专利名称：一种抗嗜水气单胞菌感染的微胶囊疫苗制备方法由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的鱼类细菌性败血症，每年都会给 鱼类养殖带来巨大的经济损失。目前研究表明，注射适量的嗜水气单胞菌灭活疫苗能够显 著增强鱼类的非特异免疫活性和抗感染能力，但以疫苗注射为手段的免疫疗法在养殖实践 操作中费时费力，不利于大规模推广。西伯利亚鲟隶属于鲟科、鲟属，是现存沈种鲟鱼中的一种，主要分布在俄罗斯西 部的鄂毕河至东部的科雷马河之间的西伯利亚各河流之中。我国自1992年开始人工养殖 以来，至今已经形成了庞大的养殖规模，养殖产量高达几千吨。然而，我国西伯利亚鲟养殖 一直深受病害的困扰，尤其是由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，每年都会给西伯利亚 鲟养殖带来巨大的经济损失。目前研究表明，注射适量的嗜水气单胞菌灭活疫苗能够显著 增强西伯利亚鲟的非特异免疫活性和抗感染能力，但以疫苗注射为手段的免疫疗法在养殖 实践操作中费时费力，不利于大规模推广。近年来，微胶囊技术在人和畜禽口服疫苗研究中 的应用日益广泛，有关水产动物微胶囊口服疫苗的研究也取得一定进展。但还没有针对鲟 鱼细菌性败血症防治的胶囊疫苗制备。
为了克服疫苗注射为手段的免疫疗法在鱼类养殖实践操作中费时费力，不利于大 规模推广的问题，发明人提供了一种用于西伯利亚鲟细菌性败血症防治的微胶囊疫苗的制 备方法。可用于制备防治鲟鱼，尤其是西伯利亚鲟细菌性败血症的微胶囊疫苗。实现本发明的技术方案如下提供一种抗嗜水气单胞菌感染的微胶囊疫苗制备方法，包括以下步骤1)嗜水气单胞菌菌悬液的制备将嗜水气单胞菌接种于PH7. 2的普通营养肉汤中，于30°C，150转/min摇床振荡培养 24-72 h后离心洗涤，制成有效活菌含量为101°个/ml的菌悬液，并用福尔马林灭活，保存；2)嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的制备将上述步骤制备的菌悬液与5%海藻酸钠溶液以1: 1的比例，在漩涡振荡器上混合均 勻，进行喷雾干燥处理，得微胶囊颗粒。所述的步骤1)嗜水气单胞菌菌悬液的制备中，优选条件为将嗜水气单胞菌接种 于PH7.2的普通营养肉汤中，于30°C，150转/min摇床振荡培养48 h后离心洗涤，制成有 效活菌含量为101°个/ml的菌悬液，并用福尔马林灭活，保存。所述的离心为于3000转/min离心20 min,所述的洗涤为用无菌生理盐水洗涤3 次，所述的保存为于4°C冰箱保存。
所述的步骤2)中嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的制备中，将上述步骤制备的菌悬液与 5%海藻酸钠溶液以1:1的比例，在漩涡振荡器上混合均勻，得到物料溶液，将其进行喷雾干 燥处理，得微胶囊颗粒。所述的喷雾干燥参数为风量100%，进风温度100 0C -120 °C，出风温度 450C -55°C，进料量30-40ml/h，通针频率5 s ；喷雾干燥期间保持气流量为550-650 m3/h ； 气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度110-120°C，
所述的喷雾干燥参数优选为风量100%，进风温度115°C，出风温度48°C，进料量35 ml/h，通针频率5 s;喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h ；气体通过鼓风机后被过滤并加 热到设置温度115°C。所述的物料溶液进行喷雾干燥处理后，由蠕动泵将物料溶液传送到喷雾器，通过 旋风分离器收集微囊颗粒。针对日益严重的细菌性疾病，越来越多的水产养殖研究者倾向采用疫苗接种法 进行防治。与其它免疫接种方法相比，口服免疫法更适合于大规模的养殖鱼群，不受鱼的大 小及时间的限制，对鱼也不产生应激反应，尤其易于多次重复免疫，因而解决了鱼类再次免 疫的技术难题。本发明以西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌的微胶囊疫苗为研究对 象，观察了其对西伯利亚鲟非特异性免疫和抗感染能力的效果，提供了一种专用于鲟鱼细 菌性败血症防治的微胶囊疫苗制备方法，并通过所提供的测定方法验证了该制备方法所得 产品的有效性。


图1 BABL/C小白鼠抗血清抗体凝集效价测定；
图2西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟 过氧化酶含量的影响；
图3西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟 血清碱性磷酸酶含量的影响；
图4西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟 血清溶
菌酶含量的影响。

西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Si，购于农业部渔业动植物病原 库；普通营养肉汤、无菌生理盐水、福尔马林、海藻酸钠，购于国药集团(上海)化学试剂有限 公司；温控摇床，购于美国Thermo i^orma公司；高速离心机，购于日本三洋公司；漩涡振荡 仪，购于上海淇特分析仪器有限公司；小型喷雾干燥仪SY-6000，购于上海世远生物设备工程有效公司；西伯利亚鲟，健康无病伤，体重50 70克，体长13 16厘米，均购于浙江省千 岛湖鲟鱼养殖基地；BABL/C小白鼠，购于上海第二军医大学；过氧化酶检测试剂盒、溶菌酶 检测试剂盒、蛋白定量(双缩脲法)测试盒，购于南京建成生物工程研究所第一分所；PH7. 2 的普通营养肉汤、5%海藻酸钠溶液在1 X IO51 高压湿热灭菌20 min后备用。实施例一
嗜水气单胞菌菌悬液的制备
在无菌条件下将试管斜面培养基上保存的西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单 胞菌菌株Sl接种于PH7.2的普通营养肉汤中，于30°C，150转/min摇床振荡培养48 h后 于3000转/min离心20 min,用无菌生理盐水洗涤3次，制成有效活菌含量为101°个/ml的 西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl菌悬液，并用福尔马林灭活，于4°C 冰箱保存。实施例二
嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的制备
将4°C冰箱保藏灭活的西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl菌悬液 200 ml与5%海藻酸钠溶液200 ml在漩涡振荡器上混合均勻，打开鼓风机，紧接着打开喷雾 干燥仪、蠕动泵和通针泵，设置参数为风量显示100%，进风温度115°C，出风温度48°C，进 料量35 ml/h，通针频率5 S。喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h。气体通过鼓风机后被 过滤并加热到设置温度115°C，蠕动泵将物料溶液传送到喷雾器，通过旋风分离器收集微囊 颗粒，于4°C冰箱中保存。实施例三
嗜水气单胞菌微胶囊疫苗免疫原性的测定
1、随机选取健康4周龄雌性的BABL/C小白鼠30只，随机分成2组，即西伯利亚鲟细菌 性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组、对照组，每组各设3个平行。 其中，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组BABL/ C小白鼠每天投喂含有西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗 的饲料，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的添加剂量为6 g/Kg饲料，对照组BABL/C小白鼠每天投喂不含西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单 胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的添加剂量为6 g/Kg饲料，连续投喂7天，之后停饲并分别立即将 各组BABL/C小白鼠进行眼眶取血并收集于离心管中，室温静置2 h后4°C过夜，然后于4°C、 5000转/min条件下离心15 min后取上清，采用间接酶联免疫吸附法进行抗体凝集效价测 定，以西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组BABL/ C小白鼠阳性稀释血清在405纳米波长处的吸光度值与对照组BABL/C小白鼠阴性血清在 405纳米波长处的吸光度值的比值大于2. 1时的阳性血清抗体最大稀释倍数为抗体效价。2、嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的血清抗体凝集效价
西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Si微胶囊疫苗的血清抗体凝集效 价测定结果见图1.实验结果表明，采用间接酶联免疫吸附法测得西伯利亚鲟细菌性败血 症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组的BABL/C小白鼠抗血清抗体凝集效 价为6400。实施例四嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对西伯利亚鲟非特异免疫效果的测定
1、随机选取健康西伯利亚鲟600尾，随机分成2组，即西伯利亚鲟细菌性败血症致病性 嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组、对照组，每组各设3个平行。其中，西伯利亚 鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组的西伯利亚鲟每天投 喂含有西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的饲料，西伯利 亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的添加剂量为6 g/Kg饲料，连 续投喂7天，之后改投不含西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫 苗的饲料；对照组西伯利亚鲟一直投喂不含西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌 菌株Sl微胶囊疫苗的饲料，每天投饲量均为西伯利亚鲟总体重的3%。在停饲含西伯利亚鲟 细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的饲料后每隔7天分别在各个组中 取西伯利亚鲟采血制备血清，按照检测试剂盒说明书测定血清过氧化酶、免疫球蛋白、溶菌 酶的含量。试验周期为35天，试验期间连续充氧，水温控制在20 21°C。2、试验结果
2.1西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟 血清过氧化酶含量的影响
西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟血清 过氧化酶含量的影响的结果见图2。实验结果表明，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水 气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗能够显著提高西伯利亚鲟的血清过氧化物酶含量。具体表现 在在连续口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗7天后的 观天内，西伯利亚鲟血清过氧化物酶含量较对照组有显著升高，其中西伯利亚鲟血清过氧 化物酶含量在连续口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗 7天后的第21天达到最大值，为6. 86 U/mgprot，较对照组提高了 50. 15%。2. 2西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利 亚鲟血清免疫球蛋白含量的影响
西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Si微胶囊疫苗对西伯利亚鲟血清 免疫球蛋白含量的影响的结果见图3。实验结果表明，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜 水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗能够显著提高西伯利亚鲟的血清碱性磷酸酶含量。具体表 现在在连续口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗7天后 的观天内，西伯利亚鲟血清碱性磷酸酶含量较对照组有显著升高，尤其是西伯利亚鲟血清 碱性磷酸酶含量在连续口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊 疫苗7天后的第21天达到最大值，为67. 37 U/L，较对照组提高了 52. 91%。2. 3西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利 亚鲟血清溶菌酶含量的影响
西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Si微胶囊疫苗对西伯利亚鲟血清 溶菌酶含量的影响的结果见图4。实验结果表明，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单 胞菌菌株Sl微胶囊疫苗能够显著提高西伯利亚鲟的血清溶菌酶含量。具体表现在在连续 口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗7天后的观天内， 西伯利亚鲟血清溶菌酶含量较对照组有显著升高，尤其是西伯利亚鲟血清溶菌酶含量在连 续口服西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗7天后的第21天达到最大值，为191. 43 U/ml，较对照组提高了 92. 51%。实施例五
嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对西伯利亚鲟相对免疫保护率的测定 1、随机选取健康西伯利亚鲟20尾，随机分成2组，即西伯利亚鲟细菌性败血症致病性 嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组、对照组。其中，西伯利亚鲟细菌性败血症致 病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲口服组的西伯利亚鲟每天投喂含有西伯利亚鲟 细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的饲料，西伯利亚鲟细菌性败血症 致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的添加剂量为6 g/Kg饲料，连续投喂7天，之后改 投不含西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的饲料；对照组 西伯利亚鲟一直投喂不含西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫 苗的饲料，每天投饲量均为西伯利亚鲟总体重的3%。在停饲含西伯利亚鲟细菌性败血症致 病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗的的饲料后21天用有效活菌含量为1. 0 X IO7个/ml 西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl菌悬液进行胸鳍基部注射感染，每 尾注射剂量为0. 2 ml，对照组注射等量的无菌生理盐水。连续观察7天，记录对照组西伯利 亚鲟的死亡数目和西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗拌饲 口服组西伯利亚鲟的死亡数目，计算相对免疫保护率。2、西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚 鲟相对免疫保护率的测定
西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株Si微胶囊疫苗对西伯利亚鲟相对 免疫保护率的测定结果见表1。实验结果表明，西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞 菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟抗西伯利亚鲟细菌性败血症致病性嗜水气单胞菌菌株 Sl感染具有良好的免疫保护效果，其对西伯利亚鲟的免疫保护率为50%。表1嗜水气单胞菌菌株Sl微胶囊疫苗对西伯利亚鲟的免疫保护率


本发明公开了一种抗嗜水气单胞菌感染的微胶囊疫苗制备方法。涉及抗细菌性疫苗制备领域。克服了疫苗注射为手段的免疫疗法在鱼类养殖实践操作中费时费力，不利于大规模推广的问题。本发明提供的抗嗜水气单胞菌感染的微胶囊疫苗制备方法,包括以下步骤1)嗜水气单胞菌菌悬液的制备将嗜水气单胞菌接种后制成有效活菌含量为1010个/ml的菌悬液，并用福尔马林灭活，保存；2)嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的制备，将上述步骤制备的菌悬液与5%海藻酸钠溶液以1:1的比例，在漩涡振荡器上混合均匀，进行喷雾干燥处理，得微胶囊颗粒。该方法可用于制备防治鲟鱼，尤其是西伯利亚鲟细菌性败血症的微胶囊疫苗。