专利名称：酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)对人类健康有着举足轻重的作用，近年来已愈来愈受到人们的重视。其特征脂肪酸 DHA(cis-4, 7,10,13,16,19-Docosahexaenoic Acid,二十二碳六稀酸)和 EPA(cis_5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic Acid, 二十碳五稀酸)因具有多种独特的生理功能而备受人们青睐。其中，EPA具有改善血液循环、调节血脂、降血压、软化血管以及抗炎等作用，可用于治疗血栓、心肌梗塞等，被誉为“血管清道夫”;DHA具有营养大脑、促进大脑发育、保护视力、调节免疫以及抗癌等作用，因其容易通过血脑屏障进入大脑，作用于神经系统，因而被誉为“脑黄金”。鉴于DHA对人体健康的重要功能，1991年加拿大政府率先将其列入“营养素推荐量”名单之中。1992年英国提出了 “对健康成人膳食不饱和脂肪酸摄入量”的建议。联合国粮农组织和世界卫生组织也都在膳食指南中明确规定，婴儿配方奶粉中必须含有DHA。人类和多种其他动物自身不能合成n-3PUFA，因而必须通过饮食获取。传统的n-3PUFA的来源主要是深海鱼油，但是大量捕捞导致鱼资源紧缺，食物链的富集作用导致提取的鱼油中含有重金属离子和高胆固醇，并且不同鱼种的油含量以及油中多不饱和脂肪酸的含量差异较大，基于上述弊端，利用微藻发酵生产多不饱和脂肪酸的方法应运而生。与鱼油相比，藻油是从培养的藻类中直接提取，不经食物链的富集，不含任何色素和重金属离子，安全无污染，且为可再生资源，更重要的是其脂肪酸组成较为简单，多不饱和脂肪酸含量一般是鱼油的3-10倍。因此以藻油为多不饱和脂肪酸的来源是安全清洁可靠的。DHA和EPA的天然存在形式为甘油酯型，而对其人为富集的主要形式包括甲乙酯型、游离脂肪酸型和甘油酯型。由于DHA和EPA大多应用于医药和保健品领域，所以人们对甲乙酯型和游离脂肪酸型提出了安全性方面的质疑。甲酯型在制备中使用了有毒的甲醇，因此可能存在甲醇毒性，食用不安全；乙酯型产品不易被胰酯酶水解而难以被人体消化利用，且分解后产生乙醇，一些对乙醇耐受性差的人会引起过敏等不良反应；游离脂肪酸型虽然易于被人体消化和吸收，但其游离形式不稳定，易被氧化分解，给保存和运输带来很大困难，而且其口感不佳，很难作为日常药品和保健品为人们所接受。相比较而言，甘油酯型为其天然存在形式，符合人体消化和吸收机制，安全有效且性状稳定、口感较佳，因此以甘油酯型富集的DHA和EPA是最有效安全的产品形式。目前，有多种方法可将DHA和EPA以不同形式进行富集，主要包括低温结晶法、分子蒸馏法、金属盐沉淀法、银离子络合法、尿素包合法、高效液相色谱法、超临界萃取法和脂肪酶法等。其中，脂肪酶法与其他物理化学法相比具有催化效率高、反应条件温和、能耗低和环境友好等优点而得到广泛重视。尤其，对于多不饱和脂肪酸的富集来说，由于多不饱和脂肪酸所含双键较多，极易在高温高压下氧化分解，产生有害产物，若摄入体内极易导致各种生理异常，所以脂肪酶富集法的优势尤为突出。本发明的全部过程均采用脂肪酶进行催化，最大程度的保护了多不饱和脂肪酸。目前已 公开发表的文章或专利中，酶法富集的工艺主要包括酶促选择性水解、酶促选择性酸解、酶促选择性醇解和酶促酯化合成等。酶促选择性水解工艺较为简单，富集效率不高，n-3PUFA在甘油酯中含量仅能达到50%左右；酶促选择性酸解、酶促选择性醇解法对酶的选择性要求较高，且酶促选择性醇解产物为混合甘油酯；酶促酯化合成反应底物脂肪酸和甘油分散在两相体系中，不利于反应传质；且大多数报道都是富集鱼油多不饱和脂肪酸，如中国专利CN101161819A和CN101348807A都公开了利用鱼油n_3PUFA浓缩物和甘油通过酯化反应富集DHA和EPA。但是，上述两个专利均以鱼油为原料，在整个工艺中都是通过化学法水解制备n-3PUFA浓缩物，化学法反应温度较高，且使用大量的碱作为催化剂，不仅对易氧化的n-3PUFA会有一定的破环，而且产生大量的碱废水等污染物；合成反应都是以甘油和化学法制备得到的n-3PUFA浓缩物为底物进行酯化反应，由于二者是互不相溶的两种底物，所以反应传质方面会受到影响，导致反应时间较长。因此，目前需要研究开发一种原料来源清洁安全，整个工艺全部采用生物酶法，产品中DHA和EPA含量高，反应过程高效灵活，可操作性强的经济高效的酶法制备富含n-3PUFA的甘油酯的制备技术。
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了一种酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法。该方法以微生物藻油为原料，利用脂肪酶的催化特异性，将酶法部分水解和全部水解相结合，分别制得部分水解的甘油酯和游离脂肪酸，后者又通过尿素包合制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，再以部分水解的甘油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物为底物，合成富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯，所制得产物中DHA和EPA的含量显著提高。该方法以微生物藻油作为n-3多不饱和脂肪酸的来源，原料安全清洁、成本低廉，反应过程高效灵活，可操作性强。为实现上述目的，本发明提供了一种酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法，包括步骤A，酶法部分水解藻油，获得的主产物为初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，副产物为游离脂肪酸；步骤B，酶法全部水解藻油，制得游离脂肪酸；步骤C，采用尿素包合法分离游离脂肪酸中的n-3多不饱和脂肪酸，制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物；步骤D，固定化脂肪酶催化合成富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯；其中，步骤D以初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n_3多不饱和脂肪酸浓缩物为底物，以有机溶剂为反应介质，在惰性气体保护及固定化脂肪酶的催化下，进行振荡反应，所获得的反应液经中和、萃取、水洗、过滤、干燥及减压蒸馏制得富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。根据本发明方法，步骤D中所述初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物的摩尔比为I : I 10。所述有机溶剂为Log P(P为有机溶剂在辛醇和水两相体系中的分配系数)不小于3的有机溶剂，其用量为10 15ml/g酸。所述有机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、正壬烷、正癸烷中的一种或多种。所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上制得，其添加量为2500 4000U/g酸。所述固定化载体选自软质聚氨酯海绵、绵绸、微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，优选所述固定化载体为软质聚氨酯海绵。本发明所用单位“U/g酸”中的“酸”是指n-3多不饱和脂肪酸浓缩物。 所述脂肪酶为对多不饱和脂肪酸与部分水解的甘油酯的反应具有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，该脂肪酶依照中国发明专利CN1948470A公开的方法制备，使用批次在10批左右。所述多不饱和脂肪酸与部分水解的甘油酯的反应为酯化和/或转酯化反应。所述固定化脂肪酶，例如，可选自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及Candida sp. 99-125脂肪酶中的一种或多种,优选所述固定化脂肪酶为Candida sp. 99-125固定化脂肪酶，该酶由Candida sp. 99-125脂肪酶固定于软质聚氨酯海绵载体上制成。在步骤D的反应过程中，所述反应的温度为40 50°C，反应的时间为24 96h。进行振荡反应的振荡器转速为200rpm。反应结束后,反应液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并通过无水Na2SO4进行干燥。其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为Na0H、K0H等。在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯与n-3多不饱和脂肪酸浓缩物摩尔比为I : I 10，有机溶剂的用量为10 15ml/g酸，固定化脂肪酶添加量为2500 4000U/g酸；充入氮气作为惰性气体进行密封保护，在40 50°C条件下，以200rpm的转速振荡反应24 96h ;反应结束后，反应液用KOH中和，加入正己烷萃取富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯，水洗至中性，过无水他2304进行干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产品；经气相色谱检测，所制得的产品中DHA含量为60 % 68 %，EPA含量为21 % 27 %，n_3多不饱和脂肪酸总含量不低于80%。根据本发明方法，步骤A将藻油与缓冲液及水解酶混合后，在惰性气体保护条件下进行部分水解反应，反应结束滤除水解酶后，滤液经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗，干燥及减压蒸馏，制得作为主产物的初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得作为副产物的游离脂肪酸，其中，水解反应的水解率控制在40% 60%。根据本发明方法，在步骤A中，所述藻油与缓冲液的质量比为I : O. 6 I。所述水解酶为脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量为600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上制得，所述脂肪酶为对藻油的水解反应有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，该脂肪酶依照中国发明专利CN1948470A公开的方法制备，使用批次在10批左右。所述固定化载体选自软质聚氨酯海绵、绵绸、微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，优选所述固定化载体为软质聚氨酯海绵。所述酶粉，例如，优选为Candida sp. 99-125脂肪酶酶粉。所述固定化脂肪酶，可选自 Novozym435 脂肪酶、Rhizomucormiehei 脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及 Candidasp. 99-125脂肪酶中的一种或多种,优选所述固定化脂肪酶为Candida sp. 99-125固定化脂肪酶。在步骤A的水解反应过程中,所述水解反应的温度为35 50°C。反应结束滤除水解酶后，滤液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。而水化层则用盐酸酸化，然后用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。在根据本发明方法的一个优选实施例中，步骤A将藻油与缓冲液、脂肪酶酶粉及环糊精混合后，在惰性气体保护条件下进行部分水解反应，其中，所述环糊精的加入量为脂肪酶酶粉质量的O. 5 2倍。部分水解反应结束后，滤除脂肪酶酶粉，滤液经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗，干燥及减压蒸馏，制得作为主产物的初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得作为副产物的游离脂肪酸。在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，藻油与缓冲液的质量比为I O. 6 1，脂肪酶酶粉添加量为600 1500U/g藻油，加入脂肪酶酶粉质量O. 5 2倍的环糊精；充入氮气作为惰性气体进行密封保护，在35 50°C条件下进行水解反应，控制水解率在40% 60%，此时部分水解的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸含量最高；反应结束后，抽滤除去脂肪酶酶粉，滤液用KOH中和，加入萃取剂进行萃取，并所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去溶剂制得作为主产物的初步富集了n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯。水化层则经盐酸酸化，加入萃取剂萃取游离脂肪酸，去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去溶剂，获得作为副产物的游离脂肪酸。经气相色谱检测，所获得主产物部分水解的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸含量为DHA 45% 50%，EPA 15 20%，主产物部分水解的甘油酯的得率为86% 92%。根据本发明方法，步骤B将藻油与缓冲液、盐及水解酶混合后，在惰性气体保护条件下进行全部水解反应，水解过程中补加脂肪酸中和剂，反应结束滤除水解酶后，滤液经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗、干燥、减压蒸馏，获得未被水解的藻油甘油酯重新作为原料使用；水化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得游离脂肪酸。经过全部水解反应后，上述水解反应过程中所分离出的萃取液中所含未被水解的藻油甘油酯仅为少量，其得率低于IOwt%。根据本发明方法，在步骤B中，所述藻油与缓冲液的质量比为I : O. 6 I。所述水解酶为脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量为600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化载体上制得，所述脂肪酶为对藻油的水解反应有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，该脂肪酶依照中国发明专利CN1948470A公开的方法制备，使用批次在10批左右。所述固定化载体选自软质聚氨酯海绵、绵绸、微球、纤维、尼龙及大孔树脂等中的一种或多种，优选所述固定化载体为软质聚氨酯海绵。所述酶粉，例如，优选为Candida sp. 99-125脂肪酶酶粉。所述固定化脂肪酶，可选自 Novozym435 脂肪酶、Rhizomucormiehei 脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及 Candidasp. 99-125脂肪酶中的一种或多种,优选所述固定化脂肪酶为Candida sp. 99-125固定化脂肪酶。在步骤B的水解反应过程中，所述水解反应的温度为35 50°C，水解反应的时间为48 96h。所述盐为对酶活有促进作用的金属盐，其包括CaCl2和/或MgCl2，其加入量为5 10mM。优选所述金属盐为CaCl2。所述水解过程中补加脂肪酸中和剂，是在水解率达到20% 30%后，补加一次脂肪酸中和剂，其加入量为藻油量的O. 5wt% I. Owt%。所述脂肪酸中和剂是固体碱，其选自KOH、NaOH及Ca (OH)2中的一种或几种。优选所述固体碱为 Ca(0H)2。反应结束滤除水解酶后，滤液用碱进行中和，用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷，所述碱为NaOH、KOH等。所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。水化层用盐酸酸化，用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，其中，所述萃取剂为正己烷等，所述碱为NaOH、KOH等。 在根据本发明方法的一个优选实施例中，步骤B将藻油与缓冲液、脂肪酶酶粉及环糊精混合后，在惰性气体保护条件下进行全部水解反应，其中，所述环糊精的加入量为脂肪酶酶粉质量的O. 5 2倍。水解过程中补加脂肪酸中和剂，反应结束后，滤除脂肪酶酶粉，滤液经中和，萃取，所分离出的萃取液经水洗、干燥、减压蒸馏，获得未被水解的藻油甘油酯重新作为原料使用；水化层则经酸化，萃取，水洗，干燥及减压蒸馏，获得游离脂肪酸。在本发明的一个具体实施例中，在上述反应过程中，藻油与缓冲液的质量比为I O. 6 1，缓冲液中加入5 IOmM CaCl2，脂肪酶酶粉添加量为600 1500U/g藻油，环糊精添加量为脂肪酶酶粉的O. 5 2倍；充入氮气作为惰性气体进行密封保护，在35 50°C条件下进行水解反应，在水解率达到20% 30%后，补加藻油量O. 5wt% I. 0被％的Ca(OH)2以促进反应平衡向产物方向移动，水解反应总时间为48 96h。反应结束后，抽滤除去脂肪酶酶粉，滤液用KOH中和，加入正己烷萃取，所分离出的萃取液用去离子水洗至中性，过无水Na2SO4进行干燥，经减压蒸馏，所获得未被水解的藻油甘油酯可重新作为水解原料使用；而水化层用2mol/L HCl酸化,然后用正己烧萃取游离脂肪酸，水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到游离脂肪酸。上述水解反应过程的水解率为80% 85%,游离脂肪酸得率为85% 90% ；上述反应过程中，在缓冲液中加入5 IOmM金属盐以及在水解率达到20 30%后加入藻油量O. 5wt% I. Owt%的固体碱，可以将水解率提高5% 10%。本发明步骤A及步骤B中，所用原料为含有n-3多不饱和脂肪酸的微生物藻油，该原料清洁安全，且n-3多不饱和脂肪酸含量较高，其n-3多不饱和脂肪酸含量在20% 60%之间。在本发明步骤A及步骤B中，所述脂肪酶在催化甘油酯水解过程中对甘油酯上的脂肪酰基具有一定的选择性，通过有效控制水解率，可对含有n-3多不饱和脂肪酸的藻油进行部分水解和全部水解，部分水解后的甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸的含量得到一定程度的提闻。本发明中，步骤A中催化藻油部分水解所采用的脂肪酶及步骤B中催化藻油全部水解所采用的脂肪酶，与步骤D中催化多不饱和脂肪酸与部分水解的甘油酯进行酯化和/或转酯化反应的脂肪酶可以是不同种脂肪酶，也可以是同种脂肪酶，优选为同种脂肪酶，以简化操作，便于控制。根据本发明方法，步骤C在惰性气体保护条件下，将游离脂肪酸与尿素和醇类溶剂共混后，进行静置包合，包合结束后滤除尿素包合物，滤液经酸化、萃取、水洗、干燥及减压蒸馏，制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物。根据本发明，在步骤C中，所述游离脂肪酸与尿素和醇类溶剂共混，是在尿素与醇类溶剂混合形成澄清透明溶液后，再加入60°C下预热的游离脂肪酸进行共混。所述脂肪酸尿素醇类溶剂为I : 2 4 : 5 10 (w/w/v)。所述醇类溶剂为甲醇和/或乙醇，优选所述醇类溶剂为乙醇。所述共混的温度为60 80°C，共混的时间为60 90min。所述包合的温度为O 4°C,包合的时间为16 20h。包合结束后，滤除尿素包合物,滤液用盐酸酸化，然后用萃取剂进行萃取，用去离子水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥。在本发明的一个具体的实施例中，在上述反应过程中，按照脂肪酸尿素乙醇为I : 2 4 : 5 10(w/w/V)的比例将步骤A及步骤B中藻油水解后得到的游离脂肪酸与尿素和乙醇共混；先在尿素与乙醇混合形成澄清透明溶液后，充入氮气作为惰性气体进行保护，并加入60°C下预热的游离脂肪酸进行共混，然后在60 80°C条件下共混60 90min,然后在O 4°C条件下静置包合16 20h ;包合结束后，抽滤除去尿素包合物,将富含脂肪酸乙酯的滤液用2mol/L的HCl酸化，然后用正己烷萃取，水洗至中性，并过无水Na2SO4进行干燥，减压蒸馏后制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物。其中，DHA含量为68% 73%，EPA含量为20% 25%，n-3多不饱和脂肪酸浓缩物收率为85% 90%。本发明中，将所制得富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯产品，以及反应过程中所获得的产物，包括初步富集了 n-3多不饱和脂肪酸的部分水解的甘油酯、游离脂肪酸以及n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，分别进行甲酯化后，并采用气相色谱仪(GC2010，日本岛津)检测其DHA和EPA的含量。水解反应过程中，水解率采用碱滴定法进行测定，并按照下列公式进行计算本发明涉及一种酶法制备富含藻油n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的方法。该方法以微生物藻油为原料，在脂肪酶催化下，通过控制水解率分别将藻油进行部分及全部水解，制得部分水解的甘油酯和游离脂肪酸；后者通过尿素包合法富集n-3多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，制得n-3多不饱和脂肪酸浓缩物；然后以n-3多不饱和脂肪酸浓缩物和部分水解的甘油酯为底物，以固定化脂肪酶为催化剂，在有机相中高效合成富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯。本发明采用全生物酶法富集工艺，原料清洁安全，工艺路线科学合理，酶催化活性高，催化剂可循环利用，成本低廉，反应条件温和，能耗低，环境友好，市场前景广阔。