专利名称：一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗及其制备方法2010年以来，我国部分地区饲养的蛋鸭和种鸭，发生了一种新型流行性疾病，该疾病以突发性产蛋下降为主要特点，主要导致卵泡变形、变性，卵泡膜充血、出血，输卵管炎性病变，暂将该流行性疾病称为鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0) 0我们在某大型鸭场的发病种鸭上分离到一株病毒，经初步鉴定该病毒为有囊膜的RNA病毒， RT-PCR鉴定黄病毒阳性，暂将该病毒称为鸭黄病毒(Duck Flavivirus)。由于对该新型流行疾病无特效治疗方法，疫苗的研制开发是控制该疾病的首选措施。
本发明的目的在于利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用病毒株，通过使用6 14日龄的鸡胚或6 14日龄的鸭胚或Vero细胞或 CEF细胞或BHK细胞或H(15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，再经过灭活、配苗等步骤， 制备出一种安全、有效的新型鸭病疫苗——鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。1.疫苗生产用病毒株(1)病毒来源疫苗制造及检验用毒种为鸭黄病毒(Duck FlaViVirus)WFG36株，由本发明人从山东地区某养殖场的种鸭体内分离得到，并进行鉴定、保管和供应。该病毒株已于2011年4 月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为=CGMCC No. 4718。(2)病毒株特性1)病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_2、10_3、10_4 3个稀释度分别经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，0. Iml/胚，置37°C继续孵育，M小时之内死亡胚弃去不计， M小时之后死亡鸡胚随时取出，置于4°C保存，观察至168小时，根据鸡胚死亡数计算ELD5tl， 每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500幻对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，卵黄囊接种7日龄易感鸡胚10枚，0. Iml/ 胚，置37°C继续孵育，鸡胚应于接种后M 168小时死亡8枚以上，死亡胎儿出现全身性出血。3)免疫原性将毒种经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚，收获感染胚液和胚体，胚体加生理盐水研磨后，与胚液混合，经甲醛溶液灭活后，按1 2(水相油相)的比例制成油乳剂灭活疫田ο取10只7 10日龄健康易感雏鸭，平均分为两组，5只作为试验组，5只作为空白对照组，试验组每只颈背皮下注射疫苗0. 5ml，接种后21天，用鸭黄病毒WFG36株作为攻毒毒株进行攻毒，点眼、滴鼻0. 2ml/只，肌注0. 3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鸭的抗凝血，分离血浆，分别经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚5枚，0. 2ml/胚，接种后观察7天，免疫组应至少4只病毒分离阴性，对照组应至少4只病毒分离阳性。4)纯净按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。5)特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍，与等量抗鸭黄病毒特异性血清混合后，37°C 中和1小时，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0. aiil/胚，观察168小时，应不引起特异性死亡或感染，非特异性死亡鸡胚应不超过1枚。2. 一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备方法，主要是使用鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用种毒，使用6 14日龄的鸡胚或6 14日龄的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或 BHK细胞或H(15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，每0. Iml抗原病毒含量应> IO3 0ELD50 ； 抗原经甲醛溶液或β-丙内酯或二乙烯亚胺灭活后按常规方法制取水相，与矿物油制成的油相混合而成灭活油佐剂疫苗。具体有以下制备步骤(1)选择鸭黄病毒WFG36株作为疫苗生产用种毒；(2)选择6 14日龄的对鸭黄病毒易感的鸡胚或6 14日龄的对鸭黄病毒易感的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或Η(15细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料；(3)抗原的制备可通过以下6种途径实现1)用6 14日龄的易感鸡胚作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种易感鸡胚将生产用种毒按每胚> IOl tlELD5tl的剂量接种到易感胚卵黄囊或尿囊腔，接种后用蜡烛封好针孔，置37°C孵育；孵育和观察易感鸡胚接种后每日照蛋1次，弃去M小时内的死亡胚，之后每12 小时照蛋一次，随时取出死亡胚，置于2 8°C保存。168小时孵育完成后，取出全部鸡胚， 置于2 8°C冷却；收获病毒液将冷却的鸡胚取出，无菌收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合。2)用6 14日龄的易感鸭胚作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种易感鸭胚将生产用种毒按每胚> IOl tlELD5tl的剂量接种到易感胚卵黄囊或尿囊腔，接种后用蜡烛封好针孔，置37°C孵育；孵育和观察易感鸭胚接种后每日照蛋1次，弃去M小时内的死亡胚，之后每12 小时照蛋一次，随时取出死亡胚，置于2 8°C保存。168小时孵育完成后，取出全部鸭胚， 置于2 8°C冷却；收获病毒液将冷却的鸭胚取出，无菌收获胚体、胚液和绒毛尿囊膜，研磨混合。3)用Vero细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的Vero细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养；观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至72_%h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 0C ο4)用CEF细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层CEF细胞后，放置于转瓶机上培养；观察与收获接毒后每1 观察一次，当细胞典型病变时，继续培养至72_%h，至细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20°C。5)用BHK细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的BHK细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养；观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至72_%h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 0C ο6)用H(15细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的H(15细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养；观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至72_%h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 "C ο(4)制备的抗原(收获的病毒液)，应按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》) 附录逐瓶作无菌检验，并抽样1份测定病毒含量(ELD5tl)，应无菌生长，每0. Iml病毒含量应彡 103°ELD5。。(5)病毒液灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液(或β -丙内酯或二乙烯亚胺)，摇勻后置于37°C进行灭活；无菌检验按《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/胚，置36 37°C孵育，24小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚，逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(6)油乳剂灭活疫苗制备将配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、 硬脂酸铝2份)和水相(灭活抗原96份、吐温-80 4份)制备完成后，按油相与水相2 1 份的配比比例置于乳化罐中进行乳化，乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。乳化完成后进行无菌分装，即可得到成品疫苗。本发明的优点本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗及其制备方法。本发明利用微生物保藏号是CGMCC No. 4718的一株鸭黄病毒WFG36株作为生产疫苗的病毒株，通过使用6 14日龄的鸡胚或6 14日龄的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或H(15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，再经过灭活、配苗等步骤，制备出一种安全、有效的预防和控制鸭出血性卵巢炎的疫苗。具体实施方法实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1生产用毒种制备(1)毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍，卵黄囊接种6 14日龄SPF鸡胚)，0. Iml/ 胚，弃去M小时内死亡胚，之后每12小时照胚一次，随时取出死亡胚，置于2 8°C保存，接种后168小时，所有活胚置2 8°C冷却过夜，收获所有鸡胚的胚液，装于灭菌容器内。将检验无菌的胚液定量分装，冷冻保存，注明收获日期，毒种代次等。(2)毒种鉴定病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-2、10_3、10-4 3个稀释度分别经卵黄囊接种6 14日龄日龄SPF鸡胚5枚，0. Iml/胚，置37°C继续孵育，M小时之内死亡胚弃去不计，24小时之后死亡鸡胚随时取出，置于4°C保存，观察至168小时，根据鸡胚死亡数计算ELD5tl，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500纯净按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。按照以上说明进行，应符合规定。符合以上标准的毒种作为生产用毒种。(3)毒种保存湿毒在-15°C以下，暂定为12个月；冻干毒在-70°C以下，暂定为M个月。(4)毒种继代应不超过3代。实施例2鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备(1)制苗用毒液的繁殖1)接种取生产用种毒，用灭菌生理盐水稀释100倍，卵黄囊接种6 14日龄日龄易感鸡胚(或健康鸭胚)，0. Iml/胚，接种后用蜡烛封好针孔，置37°C继续孵育，不必翻蛋。2)孵育和观察鸡胚接种后每日照蛋1次，弃去对小时内死亡胚，之后每12小时照蛋一次，随时取出死亡胚，置于2 8°C保存，至168小时，取出全部鸡胚，置于2 8°C冷却过夜。幻收获将冷却的鸡胚取出，无菌收获胚体和胚液，对每枚鸡胚在吸取胚液前应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。收获的胚体、胚液、绒毛尿囊膜加灭菌生理盐水研磨后，与胚液混合，取样进行检验。_15°C以下保存备用。4)检验收获的病毒液，应按现行《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD5tl),应无菌生长，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500(2)灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液至终浓度为0.1%，随即充分摇勻，升温至37°C时开始计时，灭活48小时，灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活的病毒液置2 8°C保存，应不超过30日。(3)半成品检验1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。2)灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0. 2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚， 逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(4)油乳剂灭活疫苗制备1)油相制备取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。幻水相制备取灭活抗原96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，使吐温-80完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，开动电机搅拌，同时缓慢加入水相1份，加完后转入乳化罐中，以3000r/min乳化60分钟即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。(5)分装在无菌条件下，定量分装，加盖密封。实施例3鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备(1)制苗用毒液的繁殖——用Vero细胞制备抗原1)种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的Vero细胞上， 并将细胞瓶置于转瓶机上培养；2)观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至72h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 0C ο3)检验收获的病毒液，应按现行《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD5tl),应无菌生长，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500(2)灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液至终浓度为0.1%，随即充分摇勻，升温至37°C时开始计时，灭活48小时，灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活的病毒液置2 8°C保存，应不超过30日。(3)半成品检验1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。2)灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0. 2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚， 逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(4)油乳剂灭活疫苗制备1)油相制备取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。2)水相制备取灭活抗原96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，使吐温_80完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，开动电机搅拌，同时缓慢加入水相1份，加完后转入乳化罐中，以3000r/min乳化60分钟即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。(5)分装在无菌条件下，定量分装，加盖密封。实施例4(1)鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备——用CEF细胞制备抗原1)种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层CEF细胞后，放置于转瓶机上培养；2)观察与收获接毒后每1 观察一次，当细胞出现典型病变时，继续培养至 72h,至细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20°C。3)检验收获的病毒液，应按现行《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD5tl),应无菌生长，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500(2)灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液至终浓度为0.1%，随即充分摇勻，升温至37°C时开始计时，灭活48小时，灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活的病毒液置2 8°C保存，应不超过30日。(3)半成品检验1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。幻灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚， 逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(4)油乳剂灭活疫苗制备1)油相制备取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。幻水相制备取灭活抗原96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，使吐温-80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，开动电机搅拌，同时缓慢加入水相1份，加完后转入乳化罐中，以3000r/min乳化60分钟即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。(5)分装在无菌条件下，定量分装，加盖密封。实施例5(1)鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备——用BHK细胞制备抗原1)种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的BHK细胞上， 并将细胞瓶置于转瓶机上培养；2)观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至96h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 0C ο3)检验收获的病毒液，应按现行《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD5tl),应无菌生长，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500
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(2)灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液至终浓度为0.1%，随即充分摇勻，升温至37°C时开始计时，灭活48小时，灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活的病毒液置2 8°C保存，应不超过30日。(3)半成品检验1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。幻灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚， 逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(4)油乳剂灭活疫苗制备1)油相制备取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。幻水相制备取灭活抗原96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，使吐温-80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，开动电机搅拌，同时缓慢加入水相1份，加完后转入乳化罐中，以3000r/min乳化60分钟即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。(5)分装在无菌条件下，定量分装，加盖密封。实施例6(1)鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备——用PK15细胞制备抗原1)种毒接种细胞将生产用种毒用生理盐水稀释后，接种到单层的H(15细胞上， 并将细胞瓶置于转瓶机上培养；2)观察与收获接毒后每1 观察一次，培养至96h，收获毒液，将接毒细胞置于-20 0C ο3)检验收获的病毒液，应按现行《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD5tl),应无菌生长，每0. Iml病毒含量应> IO3 0ELD500(2)灭活向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液至终浓度为0.1%，随即充分摇勻，升温至37°C时开始计时，灭活48小时，灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活的病毒液置2 8°C保存，应不超过30日。(3)半成品检验1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活病毒液进行无菌检验，应无菌生长。幻灭活检验取灭活后病毒液，卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小时内死亡胚弃去，观察至168小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚， 逐个检查胎儿，均应不出现肝脏、肾脏出血等病痕。(4)油乳剂灭活疫苗制备1)油相制备取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
幻水相制备取灭活抗原96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分搅拌，使吐温-80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，开动电机搅拌，同时缓慢加入水相1份，加完后转入乳化罐中，以3000r/min乳化60分钟即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。(5)分装在无菌条件下，定量分装，加盖密封。实施例7鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的检验性状外观乳白色乳剂。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0. 5ml。黏度用Iml吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1. Oml，令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需时间，应在8秒以内。无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行，应无菌生长。安全检验取1 2周龄SPF鸭10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗1ml，观察 14天，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。效力检验取10只7 10日龄SPF雏鸭，平均分为两组，5只作为试验组，5只作为空白对照组，试验组每只颈背皮下注射疫苗0. :3ml，接种后21天，用鸭黄病毒强毒攻毒， 点眼、滴鼻0. 2ml/只，肌注0. 3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鸭的抗凝血，分离血浆，分别经卵黄囊接种7日龄易感鸡胚5枚，0. 2ml/胚，接种后观察7天，试验组应至少4只病毒分离阴性，对照组应至少4只病毒分离阳性。甲醛、汞类防腐剂残留量测定分别按《中国兽药典》规定的方法进行，应符合兽用生物制品通则的规定。


本发明涉及一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗及其制备方法。本发明利用微生物保藏号是CGMCC No.4718的一株鸭黄病毒WFG36株作为生产疫苗的病毒株，使用6～14日龄的鸡胚或6～14日龄的鸭胚或Vero细胞或CEF细胞或BHK细胞或PK15细胞进行病毒的繁殖及抗原的制备，再经过灭活、配苗等步骤，制备出一种安全、有效的预防和控制鸭出血性卵巢炎的疫苗。