专利名称：一种中药组合物在制备脊髓损伤后神经保护药物中的应用的制作方法运动神经元疾病(motor neuron disease, MND)包括肌萎缩侧索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、进行性脊肌萎缩、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化等，是由于中枢神经系统上下运动神经元广泛变性引起的，其症状有肌力减退、肌肉萎缩，并逐渐发展为饮食呛咳、吞咽困难、呼吸困难，直到死亡。ALS是一种病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经核及锥体束的慢性进行性变性疾病，临床表现为上下运动神经元合并受损的体征，是慢性运动神经元疾病中最常见的类型。进行性脊肌萎缩，大多数患者一侧或双侧手部肌群无力和萎缩，可见肌束颤动，肌张力减低，腱反射减弱或消失， 严重者呈爪形手。肌萎缩和肌无力可向上发展，感觉神经不受累，少数患者下肢可出现症状。原发性侧索硬化症，成人起病，病程进展缓慢，常先侵犯下胸段的皮质脊髓束，出现双下肢无力、僵硬、行走时呈痉挛步态，逐渐累及双上肢。四肢肌张力增高，病理体征阳性。进行性延髓麻痹，以逐渐加重的延髓麻痹症状首发，表现为吞咽困难，饮水呛咳、言语含糊，咳嗽无力，甚至呼吸困难。同时或稍后出现出现躯体运动神经元受损的症状和体征。临床表现为，起病缓慢，病程也可呈亚急性，症状依受损部位而定。由于运动神经元疾病选择性侵犯脊髓前角细胞、脑于颅神经运动核以及大脑运动皮质锥体细胞、锥体束，因此若病变以下级运动神经元为主，称为进行性脊髓性肌萎缩症；若病变以上级运动神经元为主，称为原发性侧索硬化；若上、下级运动神经元损害同时存在，则称为肌萎缩侧索硬化；若病变以延髓运动神经核变性为主者，则称为进行性延髓麻痹。临床以进行性脊肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化最常见。本病主要表现，最早症状多见于手部分，患者感手指运动无力、僵硬、笨拙，手部肌肉逐渐萎缩，可见肌束震颤。四肢远端呈进行性肌萎缩，约半数以上病例早期呈一侧上肢手部大小鱼际肌萎缩，以后扩展到前臂肌，甚至胸大肌，背部肌肉亦可萎缩，小腿部肌肉也可萎缩，肌肉萎缩肢体无力，肌张力高(牵拉感觉)，肌束颤动，行动困难、呼吸和吞咽障碍等症状。如早期病变性双侧锥体束，则可先出现双下肢痉挛性截瘫。本病病因复杂，目前尚缺乏有效的治疗手段，中医药在改善患者临床症状、提高生存质量方面具有明显的优势，本发明药物作为医院制剂在运动神经元病治疗中取得较好的临床疗效[王雅慧，赵辉，黄佳筌.肌萎灵汤治疗多发性硬化的临床研究.现代中西医结合杂志，2006,15(12) :1608-1609;陈金亮，平阳，王殿华.肌萎灵系列制剂治疗肌萎缩侧索硬化症240例疗效观察.新中医，2005，37 (9) :38-39]。本发明通过上调bcl_2蛋白表达、下调bax蛋白表达，从而抑制谷氨酸诱导的原代神经元细胞凋亡，增强神经元细胞活力，从而延缓病情发展，推测在改善患者肢体活动，提高生存质量等方面具有重要的临床应用价值。本发明是在中国专利CN1785223A的基础上进行的改进发明，在此引用该专利文件记载的内容。本发明提供了该中药组合物在制备保护运动神经元药物中的应用。
本发明提供了该中药组合物在制备脊髓损伤后神经元保护药物中的应用。本发明中药组合物是由如下重量份比例的原料制成 人参总皂苷提取物30-70 淫羊藿总黄酮提取物20-60。优选为人参总皂苷提取物35 淫羊藿总黄酮提取物55。还优选为人参总皂苷提取物65 淫羊藿总黄酮提取物25。或者人参总皂苷提取物50 淫羊藿总黄酮提取物40。本发明原料中的人参皂苷提取物和淫羊藿总黄酮提取物均按照CN 1785223A公开的方法制得的。人参总皂苷提取物制备方法人参药材，用60-90%乙醇提取1-3次，第1次加药材8-12倍量溶剂提取1-2小时，第2次加6-10倍量溶剂提取1_2小时，第3次加6_10倍量溶剂提取0. 5-1小时；合并上述提取液，趁热滤过，减压回收乙醇，并浓缩，放入不锈钢桶内，加纯水搅拌均勻，冷藏对-3他；将冷藏液取出，放至常温，板框过滤器过滤，用少量水洗涤板框，滤液加纯水稀释，备用；取人参浓缩药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用PH值8-9的氨水、20%乙醇、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液。将80%洗脱液加入纯水，配成50%醇溶液，通过中性氧化铝柱，收集洗脱液，再用少量50%乙醇洗涤柱子，合并洗脱液备用；取药液加入活性炭，回流加热，煮沸20min，趁热板框抽滤，收集滤液，浓缩， 冷藏过夜；澄清板过滤，减压干燥，即得人参总皂苷提取物。淫羊藿总黄酮制备方法取淫羊藿药材，加水煎煮提取2-5次，加水量为10-30倍， 第一次提取时间定为0. 5-2h，以后3次为0. 5-lh ；合并上述提取液，趁热滤过，减压浓缩，放入不锈钢桶内，加乙醇至药液含醇浓度为7096，冷藏；过滤，滤液回收乙醇并浓缩，加水搅拌均勻，冷藏，过滤，备用；取淫羊藿药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用纯水、20%乙醇、50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液；洗脱液拌入适量硅藻土混勻，用无水乙醇提取2-5次，提取液合并，回收乙醇并浓缩，浓缩液加入丙酮，并搅拌均勻，冷藏，过滤，沉淀加丙酮再同前处理2次，合并3次滤液，回收溶剂，并浓缩，减压干燥，即得淫羊藿总黄酮提取物。本发明还提供了中药组合物冻干注射剂的制备方法a、将5-15倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成15 30%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成3 10%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-环糊精溶液中，保温 50 90°C，动态搅拌包合，包合时间3 8小时，将人参总皂苷提取物加水制成30-50%的溶液，加入包合液中，继续包合1 2小时；b、加水调节溶液总量至6ml/支，用5 20%的氢氧化钠溶液调节PH到6 9，加入活性炭至含活性炭0. 1 0. 5%，煮沸5 10分钟，趁热滤除活性炭，再用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；
c、105°C热压灭菌10 30分钟，取出，放至常温，用0.22 μ m微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20°C _40°C预冻2 5小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0. 5 状态下，从预冻温度至0°C升温升华20-35小时，再从0°C至30°C升温干燥3-8小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。优选为
a、将9倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成20%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成5%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β -环糊精溶液中，保温60 80°C，动态搅拌包合，包合时间3 5小时，将人参总皂苷提取物加水制成33%的溶液，加入包合液中，继续包合1 2小时；
b、加水调节溶液总量至6ml/支，用10%的氢氧化钠溶液调节PH到7.5 8. 0，加入活性炭至含活性炭0. 4%，煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；
c、105°C热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22 μ m微孔滤膜过滤，分装至西林瓶， 每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40°C预冻3小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0. IPa状态下，从_40°C至0°C升温升华28小时，再从OV至30°C升温干燥4. 5小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。本发明冻干注射剂的制备方法中的所述百分比浓度，如果为固体溶解在液体中一般指重量体积比(g/ml或Kg/L)，例如羟丙基-β -环糊精加水溶解制成20%的溶液，是指取20克羟丙基- β -环糊精加水IOOml制成；如果为液体溶解在液体中，则为体积体积比 (ml/ml或L/L)，比如50%乙醇浓度是指50ml纯乙醇与50ml的水制成的溶液，也可以使用高浓度乙醇稀释至体积体积比为50%的溶液。本发明所述中药冻干注射剂的原辅料重量比例及制备方法是经过大量严格筛选试验，工艺验证，稳定性研究后才得到的，并非通过制剂教材或其它参考资料就可以直接得到的，经过筛选试验，工艺验证，稳定性研究证实本发明原辅料比例合理，制备工艺稳定，成品制剂稳定，符合制剂学以及国家食品药品监督管理局对于中药冻干注射剂的制剂指导原则要求。本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂等。本发明的应用中，所述中药组合物制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如填充齐 、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括淀粉、 预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、 微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等； 矫味剂包括甜味剂及各种香精；防腐剂包括尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。为阐明本发明中药组合物具有保护运动神经元的活性，用按实施例1的方法所制得的药物(以下称本发明药物)进行了下列试验。1实验材料
1. 1药物本发明药物(JWLF)，有效部位为总皂苷、总黄酮，每支0.8g，含生药3.5g， 辅料含量约为91. 4%，临床用量为每日2支，由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号 20081201。辅料对照冻干粉为白色疏松块状粉，批号20090303。注射用七叶皂苷钠(冻干粉)，IOmg/支，黑龙江省珍宝岛制药有限公司生产，批号20090401。利鲁唑，由Sigma公司生产,批号057K3900。1. 2试剂谷氨酸Sigma公司，批号118K08801 ；高糖DMEM培养液Gibco公司， 批号=1290007 ；胎牛血清=Cellgro公司，批号=50020038 ；MTT 超纯级，Amressco公司；二甲基亚砜(DMSO)ACS grade,Amressco公司；RIPA裂解液Solarbio公司，批号90090830 ； bcl-2、bax、β-actin 抗体均为 Santa cruz 公司产品，批号分别为 D0609、C0909、F2007。1. 3实验动物清洁级SD大鼠，雌雄各半，18(T220g ；清洁级SD雌性大鼠，孕期 l(Tl4d，均购于河北省实验动物中心，许可证号SCXK (冀)2008-1-003。大鼠笼养，饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心，光照12小时/天，温度2(T25°C，相对湿度 409^70%。1.4仪器系统 Epics-XLII型流式细胞仪(Beckman Coulter)，凝胶成像分析仪(Biorad)，凝胶成像图像分析软件(Quantity one)，5417R型低温离心机(Eppendorf)， XD711酶标分析仪(上海迅达医疗仪器公司)，二氧化碳细胞培养箱(日本三洋)，座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。2实验方法
2.1对大鼠脊髓损伤损伤后脊髓神经功能的影响
2.1.1实验分组将140只大鼠随机分为以下7组，每组20只。本发明药物设高中低三个剂量组，其剂量分别为2. 32、1. 16,0. 58g生药/kg ；另设假手术组、模型组、阳性药组和辅料组。阳性药为七叶皂苷钠冻干粉，给药剂量为3. 33mg/kg。辅料组给药量为0. 485g/kg。2.1.2给药方法药物配制溶媒均为生理盐水，使用前溶解至相应浓度尾静脉注射给药，给药体积为lmL/100g体重。假手术组、模型组大鼠尾静脉注射生理盐水。于手术造模前2周开始预防性给药，造模后继续给药治疗2周。2.1.3大鼠脊髓损伤模型的建立 10%的水合氯醛麻醉，大鼠进入麻醉状态后固定于手术台上，常规碘伏消毒局部皮肤。以大鼠第12胸椎棘突处皮肤为切口的下缘， 做中线3cm长的切口，切开皮肤、皮下，沿中线切开肌筋膜，暴露出T9-T11胸椎棘突，沿其两侧锐性分离肌肉至关节突，尖嘴咬骨钳咬除TlO及上下各一个节段的椎板，暴露范围约 3mmX 12mm大小，保持硬脊膜完整，采用自制静态压迫装置，以30g重量，压迫lOmin。滴加抗生素，逐层缝合切口。假手术组仅行椎板切除手术，未行静态压迫过程。术后给损伤组大鼠行人工挤压膀胱，帮助排尿，每日2-3次，直到能自行排尿为止。2. 1.4观察指标2. 1. 4. 1神经运动功能评价于术后第Mh、7d、14d应用21分的BBB评分进行神经功能评价，观察其后肢的行走及肢体活动。2. 1. 4. 2损伤处脊髓的形态学变化脊髓损伤术后14d神经运动功能评价结束后，取损伤段脊髓约1.5cm，置于4%甲醛内过夜进行固定，常规石蜡包埋，做冠状面连续切片，HE染色，观察损伤处脊髓的形态学变化。2.2对谷氨酸诱导的原代神经元细胞凋亡的影响
2.2.1药物配制将本发明药物溶于无血清的DMEM中，配制成41. 2g/L的母液， 0. 22 μ m的针头滤器过滤除菌，置_20°C冰箱保存。实验时用无血清DMEM稀释成相应浓度的工作液。2.2.2神经元细胞原代培养碘酒、酒精依次消毒孕鼠腹部，取胎鼠大脑皮层放于PBS中，剥净脑膜。无血清培养液洗两遍，吸出液体，将组织剪成细小碎块，0. 125%胰酶消化20min，吸出组织块放入含10%FBS的DMEM中，终止消化，吸管吹打15次左右，过200目筛网，800转离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10%FBS的DMEM吹打均勻。计数5. 0 X 105 个/mL，接种于96孔板或6孔板后继续培养，48h加入0. 01mmol/L阿糖胞苷，作用24h吸出， 换上新鲜的DMEM培养基。2.2.3实验分组本发明药物设高中低三个剂量组，其剂量分别为2. 06、1. 03、 0. 52g/L，另设空白对照组、模型对照组、利鲁唑组和辅料组。神经元培养7 后，实验组分别加入用新鲜培养基配制的2. 06g/L、1.03g/L、0. 52g/L本发明药物，利鲁唑组加入 10 μ mol/L利鲁唑，辅料组加入1. 89g/L辅料，空白对照组和模型对照组加入等量新鲜培养基，共同培养24h后，神经毒性损伤各组(除空白对照组外)均加入谷氨酸(终浓度为 0. 5mmol/L)，作用24h后进行指标检测。2. 2.4 MTT法测定神经元细胞活力谷氨酸作用24h后进行细胞活力检测，在培养板中加入MTT (5mg/mL)20yL，37°C闭光孵育4h，去上清，各孔加入DMSO 100 μ L，微型震荡器震荡IOmin后，570nm测定OD值。2. 2. 5神经元细胞的形态观察神经元细胞原代培养经过细胞计数后接种于含有盖玻片的6孔板，谷氨酸作用24h后，用冷PBS漂洗aiiin X 3次，4%多聚甲醛4°C孵育10 min，冷 PBS 漂洗 aninX3 次，l%Triton X _1004°C孵育 5 min，冷 PBS 漂洗 2minX 3 次，苏木素液染核Imin，自来水洗Imin，1%盐酸酒精分化1 sec，流水冲洗3min，0. 5%伊红水溶液染色lmin，自来水洗1 min，无水酒精脱水三次，二甲苯透明后封片观察。2. 2. 6神经元细胞凋亡率检测实验结束后，用0. 125%胰蛋白酶消化收集细胞， PBS清洗两遍，去上清液，用500 μ LPBS将细胞沉淀吹打成单细胞悬液，缓缓注入70 %乙醇固定，4°C保存过夜。PBS清洗两次，加入ImL碘化丙啶(PI)染液，4°C冰箱避光染色30min， 采用Epics-XL II型流式细胞仪检测凋亡率。2.2.7神经元细胞凋亡蛋白检测实验结束后，加入0. 2mLRIPA裂解液冰上裂解 30min, 4 V、3000rpm离心20min，吸取上清，BCA法测定总蛋白浓度，用样品缓冲液稀释至 5 μ g/ μ L。取100 μ g的蛋白样品进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳，待目的蛋白接近凝胶中央部分时停止电泳，4°C、120V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭lh。分别加入 bcl-2,bax和β -actin 一抗，4°C孵育过夜，TBST洗膜IOminX 3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 =10000)室温孵育lh，TBST洗膜5minX3次。ECL发光显色，凝胶成像系统照相，采用quantity one软件分析，扫描灰度值，以目的蛋白与内参β-actin的比值表示。2.3统计方法所有数据用均数士标准差(i 士s)表示。采用SPSS统计软
件包，首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，均数比较用单因素方差分析(One-Way AN0VA)，若方差齐，两两比较采用最小显著差法(LSD)，若方差不齐则采用Durmett’ s T3检验；如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计分析。3 结果
3. 1神经运动功能评价模型组大鼠BBB评分在脊髓静压损伤术后Mh、7d、14d均显著低于假手术组；各给药组BBB评分较模型组均有不同程度的提高，并随着时间的延长，改善作用尤为明显。辅料组在各时间段与模型组无明显差异，见表1。表1本发明药物在不同时间对脊髓损伤大鼠的BBB评分结果比较(士^


本发明公开了一种中药组合物对运动神经元的保护作用的应用。本发明中药组合物包括人参和淫羊藿，可促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复，增强神经元细胞活力，抑制谷氨酸诱导的神经细胞凋亡，调节凋亡相关蛋白表达，具有一定的神经保护作用。