专利名称：包含益生菌与益生元组分以及矿物盐和乳铁蛋白的组合物的制作方法消费者日益意识到以下情况，即维持他们的环境、健康和营养可能是必要的。相应地，科学研究已集中于饮食、压力和现代医学实践(例如，抗生素和放射治疗)在威胁人类健康方面可能起到的作用。具体而言，走向老龄社会的人口动态变化正在提高可能因微生物群落不足或缺乏免疫力而引起的疾病的发病率，所述疾病诸如胃肠道(GIT)感染、便秘、 肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)-克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、食物过敏、抗生素诱发的腹泻、心血管病和某些癌症(例如结肠直肠癌)。近年来，功能性食物(以定向方式影响身体机能以便对生理学和营养产生积极影响的食物)、特别是含益生菌食物的商业制造和销售已经从已有的日本的小市场空间扩展到全球市场。尽管现在正在对许多人类来源的益生菌进行商业开发，但是不仅关于此类产品的潜在应用而且在如何改进功效方面的科学依然是新兴的。益生菌被定义为活的微生物食品补充剂，其通过改善肠道微生物平衡或者更广泛地说作为活的微生物来有益地影响宿主，其在以一定数目摄取后所发挥的健康影响超出内在的基本营养。各种微生物特别是乳酸杆菌和双歧杆菌属的混合物在传统上用于发酵乳制品中以促进健康。然而，为达到效果，所述益生菌不仅必须在制造加工、包装和贮存条件中存活，而且必须在通过胃肠道时也能存活，由此使益生菌保持存活以具有积极的健康影响。人类的进化史受细菌的影响，不仅仅在流行病方面。较不明显且更隐藏的影响是共生菌丛的影响，特别是居住在人肠道中的菌丛，其执行主要的“保护”和“教育”作用(第一项作用是在整个身体上执行，而第二项作用是在其免疫系统上执行)并且要持续地保护个体免于疾病。正如事实上众所周知的，在正常条件下，皮肤和身体的很多粘膜被不同的微生物菌丛占据，这些微生物通常是组织特异性的。例如，肠特别是大肠中主要的微生物 (迄今为止已经鉴定出不少于500个菌株)是拟杆菌属(Bacteroides spp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp)、克雷白杆菌属(Klebsiella spp·)、葡萄球菌(Staphylococci)、酵母(yeasts)禾口大肠杆菌(Escherichia coli)。这禾中共生菌丛可以分成两类“常居”菌丛，其几乎总是存在，而且如果改变的话，能够迅速恢复； 和“暂时性”菌丛，由于暂时性菌丛缺乏与常居微生物或宿主的防御机制竞争的能力，其可短期定殖在宿主中。暂时性菌丛有时也包括潜在的致病微生物。菌丛的准确组成受微生物起源因素以及宿主特定的因素的影响。然而，因为后面的这些因素(年龄、营养水平、激素和疾病)难于改变，所以分析将集中在前者。影响共生菌丛组成的重要的微生物因素是细菌附着于上皮细胞的能力。一些细菌对特定的上皮细胞呈现显著的趋向性(亲和性)。然后，正常菌丛能够通过与潜在的致病微生物竞争细胞表面上的受体而对其进行干扰。通过产生杆菌素(其是抑制其它细菌(通常属于同一属)生长的物质)，或者通过产生短链脂肪酸来提供酸性环境，或者通过竞争相同的营养素，共生菌丛也能够干扰致病微生物。其它有用的机制是产生具有交叉反应性的天然抗体的刺激，或者刺激清除机制。然而，后者的重要性更低。由于这些机制，正常菌丛形成抵抗宿主表面被致病微生物定殖的有效屏障。这被称为“抗定殖性(colonisation resistance)，，。因此可以容易地推断，任何降低这些微生物因素对胃肠生态系统影响的现象可导致严重的个体健康问题。例如，用广谱抗生素治疗消除了对所用的抗微生物剂敏感的胃肠菌丛的所有共生细菌。在这种情况下，抗定殖性被降低，并且潜在致命的微生物可自由地定殖于粘膜。当治疗中断时，常居菌丛能够随时间明显恢复。然而，遗憾的是，需氧革兰氏阴性菌比厌氧革兰氏阴性菌生长更快而且更快定殖于粘膜，厌氧革兰氏阴性菌增殖更缓慢， 尽管其构成共生菌丛的99%。在免疫防御即使仅仅部分受损的患者中，这种失调可引发革兰氏阴性菌血症(bacteraemia)。与正常菌丛被广谱抗生素抑制相关的其它可能结果包括具有真菌病外观的酵母过度生长，或者厌氧革兰氏阴性细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)过度生长，不幸的是其是相对耐受抗生素的。其存在可导致一系列非常普通的疾病，范围从腹泻到结肠炎。免疫系统及其功能是数千年发展的结果，通过与微生物界不断的相互作用日复一日地决定，特别是在胃肠水平。已得到科学证实的是，就个体健康而言，特别是考虑到现代生活的优良条件(与近代相比)，借助过度卫生保健或过度使用抗生素所达到的无菌状态并非代表成功的策略。 即使部分无菌状态能够引起的损害是熟知的，即，食物耐受不良、过敏和自体免疫性疾病。 这些问题是由于缺乏共生菌丛与免疫系统之间的接触而引起的。通过这种每天的接触，共生菌丛教导免疫系统如何区分“自身”与“非自身”。大量流行病学证据(以及例如利用无菌动物进行的试验)证实了这种理论。自从五六十年代以来，在经济发达国家已经观察到食物耐受不良率和过敏率(达 40%)以及自体免疫性疾病(如多发性硬化症、红斑狼疮和类风湿性关节炎)比率(达 30% )的显著增加，其与源自传染病的死亡率降低并行(由于越来越多的抗生素可用)。这些增加是由于不正确使用抗生素以及压力渐增的生活方式还有在婴儿情况下母乳喂养减少而引起的胃肠共生菌丛的质量和数量的重大改变的结果。事实上，经常报道母乳喂养儿童与接受所谓“人造”奶的儿童相比患有更少的食物耐受不良和过敏。甚至在最近，针对多发性硬化症(一种自体免疫性疾病)也报道了相同的关联。相反地，对居住在部落环境(在部分非洲、印度和澳大利亚内陆)(在这些地方生活方式是原始的)的个体的发病率的分析显示几乎全部不存在像过敏和自体免疫这样的疾病(尽管存在明显高的传染病比率)。改变胃肠共生菌丛的质量和数量的抗生素治疗、压力和缺乏母乳喂养会降低共生菌丛与免疫系统接触的机会。由于这种接触，免疫系统的细胞，特别是1型和2型T-辅助淋巴细胞，被“指挥”耐受(即，不应答)食物抗原和无害非食物抗原(诸如花粉)或者它们所属的躯体蛋白质(从而预防自体免疫性疾病)。因此，共生菌丛对每个个体的当前及未来健康的特殊重要性是明显的。然而，人类并非生来就具有共生菌丛。相反，在出生时，胃肠道是无菌的。在阴道分娩的情况下，通过分娩时母亲的阴道和肛门菌丛来引发其定殖，或者在剖宫产分娩的情况下，通过暴露于子宫外面的环境来引发其定殖，并且在两种情况下，其定殖均在随后受所提供的乳品类型以及母体/环境因素影响。新生儿期之后，健康个体的胃肠共生菌丛由至少1018个细菌组成， 其中的99%属于大约30 40个种属。这种菌丛因此由厌氧微生物(双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、类菌体、真细菌和革兰氏阳性球菌)和需氧微生物(乳酸杆菌、链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌)组成。然而，这些量并非沿胃肠轴平均分布胃中的细菌含量相对低(低于1百万/克)，但是在回肠中数量显著增加(1亿)并且在结肠中剧增(1000亿)。因此，在本领域中存在对含有益生菌物质的组合物的需要，该益生菌物质不仅在制造加工条件下存活，而且能够在胃肠道中存活，从而向需要其的宿主递送能生存的益生菌物质。
在其最广义方面，本发明提供了一种益生菌组合物，其包含a) —种或多种益生菌组分，所述一种或多种益生菌组分包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和至少一种选自由鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)和胚芽乳酸杆菌(LactcAacillus ρlantarum)组成的细菌组的细菌物种；以及b)载体组合物，所述载体组合物包含1) 一种或多种益生元组分，幻乳铁蛋白，幻一种或多种矿物盐，和任选地4)谷胱甘肽。在本发明的第一方面，优选的是，所述长双歧杆菌是长双歧杆菌R175(" Rosell 175 ”)，所述瑞士乳酸杆菌是瑞士乳酸杆菌R52(" Rosell52 ”);所述鼠李糖乳酸杆菌是鼠李糖乳酸杆菌Rll(" Rosell 11")，所述胚芽乳酸杆菌是胚芽乳酸杆菌 R1012(〃 Rosell 1012〃)。瑞士乳酸杆菌Rosell 52在行业内也称为嗜酸乳酸杆菌 (Lactobacillus acidophilus)属，因此如本文所用，瑞士乳酸杆菌R52也可以称为嗜酸乳酸杆菌R52。在优选的实施方式中，所述一种或多种益生元组分为菊粉和果糖。在另一优选实施方式中，所述一种或多种矿物盐选自锌、镁、钾和铜。在最优选的实施方式中，所述矿物盐包括葡糖酸锌、葡糖酸镁和柠檬酸钾。本发明的一方面提供了一种益生菌组合物，其包含a)益生菌组分混合物，所述益生菌组分混合物包含长双歧杆菌500亿CFU/g、瑞士乳酸杆菌1500亿CFU/g和胚芽乳酸杆菌1500亿CFU/g ；以及b)载体，所述载体包含1)益生元混合物，其占总载体组合物的约 80% ；2)乳铁蛋白，其量为总载体组合物的约0至约10% ；3)矿物盐，选自镁盐、钾盐和锌盐，其中镁以约0至约100%的量存在于总载体组合物中；其中钾以载体组合物的约0至约 100%的量存在；且其中锌以载体组合物的约0至约100%的量存在；和4)谷胱甘肽，其中谷胱甘肽的量为载体组合物的约0至约20%。在本发明的又一方面，提供了了一种益生菌组合物a)由长双歧杆菌R175和鼠李糖乳酸杆菌Rll组成的益生菌混合物；b)包含菊粉和果糖的益生元组分；c)乳铁蛋白；d) 由镁盐和锌盐组成的矿物盐的混合物；和e)布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。在本发明又进一步的方面，提供了利用含益生菌的组合物制备用于口服施用以维持和/或恢复哺乳动物的肠健康以及预防任意病原学生态失调的制剂的方法。在本发明又进一步的方面，提供了一种改进长双歧杆菌存活性的方法，包括将长双歧杆菌与瑞士乳酸杆菌R52和胚芽乳酸杆菌R1012项混合，其中双歧杆菌属的存活得到改善。-嗜热链球菌；-屎肠球菌；-两歧双歧杆菌和长双歧杆菌。根据本发明的益生菌组分的混合物包含至少两种细菌，其选自由下述组成的细菌组-长双歧杆菌-瑞士乳酸杆菌-嗜酸乳酸杆菌-鼠李糖乳酸杆菌，和-胚芽乳酸杆菌。在本发明优选的实施方式中，所述益生菌组合物包含长双歧杆菌。这些活的和有生机的微生物剂能够迅速定殖，这很快导致执行其功能1)通过对潜在致病种群的直接拮抗作用进行保护(抑制与上皮细胞的附着；产生杆菌素；竞争营养物和底物；建立不利的PH条件和氧化还原微环境)；2)刺激和教导免疫系统(巨噬细胞激活、增加天然杀伤细胞、增加干扰素产生以及平衡T-辅助细胞1和2种群)。3)通过释放乳酸盐、丙酸盐和丁酸盐而酸化结肠环境。科学团体最近将其兴趣集中在研究和表征看起来是开发共生剂(含益生菌和益生元的产品)的最佳候选物的那些菌株上，即，乳酸杆菌(嗜酸、瑞士、胚芽和鼠李糖)和双歧杆菌。这些不同的菌株展示出各种性质能够有效越过胃和胆屏障；改进与乳糖耐受不良相关的便秘和症状；减轻腹泻(包括具有病毒病原学的类型)；产生杆菌素；能够抑制病原体诸如沙门菌、志贺杆菌、耶尔森菌、念珠菌和大肠杆菌；免疫调节和很多其它性质。乳酸杆菌属属于乳酸细菌物种，其为原核生物。基于其鸟嘌呤和胞嘧啶含量(其为之下)(在双歧杆菌中，所述含量超过M%)，它们很容易从双歧杆菌中分化出来。该属包含约80个种类，它们是过氧化氢酶阴性的、不动的、无孢子的、细胞色素-氧化酶-阴性的、非明胶水解的，具有糖解和微需氧代谢。它们还具有特殊的营养需求，即，可溶性碳水化合物、游离氨基酸、胨、脂肪酸及其酯、盐、核酸和维生素。基于发酵类型它们也被分为专性同型发酵、专性异型发酵和兼性异型发酵种类。特别地，最初鉴定出鼠李糖属的乳酸菌，并且其选自人肠起源的菌株。它们具有不同的特异性特征，它们仅与其它产乳酸细菌部分共享这些特征1)从免疫观点看，它们改进T和B淋巴细胞反应以及⑶56+细胞的“自然杀伤” (NK)反应；2)从临床观点看，它们的应用是与各种形式的腹泻(包括轮状病毒、旅行者腹泻、 由于抗生素治疗引起的腹泻，以及由于艰难梭菌重复感染引起的再发性腹泻)斗争的有效方法；3)它们还被报道为可减少病原体在上呼吸道的定殖。在定殖方面，已知它们可抵抗胃液酸度、胆汁和大肠特有的高pH值，在大肠中，在定殖之后，它们通过有利影响环境条件而促进双歧杆菌的增殖。双歧杆菌属包含观个种类，并呈现下述一般特征革兰氏阳性的、厌氧的、不动的、无孢子的、过氧化氢酶阴性的、非尿酸的(non-acid uric)、多形的和产乙酸的(以及产乳酸盐的)。它们也使用铵盐作为氮源，并且能够合成很多维生素。最后，它们的发育受双歧生长因子(低聚糖和胨)存在的影响。如已经陈述的，在其输送和定殖过程中，乳酸杆菌和双歧杆菌进行一系列可鉴定为生理活动的活动，诸如减轻乳糖耐受不良；改进肠能动性；降低血清胆固醇；积聚蛋白水解酶、蛋白质和维生素；调节营养素吸收；再活化肠上皮的渗透性；和改进老年患者的状态。它们还以“非生理”效应为特征，诸如抗腹泻效应(幼儿腹泻、旅行者腹泻以及与应用抗生素有关的腹泻)；防腐效应(由于产生杆菌素、乳酸和乙酸以及由于释放乙酰基、 乙醛、过氧化氢和二氧化碳)；抗肿瘤效应(主要位于结肠和直肠内)；以及免疫调节效应 (用这些菌株处理的患者具有更好的NK细胞、抗体、吞噬细胞和细胞因子反应)。此外，由这些不同菌株进行的一系列生物活性处于讨论中，并且应当很快通过未来的研究予以证实，诸如非变应性活性(在食品领域)、抗炎活性(在肠领域中)、抗氧化剂活性(在动脉粥样硬化领域具有有利的反应)和护肝活性(特别是在与酒精消耗相关的领域)。根据本发明的优选方面，益生菌组分的混合物包含长双歧杆菌和至少一种选自由瑞士乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌和胚芽乳酸杆菌组成的细菌的另外的种类。在上述益生菌组分混合物中，优选的是，所述长双歧杆菌是长双歧杆菌 R175(" Rosell 175")，所述瑞士乳酸杆菌是瑞士乳酸杆菌R52 (” Rosell 52")；所述鼠李糖乳酸杆菌是鼠李糖乳酸杆菌Rll (“ Rosellll")，所述胚芽乳酸杆菌是胚芽乳酸杆菌R1012(〃 Rosell 1012〃)。瑞士乳酸杆菌Rosell 52在行业内也称为嗜酸乳酸杆菌属， 因此如本文所用，瑞士乳酸杆菌R52也称为嗜酸乳酸杆菌R52。长双歧杆菌R175以产品代码75119得自加拿大Qc蒙特利尔的hstitut Rosell Inc. (Lallemand)。长双歧杆菌R175是严格厌氧菌，由各种形状的分离的或成对的(1 1.5μπι χ 6ym)革兰氏阳性杆菌组成。其在选择性培养基上形成小的白色菌落。长双歧杆菌R175是异型发酵的，并且在发酵过程中产生1-乳酸和乙酸。其是过氧化氢酶阴性的。在实验室条件下，长双歧杆菌R175在37°C于厌氧条件下在商业可得的乳酸菌培养基(RCM)中生长良好。具体而言，其能够在下述糖类上生长(API 50CH结果，37°C下48小时之后)本发明涉及包含益生菌和益生元组分、矿物盐、乳铁蛋白以及可能的酵母的组合物，所述组合物对所施用的益生菌组分进行正确有效的定殖，其中肠道影响包括维持和/或恢复肠健康以及预防由压力、不合宜的饮食习惯和抗生素治疗引起的常见的消化道生态失调问题。所述组合物还具有伴随的抗炎和免疫调节作用。