奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法

刘永祥, 孔祥辉, 孙艺萍, 李敏, 杨定兴, 杨秀兰, 王冬冬, 王鋮

2011年12月28日

2010年11月17日

2010年11月17日

赤峰博恩药业有限公司

A61P15/14GK102294026SQ20101054703

炎灭 活疫苗 链球菌 奶牛 乳房 制备

1. 一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，其特征是(1)通过对奶牛乳腺炎奶汁样品的分离、鉴定，确定奶牛链球菌流行优势株为无乳、停乳、乳房血清型，制备优势流行菌株兔血清与已有国内外代表奶牛链球菌乳房炎菌株免疫交叉中和活性达95%以上，由此选用的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌优势疫苗株具有代表国内外奶牛乳房炎流行菌株；在方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括适宜于制备奶牛乳房炎链球菌疫苗生产的当前和今后广泛流行野生株或突变株；(2)选用奶牛链球菌乳房炎无乳、停乳、乳房血清型优势疫苗株，通过培养传代、建立了奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、 基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛无乳、停乳、乳房等血清型链球菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产要求；在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的链球菌野生株或突变株，均可建立疫苗株种子批库用于疫苗生产；(3)通过奶牛乳房炎菌无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌苗工作种子批株，从IOL到 1000L发酵放大培养，制备了无乳、停乳、乳房等血清型奶牛链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化常规方法提取制备了纯化无乳、停乳、乳房血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95% ；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗原液；进一步血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定，由此规模化制备的疫苗抗原可以产业化生产在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株、 BHI培养基用于疫苗原液规模化生产；也包括适用于当前和今后广泛流行的候选链球菌新优势菌株及THB等培养基介质；(4)纯化的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子；依I^r-L-Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛链球菌荚膜多糖， L是共价键、或连接基团，且I^s ft·的质量比为0.5-3. 5 1 ；先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联；制备出奶牛链球菌奶牛乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85%以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白；在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、 CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行链球菌野生株株、突变株荚膜多糖及其他载体蛋白；(5)制备的有效剂量纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活全菌(比如 1 10X IOltlCFU)、全菌(比如1 10X IOltlCFU) +荚膜多糖(比如10 60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)分别与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59、SPOl和SP02疫苗佐剂混均勻，制备奶牛链球菌乳房炎灭活全菌、 全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，间隔观天，皮下或肌肉或乳头管免疫2次，末次免疫14天采集血清、奶汁、脾淋巴细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、排细菌计数及ELISA、ELISP0T测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况；试验结果可见，这几种佐剂可提升奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗产生高效价抗体滴度、依次是白花油、不完全弗氏、SPO1、MF59和铝盐佐剂，而SPO1、SP02还产生了细胞免疫和黏膜免疫效应，且在不同动物呈现一致性趋势；由此SP01、SP01、MF59、白花油、 不完全弗氏和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎灭活疫苗的佐剂；在本方法中，包括但不限于3 01、5 02、1^59、白花油4认和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛链球菌灭活疫苗的制备；包括适用于免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂制备奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗；(6)本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、 MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，以有效剂量制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价(无乳、停乳、乳房血清型)菌体(比如1 IOXIOiciCFU)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、二价、三价、多价(无乳、停乳、乳房等血清型)菌体 (比如1 IOX IOltlCFU) +荚膜多糖(比如10 60Ug)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价荚膜多糖结合蛋白(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT 或CRM197)疫苗注射剂型2.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗注射剂型可皮下注射，也可以肌肉注射、乳头管注射、微针透皮免疫， 也可以一种或几种联合，制备有或无佐剂的奶牛链球菌不同剂量灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，观察过敏性反应、异常毒性、热源质反应、一般毒性结果表明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品接种动物是安全的3.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、、二价、三价、多价有效剂量的灭活全菌疫苗、 全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、家兔和奶牛动物，通过量效、时效、次效测定抗体和细胞免疫水平以评价免疫原性；进一步在2-3岁即将进入泌乳期 (即产前25d，怀孕8个月20d)健康奶牛，免疫剂量是灭活全菌疫苗(比如5 X IOltlCFU)、灭活全菌+荚膜多糖(比如5X 101QCFU+50UgCPS)、荚膜多糖结合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT 或DT或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，末次免疫后14天用1000CFU混合无乳、停乳、乳房链球菌野生菌株乳头管内注射攻毒，通过临床症状红肿热痛、体温、体重、奶汁产量质量、体细胞数、排细菌数、进食和死亡等指标评价免疫保护率结果显示，制备的不管是皮下注射或是以肌肉或是乳头管注射、不管是单价或是、二价、三价、多价、不管是有佐剂或是无佐剂奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗都有产生高效价抗体滴度，与剂量呈相关，且5X 101(lCFU、50UgCPS、20Ug TT或DT或CRM197达到平台期，加佐剂优于无佐剂组，多价好于单价，荚膜多糖好于灭活全菌疫苗类型，在不同动物有一致免疫应答趋势，加荚膜多糖可提高免疫保护率，在奶牛体内免疫保护率达到75%以上，可有效用于奶牛乳房炎的免疫预防4.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗制品，分别置于4°C、室温(20-2幻°〇和371，从外观、pH、蛋白含量、动物免疫原性等指标观察疫苗稳定性；结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品放置2 8°C稳定性良好，有效期2年

本发明涉及一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗，特别是一种含奶牛无乳、停乳和乳房血清型链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗及其制备方法，用于链球菌感染性奶牛乳房炎的免疫预防，属于生物制药领域

下面参考实施例对本发明作进一步说明给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法实施例1 筛选并确定奶牛链球菌乳房炎优势流行菌株从覆盖我国东西南北中的内蒙古、重庆、广州、黑龙江、兰州、河北、山东等30个省市地90个中大型奶牛场收集近3万份临床牛乳房炎奶汁样品，分离检定、筛选并确定奶牛链球菌感染乳房炎优势菌株；1.奶牛乳样的采集选取出现临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头采样者同时进行手指擦拭消毒每个乳室先挤去头2 3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样至少 5mL于无菌乳样杯中，待检2.奶牛乳房炎链球菌的分离培养将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链球菌；进一步将乳样摇勻，分别取适量接种于营养肉汤 (10%血清)、BHI培养基、THB培养基、TSB培养基、普通琼脂平板、TSA平板、鲜血琼脂平板、 麦康凯琼脂平板后，置于37°C温箱培养M 48h观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现普通琼脂平板上，37°C，M 7 培养后，未见到菌落鲜血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑圆形隆起的小菌落，出现溶血现象，如果是β溶血则疑为无乳链球菌， 如果为α溶血，疑为停乳链球菌或者乳房链球菌，如为Y溶血，则疑为乳房链球菌；血清肉汤中生长初呈均勻浑浊，管底出现絮状沉淀，上清变得透明挑取典型菌落涂片、染色、镜检，镜检如呈球状，短链状或者长链状排列，无芽胞，革兰氏染色阳性则疑为链球菌3.生化鉴定镜检形态符合链球菌特性，且触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌若细菌CAMP试验阳性，水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖、水杨甘，不能利用山梨醇、海藻糖和甘露醇七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖、海藻糖，不能利用山梨醇、水杨甘和甘露醇七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖，不能利用山梨醇和甘露醇七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为乳房链球菌4.血清型鉴定，将鉴定好的链球菌用标准奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌血清型(ATCC购买)进行玻片凝集试验结果显示，分离、筛选的无乳、停乳、乳房型链球菌与同型标准血清出现特异性凝集反应阳性，且各血清型交叉凝集反应阴性由此，从现场分离具有代表中国流行株的无乳、停乳、乳房型链球菌作为疫苗候选株5.酶切质粒图谱分析将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株提取质粒DNA，质粒DNA大小及酶切片断符合奶牛乳房炎链球菌各血清型特征5. SDS分析菌体蛋白组分将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株进行SDS-PAGE，可见呈沈-30余条大小不等蛋白条带，进一步免疫印迹符合奶牛乳房炎链球菌各血清型蛋白条带特征6.致病性分析将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株培养传代，分离纯化各血清型链球菌菌株分别注入6-18周BALB/c鼠腹腔注射2 X IO8个活菌、1. 5-2岁家兔腹腔注射8 X IO8个活菌、2-3岁奶牛乳管注射1000个活菌，可使动物发病， 甚至在1周内死亡对奶牛观察产奶量与质量、体温、体重、体细胞数、排细菌数等对接种后发病、死亡动物肝脏、奶牛乳房进行病原菌重分离进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株为无乳、停乳和乳房血清型奶牛链球菌乳房炎主要的致病菌以上通过选择性培养基上分离与筛选、生化鉴定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛动物的致病性等评价，确定了无乳、停乳、乳房三个血清型链球菌为我国流行优势株，占奶牛乳房炎链球菌株的92%，为候选奶牛链球菌乳房炎优势疫苗株提供了依据实施例2 制备奶牛链球菌乳房炎优势疫苗菌株免疫血清及确定疫苗菌株从确定具有代表性的无乳、停乳、乳房血清型链球菌流行优势株，制备无乳、停乳和乳房主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株抗原，分别用5X107CFU/lml剂量皮下免疫家兔 (链球菌抗原及抗体阴性)一次，免疫后14天心脏放血，血清抗体效价达到1 1200以上，再分别与临床病例分离奶牛链球菌乳房炎毒株、购买美国ATCC和中国菌种库主要奶牛乳房炎标准株进行免疫中和试验，免疫中和交叉率达97%，由此确定所选用的无乳、停乳、乳房型奶牛链球菌乳房炎血清型优势疫苗株具有广泛的国内外代表性实施例3 建立奶牛链球菌乳房炎疫苗株三级种子批库及检定从确定具有代表奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌流行优势株，分别接种于BHI 培养基中，37 °C培养M小时，收取菌液，建立三级种子批库及全面检定1.原始种子批的建立选取奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌流行优势株菌落划线接种5%绵羊血琼脂培养基上培养，置37°C培养20-24小时培养，用脱脂牛奶冲下，第二代作为原始种子批库，加入5%脱脂奶粉分装于冻存管，冻干后-70°C以下长期保存2.主种子批的建立取第二代无乳、停乳、乳房奶牛链球菌乳房炎原始种子批菌株接种于BHI培养基，37°C培养20-M小时，第三代作为主种子批库，加入5%脱脂奶粉分装于冻存管，冻干后-70°C以下长期保存3.工作种子批的建立取第三代无乳、停乳、乳房奶牛链球菌乳房炎原始种子批菌株接种于BHI培养基，37°C培养M小时，第四代作为主种子批库，加入50%的甘油分装于培养瓶内，-70°C保存4.三级种子批的检定通过对奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌疫苗菌株原始种子批、主种子批、工作种子批菌株以及传代30代菌株的外观、血清型别、PH值、 溶解时间、菌落变异率、形态与染色、菌株质粒图谱、荚膜多糖、菌株毒性和免疫原性进行了全面检定结果显示，建立的奶牛无乳、停乳、乳房血清型链球菌乳房炎疫苗三级种子批库安全、稳定，符合疫苗生产的要求实施例4 规模化发酵培养奶牛乳房炎链球菌原液及灭活取奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗工作种子批库菌株，接种于IOL细菌培养罐的BHI培养基中，37°C培养Mh ；然后转接于1000L发酵罐中进行培养，37°C培养约 20h,收获菌液，取样作纯检并计算菌数；随后加入终浓度为0. 4 %的甲醛溶液，37 V，转速 150rpm，灭活36-4他取样品连传三代无细菌生长，用无热源的PBS洗菌三次，每次4°C， 6500rpm离心15min，沉淀用于制备灭活全菌疫苗抗原，上清液用于制备荚膜多糖疫苗抗原实施例5 纯化奶牛乳房炎链球菌灭活全菌、荚膜多糖及检定1.制备灭活全菌抗原取规模化发酵培养的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗灭活全菌，用PBS洗涤2次，每次4°C，6500rpm离心15min，要沉淀，用PBS溶解，测定含量，冻干或液体为纯化的灭活全菌疫苗抗原2.粗提荚膜多糖抗原取规模化发酵培养的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗发酵上清液，加入终浓度为的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，连续搅拌后4°C静置过夜，lOOOOrpm/min离心收沉淀为复合多糖将复合多糖溶入2M氯化钙溶液，使十六烷基三甲基溴化铵与多糖解离，加入终浓度为25%的乙醇，4°C静置池或过夜，5000rpm，4°C离心30min去核酸沉淀收集澄清的上清液，中加入冷却的终浓度为80%的乙醇，4°C静置池或过夜沉淀多糖，10000rpm，4°C离心15min，收集沉淀为粗糖，用无水乙醇及丙酮各洗2次， 干燥，即为多糖粗制品，保存于_20°C以下备用3.纯化荚膜多糖抗原将荚膜多糖粗制品溶解于10%饱和中性乙酸钠中，按1 2容量用冷酚提取2-4次，10000rpm，4°C离心20min，收集上清液，用0. IM氯化钙溶液透析过夜，再加无水乙醇至终浓度为75%，充分振摇，4°C静置池或过夜沉淀多糖，IOOOOrpm, 4°C离心20min，收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次，测含量，冻干或液体即得纯化荚膜多糖抗原4.荚膜多糖抗原的鉴定纯化的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原通过核酸、蛋白、总氮、总磷、分子大小、纯度、糖醛酸、氨基己糖和甲基戊糖等指标检测结果显示，制备的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原纯度达到95% 以上，呈各血清型荚膜多糖成分实施例6 制备奶牛乳房炎链球菌荚膜多糖结合蛋白抗原及检定将纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌荚膜多糖加入溴化氢(多糖与溴化氢的重量比例为1 0. 活化，再加入己二酰井处理，衍化率为1-3%再加入TT或DT蛋白或CRM197和碳二亚胺(19. 17mg/ml)，反应得到链球菌荚膜多糖与TT或DT蛋白或CRM197 的化学共价偶联物采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将荚膜多糖结合蛋白抗原，悬浮于lOOmMTris，pH8. 6缓冲液中，再经过分子筛柱层析进行分离，去除未结合的蛋白，分离后的溶液除菌过滤后，即为荚膜多糖结合TT或DT或CRM197蛋白抗原通过高压液相纯度、外源因子测定，结果显示荚膜多糖结合蛋白纯度达95%、偶联率达88%，呈单一结合物成分，无外源因子实施例7 制备奶牛链球菌乳房炎三价灭活疫苗及检定1.奶牛链球菌乳房炎三价灭活全菌疫苗①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原不加佐剂，配制lXKTCFU/lmljXK^CFU/Sml无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制ι χ 1010CFU/0. 5mg (铝盐)/lml、5 X 1010CFU/2. 5mg (铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入等量 SPOl佐剂0%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐剂0%角鲨烯、0. 1% 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，分别配制lX101(lCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X10lcl+2. 5ml SPOl (或 SP02CFU)/5ml 有 SPOl 或 SP02 佐剂注射剂型； ④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入等量白花油或FIA 佐剂混勻油包水样，分别配制1X101qCFU+0. 5ml白花油(或FIA)/lml、5X 10lclCFU/+2. 5ml 白花油(或FIA) /5ml有白花油或FIA佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、肌肉、奶头乳管注射免疫接种剂型，放2-8 °C备用2.奶牛链球菌乳房炎三价灭活(全菌+荚膜多糖)疫苗①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原不加佐剂，配制 1 X 1010CFU+20ugCPs/Iml、5 X 10lclCFU+50ugCPs/5ml无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制 1 X 10lclCFU+20ugCPs/0. 5mg(铝盐)/lml、5X 10lclCFU+60ugCPs/2. 5mg(铝盐)/5ml 有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入等量SPOl佐剂角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)、SP02 佐剂角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，配制 1 X 10lclCFU+20ugCPs+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X 10lclCFU+60ugCPs+2· 5ml SPOl (或 SP02)/5ml有SPOl或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入等量白花油或FIA佐剂混勻油包水样，分别配制 1 X 10lclCFU+20ugCPs+0. 5ml 白花油(或 FIA)/lml、5X 10lclCFU+50ugCPs+2. 5ml 白花油(或 FIA)/5ml有白花油或FIA佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、肌肉、奶头乳管注射免疫接种剂型，放2-8 °C备用3.奶牛链球菌乳房炎三价荚膜多糖结合蛋白疫苗①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原不加佐剂，配制 20ugCPs+10ugTT(或 DT 或 CRM197)/lml、50ugCPs+20ugTT(或 DT 或 CRM197)/5ml 无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制20ugCPs+10ugTT (或DT或CRM197)/0. 5mg (铝盐)/lml、50ugCPs+20ugTT (或DT或CRM197) /2. 5mg (铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③ 将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白抗原加入等量SPOl 佐剂角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐剂角鲨烯、0. 1%聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，配制20ugCPs+10ugTT (或DT或 CRM197)+0. 5mlSP01(或 SP02 或 CRM197)/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)+2. 5ml SPOl (或SP02)/5ml有SPOl或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活荚膜多糖结合蛋白抗原加入等量白花油或FIA佐剂混勻油包水样，分别配制 20ugCPs+10ugTT (或 DT 或 CRM197)+0. 5ml 白花油或 FIA/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT或CRM197)+2. 5ml白花油或FIA/5ml有白花油佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、 肌肉、乳头管注射免疫接种剂型，放2-8 V备用4.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗有佐剂或无佐剂剂型进行安全性评价 结果可见，奶牛链球菌乳房炎三价灭活疫苗外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过染色和镜检无杂菌污染、热源质检测在范围内； 通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在1600以上实施例8 本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在动物体内的免疫效果评价1.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗加入或不加入相应佐剂，制备的皮下、肌肉、乳管注射剂型，并用PBS、铝盐、SPOU SP02、白花油、FIA、细菌鞭毛为对照组，分别免疫6_8周Balb/ C小鼠、18月家兔，每组10只，其免疫剂量按实施例7疫苗低剂量组(抗原1X101(ICFU、 1 X 10lclCFU+20ugCPs/lml、20ugCPs+10ugTT (或 DT 或 CRM197)/lml，免疫两次(0，沘天)；末次免疫后14天将各组小鼠、家兔取血、分离血清和免疫细胞及通过ELISA法测定血清、乳汁抗体效价都在1 3200以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1 1600以上，采用流式细胞仪、ELISP0T仪测定免疫细胞与血清中重要细胞因子、炎性分子、趋化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Thl应答平衡，采用ELISA法测定乳汁slgA抗体效价都在1 100以上这说明制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产生双重免疫应答；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂型，乳管内注射的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价荚膜多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗，且与后者无显著差异；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价灭活疫苗免疫应答效力优于单价灭活疫苗；由此制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在小鼠、家兔体内具有好的免疫应答效果；加佐剂优于无佐剂组，SPOl或SP02佐剂整体优于铝盐、白花油和FIA佐剂组，且在不同动物有一致免疫应答趋势由此，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在小鼠、家兔体内有很好的免疫原性2.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗加入或不加入相应佐剂制备的皮下、 肌肉、乳管注射疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SPOU SP02、白花油、IFA、细菌鞭毛为对照组，分别按皮下、肌肉、乳管注射途径选择2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d) 健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶牛，每组10头；免疫剂量在(抗原5X101(ICFU、 5X 10lclCFU+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)/5ml，免疫程序是 0，沘，56 天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)；末次免疫后14天取血、分离血清和免疫细胞，采集、乳汁；通过ELISA法测定血清、乳汁抗体效价都在1 1600以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1 1观00以上这说明制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出试验组有佐剂优于无佐剂组、 高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产生双重免疫应答；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂型，乳管内注射的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价荚膜多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗，且与后者无显著差异；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价灭活疫苗免疫应答效力优于单价灭活疫苗；由此制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内具有好的免疫应答效果；加佐剂优于无佐剂组，SPOU SP02佐剂整体优于铝盐、白花油、IFA佐剂组，且与剂量呈正相关免疫应答趋势依上末次免疫14天后，用临床分离无乳、停乳、乳房链球菌野毒株进行攻毒，通过导管奶头注射将1000CFU链球菌注入乳腺乳区攻毒后观测临床症状(发烧、乳腺肿胀)， 奶样质量(血奶、异常块、奶量减少)及进食情况(进食减少)，通过奶样细菌学检测、体细胞计数SCC和血清抗体ELISA分析指标评价保护率试验结果显示，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内有良好的保护率，有荚膜多糖高于无荚膜多糖保护率，加佐剂组高于不加佐剂组保护率，保护率达到75%以上实施例9 本发明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内的长效免疫保护评价将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗皮下注射2-3岁即将进入泌乳期(即产前 25d，怀孕8个月20d)健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶牛，每组20头；免疫剂量在 (抗原 5 X IO10CFU, 5 X 10lclCFU+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197) /5ml，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，第二年后加强免疫1次， 观察1083天，其间每隔3个月取血、奶汁，观察奶牛产奶量与质量、体细胞计数、细菌计数及通过ELISA、ELISP0T测定抗体效价、细胞免疫的长效免疫应答及保护效果试验结果显示，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗具有长效免疫应答和免疫保护，第一年免疫3次后， 以后每年加强免疫一次，其保护率达到78%实施例10 本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗安全性试验1、无菌、支原体试验将实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25°C、35°C结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗未见细菌生长将奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗分别用半流体和肉汤培养基，37°C初代培养21天，次代培养21天， 无菌生理盐水做阴性对照，结果显示奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无支原体生长结果显示， 奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无支原体生长2、溶血性试验选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3 次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍PBS稀释奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗(由实施例7 制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象说明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗中的成分不能使红细胞裂解因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无溶血反应3、急性毒性试验取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗0. 5ml腹腔注射体重为12 18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变在体重为8 IOkg的Beagle狗体内的急性毒性结果取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗肌肉注射15ML，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化 结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无急性毒性反应，使用是安全的4、过敏试验研究取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗皮下接种体重为 250 350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次第 3次注射后21天，耳静脉给予相同奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在动物体内无过敏反应5、兔热源质试验取预检合格的体重为2 3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0. 2°C，各家兔2次平均温度在 38. 6-39. 5°C将实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗预热至38°C，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉缓缓注入0. 5ml/只注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次结果显示奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗给予家兔个体升温未超过0. 2°C，3只家兔升温总和未超过0. 40C，没有引起家兔的发热反应因此，制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无热源质