻密度(个/mL)分别为 6200、6200、5400、 4200、3000、2500胞外产物IOOppb 在 0、2、4、6、8、10 天的藻密度(个/mL)分别为 6250、5200、3000、 1200、1002、1002可以看出，从O天显微镜检开始,交替单胞菌(Alteromonas sp. ) 18#胞外产物对藻细胞的杀灭作用呈现剂量关系，随着浓度的提高杀灭效果更显著，至6天左右杀灭率达 80%以上，抑藻效果达到峰值2、胞外产物对亚历山大藻叶绿素和光合效率的影响检测上述5组继续培养的藻的叶绿素、光合效率，具体方法如下各组赤潮藻的叶绿素和光合效率测量采用浮游植物分类荧光仪(ΡΗΥΤ0-ΡΑΜ)进行，具体操作如下，取3mL 藻液(连续培养的培养产物)装入测量杯置于暗盒内，对藻体进行20min暗适应，打开 Phyto-PAM调制脉冲荧光仪波长为520nm强度为O. I μ mol/(m2 · s)的绿色检测光测量过程由Phytowin软件控制，开启测量光(ML)，待光信号稳定后打开饱和脉冲键，记下Fv/Fm 值，即为光合效率yield值叶绿素水平的(ChI)测定也使用该仪器进行结果如图7和图8所示，其中，图7为胞外产物对亚历山大藻叶绿素含量的影响， 图8为胞外产物对亚历山大藻光合效率的影响；从图7中可以看出，空白组在0、2、4、6、8、10 天的叶绿素含量(μ g/L)分别为 21. 3、26· 3、39· 4、45· 7、 47. 7,54. 5对照组在0、2、4、6、8、10 天的叶绿素含量(μ g/L)分别为 23. 2、27· 2、38· 7、47· 8、 49. 7,55. I胞外产物Ippb在0、2、4、6、8、10天的叶绿素含量(μ g/L)分别为22. 2,26. 7、 38. 5、45· 6、45· 3、53· 2胞外产物IOppb在0、2、4、6、8、10天的叶绿素含量(μ g/L)分别为21. 9、23· 4、 16. 8,15. 3,15. 9,15. 8胞外产物IOOppb在0、2、4、6、8、10天叶绿素含量(μ g/L)分别为23. 0、22. I、