微生物发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的方法【技术领域】，特别是涉及一种利用丙酸杆酸发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的方法。[0002]二氧化碳既是对大气“温室效应”影响最大的气体，又是地球上最丰富的碳资源。人们可以通过二氧化碳减排和碳封存两种方法，同时结合提高能源生产和使用效率以及增加低碳或非碳燃料的生产和利用等手段来达到减缓大气二氧化碳浓度增长的目标。利用微生物固定二氧化碳同时代谢生产有机酸、醇等是一个非常有前景的发展领域。[0003]丙酸及其盐是饲料、医药、食品工业等的重要原料。随着农业、轻纺、食品、医药等工业的发展，对农药除草剂、涂料杀菌剂、食品保护剂及饲料添加剂等的需求量日益增加，丙酸需求量也在日益增加。我国现有丙酸总年产能力约1000吨，实际年产量只有200吨左右，远远不能满足实际需要，需大量依赖进口来弥补。[0004]丙酸盐主要由丙酸进一步加工而成。目前，生产丙酸的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。工业上主要以化学合成法生产丙酸。丙醛氧化法、雷帕法和轻质烃氧化法3种工艺是丙酸生产工业中最常用的方法。另外，丙烯腈法、乙醇羰基法、正丙醇氧化法、丙烷(丁烷，石蜡)液相氧化法等也可用于丙酸生产，但由于设备投资大等原因，至今仍未在实践中采用。与传统化学方法相比，微生物发酵法生产丙酸具有诸多优点:生产成本具有竞争力；利用可再生的农业资源作为原料，避免了对石化原料的依赖；减少了化学合成工艺对环境的污染。国内外对微生物发酵生产丙酸的研究多集中于利用葡萄糖、乳糖、甘油、乳酸为碳源，着力于提高菌株对丙酸的耐受度或降低丙酸对细胞生长的抑制作用(代谢产物的抑制)，多采用细胞固定化发酵技术、发酵偶联技术或发酵液流加碱液中和丙酸的技术，以减少丙酸等有机酸对细胞生长的抑制作用。但大量发酵废气的直接排放，不仅会增加环境负担，而且会降低碳源的利用率。目前对发酵废气综合利用方面的研究和应用还刚刚起止/J/ O[0005]丁二酸，又称琥珀酸，主要用于制备琥珀酸酐等五杂环化合物，也用于制备醇酸树月旨、油漆、染料、食品调味剂、照相材料等。医药工业中可用它生产磺胺药、维生素A、维生素B等抗痉挛剂、松痰剂、利尿剂和止血药物。作为化学试剂，用作碱量法标准试剂、缓冲剂、气相色谱对比样品，还可用作润滑剂和表面活性剂的原料。此外，丁二酸钠在食品工业中用作鲜味剂、饲料添加剂。[0006]目前市场上销售的丁二酸都是以液化石油气或石油为原料化学法产生的。由于化学法由丁烷转化为马来酐生产丁二酸的成本过高，丁二酸的产量和销量并不高，应用领域受到很大限制；近年来，由于生物技术的进步，发酵法生产丁二酸的成本不断下降，已经低于化学合成法，而且，发酵法生产丁二酸以葡萄糖等可再生资源为原料，而且生物转化过程中可以固定温室气体二氧化碳，因此对于资源安全和环境安全都明显优于化学合成法。[0007]在利用丙酸菌或混合菌种发酵生产丙酸的过程中，碳源转化率低，产物中含有大量的其他有机酸，丁二酸是其中一种，但由于丁二酸的含量很低，无法有效利用。另外，在发酵生产丙酸过程中，发酵体系的二氧化碳是作为副产物的丁二酸生物合成所必需的底物。因此，在发酵生产丙酸过程中，如何使发酵体系中的二氧化碳尽可能转化成丁二酸、减少二氧化碳的排放，是发酵法联产丙酸及其盐和丁二酸及其盐的技术关键。


[0008]本发明主要解决的技术问题是提供一种微生物发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的方法，所述方法既能提高碳源的利用率、循环利用发酵体系中的二氧化碳、减少二氧化碳的排放、保护环境，又能实现丙酸及其盐和丁二酸及其盐的工业化生产，相比单独生产丙酸及其盐和丁二酸及其盐，简化了工艺流程，节省了成本，提高了经济价值。
[0009]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:一种微生物发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的方法，所述方法包括以下步骤:
[0010](I)菌种培养:取适量生产用丙酸杆菌菌种，接入含种子培养基的厌氧瓶中，在厌氧箱中静置培养36~72h ;
[0011](2)种子培养:取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入含种子培养基的种子罐中，充入无菌氮气搅拌培养36~72h ；
[0012](3)生产发酵:取步骤(2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的发酵罐中，充入无菌氮气搅拌培养；根据发酵液PH值的变化流加10~40%的碳酸盐溶液，控制发酵液PH值在6.0~8.0之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以10~50mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的20~50%甘油水溶液至发酵全程；发酵192~288h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；
[0013](4)丙酸盐和丁二酸盐的提取:将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁二酸盐制品。
[0014]具体地，所述方法包括以下步骤:
[0015](I)菌种培养:取适量生产用丙酸杆菌菌种，分别接入4~6只2500mL内装种子培养基2000mL的厌氧瓶中，在30~32°C下，厌氧箱中静置培养36~72h ；OD600 = 1.0~
2.0，pH 值 5.5 ~6.0 ;
[0016](2)种子发酵:取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入Im3不锈钢种子罐中，在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养36~72h，通气量0.1~0.2vvm，罐压0.02~0.03mpa，搅拌速率50~IOOrpm ；
[0017](3)生产发酵:取步骤(2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的50m3发酵罐中；在30~32°C下，充入无菌`氮气搅拌培养，通气量0.1~0.2vvm，罐压0.02~
0.03mpa,搅拌速率50~IOOrpm ;根据发酵液pH值的变化流加10~40 %的碳酸盐溶液，控制发酵液PH值在6.0~8.0之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以10~50mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的20~50%甘油水溶液至发酵全程；发酵192~288h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；[0018](4)丙酸盐和丁二酸盐的提取:将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁二酸盐制品。
[0019]其中，所述种子培养基按重量体积比计，由以下成分组成:0.5~2.0%甘油、I~3%酵母膏、0.5~2%豆饼粉、0.1~0.5%磷酸氢二钾、0.1~0.5%磷酸二氢钾、余量为水。
[0020]其中，所述基础发酵培养基按重量体积比计，由以下成分组成:1~6%甘油、I~3%酵母膏、0.5~2%豆饼粉、0.5~1.0%碳酸钙，0.1~0.5%磷酸氢二钾、0.1~0.5%
磷酸二氢钾、余量为水。
[0021 ] 其中，所述碳酸盐为碳酸钙或碳酸钠。
[0022]本发明的有益效果是:区别于现有微生物发酵丙酸对细胞生长的抑制作用、碳源利用率低、排放二氧化碳、污染环境的情况，本发明方法在微生物发酵产丙酸的过程中流加碳酸盐，以中和发酵体系中产生的丙酸，降低丙酸对细胞生长的抑制作用，发酵体系中产生的二氧化碳以及碳酸盐中和丙酸及丁二酸产生的二氧化碳用于合成丁二酸，这样既能提高碳源的利用率、循环利用发酵体系中的二氧化碳、减少二氧化碳的排放、保护环境，又能实现丙酸及其盐和丁二酸及其盐的工业化生产，相比单独生产丙酸及其盐和丁二酸及其盐，简化了工艺流程，节省了成本，提高了经济价值。



[0023]图1为本发明微生物发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的工艺流程图。

[0024]下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
[0025]本发明采用丙酸杆菌CGMCC 1.2230 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐，生产工艺请参见图1。
[0026]一、菌种培养
[0027]取适量生产用丙酸杆菌菌种，接入含种子培养基的厌氧瓶中，在厌氧箱中静置培养36~72h ；
[0028]二、种子培养
[0029]取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入含种子培养基的种子罐中，充入无菌氮气搅拌培养36~72h ；
[0030]三、生严发酵
[0031]取步骤(2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的发酵罐中，充入无菌氮气搅拌培养；根据发酵液PH值的变化流加10~40%的碳酸盐溶液，控制发酵液pH值在
6.0~8，O之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以10~50mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的20~50%甘油水溶液至发酵全程；发酵192~288h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；
[0032]四、丙酸盐和丁二酸盐的提取[0033]将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁_盐制品。
[0034]实施例1
[0035]一、培养基(按重量体积比计):
[0036]1、种子培养基:0.5%甘油、1%酵母膏、0.5%豆饼粉、0.1%磷酸氢二钾、0.1%磷酸二氢钾，余量为水；
[0037]2、基础发酵培养基:1%甘油、1%酵母膏、0.5%豆饼粉、0.5%碳酸钙，0.1%磷酸氢二钾、0.1 %磷酸二氢钾，余量为水。
[0038]按以上配方配制好种子培养基和基础发酵培养基，将种子培养基和基础发酵培养基蒸汽灭菌121 °C /30min，冷却至30°C，备用。
[0039]二、利用丙酸杆菌发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐
[0040](I)菌种培养:取适量生产用丙酸杆菌菌种，分别接入4~6只2500mL内装种子培养基2000mL的厌氧瓶中，在30~32°C下，厌氧箱中静置培养36h ；OD600 = 1.0~2.0，pH值 5.5 ~6.0 ;
[0041](2)种子发酵:取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入Im3不锈钢种子罐中，在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养36h，通气量0.lvvm，罐压0.02mpa，搅拌速率50rpm ；
[0042](3)生产发酵:取步骤 (2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的50m3发酵罐中；在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养，通气量0.lvvm，罐压0.02mpa，搅拌速率50rpm ;根据发酵液pH值的变化流加10%的碳酸钙溶液，控制发酵液pH值在6.0~8.0之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以10mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的20%甘油水溶液至发酵全程；发酵192h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；
[0043](4)丙酸盐和丁二酸盐的提取:将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁二酸盐制品。
[0044]实施例2
[0045]一、培养基(按重量体积比计):
[0046]1、种子培养基:1.0%甘油、2%酵母膏、1%豆饼粉、0.3%磷酸氢二钾、0，3%磷酸二氢钾，余量为水；
[0047]2、基础发酵培养基:3%甘油、2%酵母膏、1%豆饼粉、0.8%碳酸钙，0.3%磷酸氢二钾、0.3%磷酸二氢钾，余量为水。
[0048]按以上配方配制好种子培养基和基础发酵培养基，将种子培养基和基础发酵培养基蒸汽灭菌121 °C /30min，冷却至30°C，备用。
[0049]二、利用丙酸杆菌发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐
[0050](I)菌种培养:取适量生产用丙酸杆菌菌种，分别接入4~6只2500mL内装种子培养基2000mL的厌氧瓶中，在30~32°C下，厌氧箱中静置培养48h ；OD600 = 1.0~2.0，pH值 5.5 ~6.0 ;
[0051](2)种子发酵:取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入Im3不锈钢种子罐中，在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养48h，通气量0.15vvm,罐压0.025mpa,搅拌速率80rpm ；
[0052](3)生产发酵:取步骤(2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的50m3发酵罐中；在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养，通气量0.15vvm，罐压0.025mpa，搅拌速率80rpm ;根据发酵液pH值的变化流加25%的碳酸钠溶液，控制发酵液pH值在6.0~
8.0之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以30mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的35%甘油水溶液至发酵全程；发酵240h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；
[0053](4)丙酸盐和丁二酸盐的提取:将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁二酸盐制品。
[0054]实施例3
[0055]一、培养基(按重量体积比计):
[0056]1、种子培养基:2.0%甘油、3%酵母膏、2%豆饼粉、0.5%磷酸氢二钾、0，5%磷酸二氢钾，余量为水；
[0057]2、基础发酵培养基:6%甘油、3%酵母膏、2%豆饼粉、1.0%碳酸钙，0.5%磷酸氢二钾、0.5%磷酸二氢钾，余量为水。
[0058]按以上配方配制 好种子培养基和基础发酵培养基，将种子培养基和基础发酵培养基蒸汽灭菌121 °C /30min，冷却至30°C，备用。
[0059]二、利用丙酸杆菌发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐
[0060](I)菌种培养:取适量生产用丙酸杆菌菌种，分别接入4~6只2500mL内装种子培养基2000mL的厌氧瓶中，在30~32°C下，厌氧箱中静置培养72h ；OD600 = 1.0~2.0，pH值 5.5 ~6.0 ;
[0061](2)种子发酵:取步骤(1)培养好的厌氧瓶菌种接入Im3不锈钢种子罐中，在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养72h，通气量0.2vvm，罐压0.03mpa，搅拌速率IOOrpm ；
[0062](3)生产发酵:取步骤(2)培养好的丙酸杆菌无菌接入含基础发酵培养基的50m3发酵罐中；在30~32°C下，充入无菌氮气搅拌培养，通气量0.2vvm，罐压0.03mpa，搅拌速率IOOrpm ;根据发酵液pH值的变化流加40%的碳酸钙溶液，控制发酵液pH值在6.0~8.0之间；发酵培养36h后，当发酵罐中甘油的量降至15g/L以下时，以50mL/h/L的流加速度流加经过灭菌处理的50%甘油水溶液至发酵全程；发酵288h，甘油不再消耗、pH值不再变化、丙酸含量达到45g/L以上、丁二酸含量达到15g/L以上时发酵结束；
[0063](4)丙酸盐和丁二酸盐的提取:将步骤(3)发酵结束后的发酵液经过压滤机过滤、取滤液，在结晶器中分离丙酸盐和丁二酸盐，离心收集晶体，分别送入旋转闪蒸干燥器中干燥，干燥后的粉剂即为丙酸盐制品和丁二酸盐制品。
[0064]尽管本发明的已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。