专利名称：文心兰离体叶片诱导体胚的方法文心兰i/hcidiuni flexuosum Lodd),又名舞女兰、瘤瓣兰，为兰科 (flrcAii/aceae)瘤瓣兰属iXhcidiwn 5k )植物，是世界花卉业重要的盆花和切花种类之 一。文心兰无论属内杂交还是属间杂交，其亲和力都较差、授粉结实机率低，通过杂交培育 新品种难度大、周期长，采用新技术新方法获得文心兰新品种将是未来文心兰育种的重要 途径。能生成单细胞体胚的叶片是上佳的育种材料和转基因受体材料。Chen and Chang 首先报道了文心兰(Oncidium Gower Ramsey)离体叶片在添加TDZ的改良1/2MS培养基 上诱导出了直接体胚，这些体胚能形成原球茎，进而发育成正常的植株(Chen and Chang, Plant Cell Rep, 1999，19: 143-149)。文心兰离体叶片的叶尖、叶面、叶背、叶缘、叶切口 均能形成体胚，培养基的成分和植物生长调节剂以及品种差异对文心兰离体叶片诱导体胚 有很大影响(Su, Chen and Chang. Biologia Plantarum，2006，50 (1):107_110)。建立高 效稳定的叶片体胚诱导及再生体系是开展文心兰生物技术育种工作的关键步骤之一。
采用目前的组织培养体系，文心兰离体叶片的叶尖、叶面、叶缘、叶中切口、叶基部 切口均能形成体胚，这些体胚能迅速增殖并形成原球茎，与其他外植体获得的原球茎没有 差异，最终能成为正常植株。文心兰离体叶片诱导生成的体胚，源自叶片表皮或叶肉单一细 胞，非常适合应用于育种领域，如多倍体育种、转基因育种等。但文心兰离体叶片体胚诱导 率较低，一般不超过30%，且诱导率很不稳定，本发明主要通过选择适宜的叶片外植体、优化 培养条件来提高文心兰离体叶片体胚诱导率和稳定性，使文心兰离体叶片的体胚诱导率保 持在90%以上，为文心兰育种提供了大量源于叶片的胚性单细胞，这些能形成体胚-类原球 茎并可获得再生植株的胚性单细胞是转基因育种工程的最佳受体细胞。本发明的具体描述如下(1)通过组织培养可获得大量的无菌文心兰幼苗，这些幼苗起初往往是丛生的，按其形 态发育特性可分为无根幼苗和带根幼苗，尽管无根幼苗和带根幼苗剪下的叶片都能生成体 胚，但无根苗和带根苗的生理状态是有差异的，带根幼苗离体叶片的体胚诱导率是无根的 2-3倍，选择带根幼苗作为外植体供体能显著提高文心离体叶片体胚诱导率。(2)文心兰无菌试管苗中的幼叶处于最初的生长阶段，其叶片的长短与生长时间 呈正相关，叶片的长短在一定程度上显示了叶龄和苗龄。实验表明叶片长度对体胚诱导率有显著影响，小于10毫米的叶片体胚诱导率低于15%，长度为25-30毫米的叶片体胚诱导率 为30%，当叶片长度大于30毫米时，叶片体胚诱导率仅为12%，当叶片长度为12-22毫米，叶 片体胚诱导率超过90%。选择适宜的叶片长度，对于维持较高的体胚诱导率至关重要，文心 兰离体叶片最适宜的尺寸是15毫米-22毫米，文心兰无菌幼苗的长度最好在15毫米-25 毫米范围(不计根的长度)。(3)植物生长调节剂是影响文心兰离体叶片体胚诱导的关键因子之一。噻苯隆 (TDZ)、6-苄基腺嘌呤和细胞激动素具有强烈促进细胞分裂的作用，三种植物生长调节剂 单独使用时，对文心兰离体叶片体胚诱导均具有强烈的促进效果，其中TDZ的效果要好于 6_苄基腺嘌呤和细胞激动素；通常三种植物生长调节剂使用的浓度范围分别是TDZ 0. 1毫 克-3毫克/升，6-苄基腺嘌呤0. 5毫克-3毫克/升，细胞激动素0. 5毫克-3毫克/升。 TDZ),6-苄基腺嘌呤和细胞激动素的组合使用能有效促进文心兰离体叶片体胚诱导率。较 好的组合是以TDZ为主，再添加适量的6-苄基腺嘌呤或细胞激动素。比较适宜的植物生长 调节剂添加方案是TDZ0. 3毫克-0. 5毫克/升+ 6-苄基腺嘌呤0. 5毫克-1. 0毫克/升。(4)在文心兰组织培养过程中，文心兰离体叶片的褐化尤其是从叶片的切口处出 现的褐化现象是严重影响体胚诱导率的关键因素之一。褐化通常是在叶片离体培养10天 左右出现，最初发生的部位是叶基部切口和叶片中切口边缘，颜色由淡褐色逐渐加深至深 褐色或黑色，叶片一旦出现褐化，基本上无法诱导形成体胚。文心兰离体叶片培养过程中出 现的褐化与常规植物组织培养中出现的褐化现象相类似，是由植物细胞中酚类化合物被氧 化产生褐色的酚醌类化合物。在培养基中添加活性碳和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)能有效 控制文心兰离体叶片褐化的发生。两者添加浓度范围均为100毫克-1000毫克/升，较合 适的组合是活性碳100毫克-200毫克/升，PVPP 100毫克-300毫克/升。(5)在文心兰离体叶片培养时，铁盐的浓度对离体叶片和叶片切口的褐化有较大 影响。适度降低培养基中铁离子的浓度，对减少文心兰离体叶片的褐化率和减轻褐化程度 有较好效果。二价铁盐在培养基中的浓度范围是5毫克-20毫克/升，比较适合的铁盐浓 度是10毫克-15毫克/升。(6)文心兰离体叶片的叶尖、叶面、叶背、叶缘、叶切口均能形成体胚，在一般情况 下，叶尖是最易形成体胚的部位(Chen and Chang, Plant Cell, 2002,69 41-44)。当我们 需要提高文心兰离体叶片切口(伤口)的体胚诱导率时，可选择以下2种方法(根据需要2 种方法可同时使用)1)剪去离体叶片的叶尖(1-3毫米)或在叶片中部剪一宽度为叶片宽 1/2的口子，以增加切口的长度和面积，提高体胚诱导率。但要注意控制切口长度与叶面积 的比率，不能使叶片受伤过度；2)适当提高TDZ的浓度。在较低浓度下(TDZ0. 1毫克/升一 TDZ0. 3毫克/升)，离体叶片叶尖就具有较高的体胚诱导率，将TDZ增加到0. 5毫克/升，可 显著增加离体叶片切口的体胚诱导率。文心兰“百万金币”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球茎转入培养基(MS基本培养基 添加磷酸二氢钠170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，琼脂7，000毫克/升，ρΗ5· 5)，培养温度24-26°C，光照时间16h/d，光照强度为1200_16001x。每隔60天换一 次培养基，选取15毫米-25毫米长的带根幼苗作为外植体供体。叶片处理 将叶片从基部剪下，在叶片中间剪一宽度约为一半叶宽的口子，近轴 面朝上置于培养基上，每一培养皿(直径90毫米)中放入8-12片叶片。体胚诱导培养基基本培养基为1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 养基(其中微量元素和有机添加物为全量，铁盐减半)，其他添加物为磷酸二氢钠170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 30毫克/升，6-苄基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP300毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C灭菌15分钟。培养条件暗培养，培养温度24-26 °C。培养60天后，绝大多数文心兰离体叶片生成体胚，转入光照培养(温度24-26°C， 光照时间16h/d，光照强度为1200-16001x) 20-30天，此时体胚发育成原球茎，即可转入文 心兰常规组织培养体系，获得再生植株。实施例2文心兰“百万金币”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球茎转入培养基(MS基本培养基 添加磷酸二氢钠170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，琼脂7，000毫克/ 升，ρΗ5· 5)，培养温度24-26°C，光照时间16h/d，光照强度为1200_16001x。每隔60天换一 次培养基，选取15毫米-25毫米长的带根幼苗作为外植体供体。叶片处理 将叶片从基部剪下，剪去叶片顶端约1-3毫米，近轴面朝上置于培养 基上，每一培养皿(直径90毫米)中放入8-12片叶片。体胚诱导培养基基本培养基为1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 养基(其中微量元素和有机添加物为全量，铁盐减半)，其他添加物为磷酸二氢钠170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 50毫克/升，6-苄基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP500毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C灭菌15分钟。培养条件暗培养，培养温度24_26°C。
培养60天后，绝大多数文心兰离体叶片切口处生成体胚，转入光照培养(温度 24-26°C，光照时间16h/d，光照强度为1200-16001x) 20-30天，此时体胚发育成原球茎，即 可转入文心兰常规组织培养体系，获得再生植株。


本发明公开了从文心兰离体叶片诱导体胚并最终获得再生植株的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。本发明以文心兰(Oncidiumflexuosum)“百万金币”无菌苗叶片为外植体，培养基为添加TDZ、6-苄基腺嘌呤和细胞激动素的改良1/2MS培养基，24-26℃暗培养50-60天，90%以上的叶片能诱导生成体胚，体胚发生的位置在叶尖、叶切口、叶面和叶缘，这些体胚均能进一步发育成类原球茎(PLBs)，最终获得正常的再生植株。采用本发明建立的文心兰离体叶片-体胚-植株再生体系，为文心兰育种提供了大量源于叶片的胚性单细胞，这些能形成体胚-类原球茎并可获得再生植株的胚性单细胞是转基因育种工程的最佳受体细胞。