专利名称：可调节色素分泌的组织工程皮肤及其构建方法 组织工程是目前生命科学领域的研究热点，相关的研究涉及到各个方面。近年来，随着组织工程技术的发展，研制人工皮肤替代物的研究报道逐渐增多，尤其是通过组织工程技术研制不同类型的人工皮肤，其核心是应用工程学的原理和方法与生命科学相结合，发展具有恢复、保持或改善功能的生物替代品。皮肤是覆盖与保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损与异常。对于这种组织缺损目前多采用自体皮瓣或自体皮肤的移植，这种方法不仅存在着造成供皮区新的创伤缺陷，而且常常存在着供皮来源受限的影响。此外，移植物经常与邻近部位的皮肤存在着色泽、质地和功能上的差异。理想的皮肤替代品应该是能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，这就是所谓全层复合皮肤。复合皮肤包括两种细胞成分，即位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞。目前，尽管组织工程学方法在皮肤、粘膜、肌肉、骨(和软骨)、血管、神经和角膜的研制方面已经取得了巨大进展，部分产品已经应用于临床，并获得了可喜的治疗效果与市场效益，但是已经或正在研制中的组织工程产品仍不完善，目前所见报道的组织工程皮肤替代物大多与正常组织有较大差异，如前所述没有正常皮肤的毛囊、血管、汗腺以及黑色素细胞、郎格罕细胞等成分。在方法成熟上、研制周期上以及在产品成本上等多方面存在有缺陷。研制中的组织工程产品距临床应用还有一定的距离。
根据现有技术状况，本发明的目的在于，提供一种可调节色素分泌的组织工程皮肤及其构建方法。本发明可调节色素分泌的组织工程皮肤，其特征在于是由体外培养的角朊细胞、皮肤成纤维细胞和黑色素细胞经组织工程方法构建而成；所述的角朊细胞、皮肤成纤维细胞和黑色素细胞是从人的包皮组织分离后经扩大培养所建立的相应细胞库中获取；所述的皮肤成纤维细胞是指与表皮分离后的真皮成纤维细胞；真皮成纤维细胞是以0.5×105～1×107/ml的密度与浓度为1～15％的小牛皮I型胶原混合培养后，再以1×105～5×106/ml密度接种角朊细胞；角朊细胞中所含黑色素细胞的比例为2％-30％。根据所述的可调节色素分泌的组织工程皮肤，本发明提供的构建方法，包括有灭菌、消化、分离和培养，其特征在于包括以下步骤(1)构建组织工程皮肤的细胞来源、分离和培养a)将人的包皮组织用70-80％乙醇浸泡；b)用皮肤分离液对包皮组织进行消化，手工分离表皮和真皮；c)分别在分离的表皮和真皮中加入表皮消化液和真皮消化液，消化后离心，去除消化液，分别得到角朊细胞和真皮细胞；d)将消化后的角朊细胞分成两份，分别加入角朊细胞培养液和黑色素细胞培养液培养，再进行扩大培养；e)将消化后的真皮细胞在培养液中重悬，得真皮成纤维细胞，接种到培养瓶中，进行扩大培养。(2)构建可调节色素分泌的人工皮肤a)取真皮成纤维细胞以0.5×105～1×107/ml的密度与浓度为1～15％的小牛皮I型胶原混合，孵育凝固后，加入培养液培养3～7天；孵育温度37℃，时间20-120分钟；b)在凝固后的真皮成纤维细胞表面以1×105～5×106/ml密度接种角朊细胞，角朊细胞中混合有2％～30％的黑色素细胞，黑色素细胞的具体比例是根据所构建皮肤的肤色要求确定；c)继续培养(3～7天)至细胞汇集成片，将复合了真皮成纤维细胞、角朊细胞和黑色素细胞的小牛皮I型胶原移至气液面进行器官培养，培养3～21天即获得组织工程皮肤，保存备用。
本发明所述的可调节色素分泌的组织工程皮肤的构建方法中的消化过程，需多次用加入有抗生素的磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行清洗；消化过程中所用的皮肤分离液是指消化表皮和真皮之间的基底膜并将表皮和真皮分离的消化液，主要成分是中性蛋白酶，以2.4单位/毫升浓度配制；所述的表皮细胞消化液是指消化细胞间基质，将角朊细胞从表皮中分离的消化液，主要成分是胰酶，以0.25％浓度配制；所述的真皮细胞消化液是指消化真皮的纤维缔结组织，将真皮成纤维细胞从真皮组织中分离出来的消化液，主要成分是I型胶原酶，以625单位/毫升浓度配制。所述的黑色素细胞培养液的配方为90％～98％商用培养基MCDB153，2％～10％胎牛血清，并含有商用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)0.2～1.5ng/ml和商用血管内皮素(Endothelin-1)1.5～5ng/ml。
本发明所建立的黑色素细胞培养方法可以使黑色素细胞保持高增殖活力和良好的生长状态，并且可以达到100％的纯度。因此，本发明将黑色素细胞与角朊细胞按适当的比例混合，进一步构建能够调节皮肤色素生成的组织工程皮肤以满足不同临床病例的要求。实验结果表明，所构建的组织工程皮肤结构完整，表皮细胞和成纤维细胞活力良好。动物实验用所构建的含色素的人组织工程皮肤修复裸鼠的全层皮肤缺损，结果显示其可以有效地修复动物的全层皮肤缺损，并且成功地形成了含色素的皮肤。附图中的对比照片对本发明的效果做了很好的说明。


图1本发明皮肤在培养过程中所见到的明显色素照片。
图2对照组在相同条件下无色素出现的照片。
图3Dopa染色显示黑色素细胞位于皮肤基底部照片。
图4S-100染色显示黑色素细胞位于皮肤基底部照片。
图5透射电镜观察显示细胞浆中丰富的黑色素照片。
图6用本发明皮肤修复的全层皮肤缺损裸鼠照片。
图7；用不含黑色素细胞皮肤修复的全层皮肤缺损裸鼠照片。
图8图6裸鼠黑色素细胞状态照片。其中图1是在本发明皮肤器官培养3天后就可以见到明显的色素出现；图2说明不含黑色素细胞的组织工程皮肤在同样条件下培养3天后仍为白色，未见到色素形成；图5说明黑色素细胞位于皮肤基底部，细胞浆中有丰富的黑色素颗粒。细胞突起深入到角朊细胞之间；图6说明用本发明皮肤修复的全层皮肤缺损裸鼠在6周后即可见到皮肤愈合良好，表面光滑，色泽为黑色；图7说明用不含黑色素细胞皮肤修复的全层皮肤缺损裸鼠在6周后即可见到皮肤愈合良好，表面光滑，与周围组织未见明显色泽差异；图8是针对S-100免疫组化染色显示，用含黑色素细胞皮肤修复的全层皮肤缺损裸鼠的皮肤基底部含有大量黑色素细胞，表明含有黑色素细胞皮肤成功修复了裸鼠的全层皮肤缺损，黑色素细胞状态良好。

以下结合实验对本发明方法做进一步的详细说明1、各细胞的分离、培养(I)取新生儿或青少年包皮环切术后包皮组织，为保证无菌，处理前在75％乙醇中浸泡1分钟；(II)将包皮组织转入培养皿中，用加有抗生素的PBS缓冲溶液清洗，用剪镊修剪，去除皮下组织，用刀片将组织分切为2mm×10mm；(III)取4块组织放入离心管中，加入4ml皮肤分离液，37℃消化2.5小时；如果用冷消化(推荐使用)，则用PBS将上述分离液稀释一倍，加入4ml，4℃消化14-16小时；(IV)将消化后的皮肤置入培养皿中，用镊将表皮和真皮仔细分离(须极为小心，避免把真皮组织带入表皮组织中)，此外，消化后的皮肤最好不要清洗，因为残留在组织内的消化液含有中性蛋白酶，有利于下一步的消化；(V)将分离的表皮放入离心管中，加入表皮细胞消化液4ml，37℃消化10分钟；用含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，过200目筛网以去除剩余残渣，收集滤液，离心去除消化液，用PBS清洗两次，将所得角朊细胞分为两份，分别加入商用角朊细胞培养液K-SFM和黑色素细胞培养液培养；(VI)将真皮组织剪碎后置入离心管，加入4m1真皮细胞消化液，37℃消化至大部分组织消失(个体不同，时间有所差异，约4-5小时)；离心去除消化液，用PBS清洗两次，用真皮细胞培养液重悬细胞，接种于培养瓶培养；(VII)原代细胞长满70％-80％时，用0.25％(w/v)胰酶消化传代，扩大培养。
2、可调节色素分泌的组织工程皮肤的构建取生长状态良好的细胞，将真皮成纤维细胞以1.5×106/ml的密度与取自小牛皮浓度为6％的I型胶原混合，37℃孵育凝固后，加入培养液培养4天；在其表面以1×106/ml密度接种角朊细胞(其中含有3-5％的黑色素细胞)，继续培养3天，将复合了细胞的胶原移至气液面进行器官培养，培养1-2周即获得组织工程皮肤，保存备用。取所构建的组织工程皮肤，用Dopa染色、透射电镜和免疫组化(S-100抗体)检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态，以及色素的分泌情况。结果可见含黑色素细胞的组织工程皮肤在气液面上培养到第三天时，可以见到明显的色素出现(图1)，呈棕黑或黄褐色；对照组不加黑色素细胞的组织工程皮肤为白色(图2)；Dopa染色(图3)和S-100免疫组化(图4)结果显示，在组织工程皮肤基底层处可见散布的黑色素细胞，细胞与周围角朊细胞排列紧密，其突起深入到周围的角朊细胞之间；透射电镜结果显示，黑色素细胞分布在表皮基底层，胞浆中有丰富的黑色素颗粒，突起深入到角朊细胞间(图5)。
上述结果表明，本发明能成功地构建可以调节色素分泌的组织工程皮肤。
3、动物皮肤缺损修复实验2％戊巴比妥钠腹腔注射30～50mg/kg麻醉，在Balb/c裸鼠背部切取全层皮作圆形创面，直径1.5cm，以供皮肤移植。取上述含黑色素的组织工程皮肤，覆盖创面，用线缝合，加压包扎。对照组用不含黑色素的组织工程皮肤修复皮肤缺损。6周后取标本，4％多聚甲醛固定，脱水透明，石蜡包埋，切片，烤片后脱蜡至水，行免疫组织化学染色(S-100抗体)。结果显示取材时，可见裸鼠皮肤缺损愈合良好，表面光滑，色泽为黑色(图6)，但是皮肤仍有一定的收缩。对照组裸鼠无色素生成(图7)。免疫组化结果显示，在表皮基底细胞层可见大量S-100阳性细胞，细胞突起较多，伸入到临近角朊细胞之间，为典型的黑色素细胞的特征(图8)。
本发明组织工程方法通过获得自体或异体的极少量皮肤组织，将其在体外(实验室中)经过灭菌、消化、分离、培养，在获得足够的细胞数量时将其重组成全层皮肤组织(包括表皮层及结缔组织)，用于患者皮肤创伤的修复，该全层皮肤组织在种植后不易变形，易于愈合。以此为基础，今后我们就可以制作含不同比例黑色素细胞的组织工程皮肤，从而获得各种色泽的皮肤以满足不同的临床修复要求。如果能缩短体外培养时间，彻底解决组织工程方法研制的异体皮肤的免疫排斥，建立用于皮肤组织工程的种子细胞系统，降低成本，建立异体皮肤库，将有重要的临床价值和社会经济效益。


本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，涉及一种可调节色素分泌的组织工程皮肤及其构建方法，特征是在体外培养皮肤的角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，然后用组织工程方法在体外将这三种细胞按比例混合，构建含有色素的人工皮肤；同时，通过改变掺入黑色素细胞的比例，可以获得具有不同肤色的人工皮肤以应用于皮肤缺损修复和美容修复，满足不同的临床修复要求。