挤出的非复制益生菌微生物以及它们的健康益处的制作方法[0001]本发明一般涉及益生菌微生物领域，特别是非复制性益生菌微生物领域。本发明的实施方案涉及包含益生菌微生物的组合物，所述益生菌微生物通过挤出成为非复制性的。此类组合物可用于治疗或预防与受损的免疫防御相关的疾病。[0002]可以将益生菌定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物” [FA0/WH0(2001)Health and Nutritional Properties of Probiotics in Foodincluding Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria.Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties ofProbiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria]。因此，大量出版的文献涉及活的益生菌。然而，一些研究调查了非复制性细菌传递的健康益处但取得的结论是益生菌的热失活通常导致它们据说的健康益处的丧失(Rachmilewitz’D.，等人，2004，Gastroenterology 126:520-528;Castagliuolo,等人，2005，FEMSImmunol.Med.Microbiol.43: 197-204 ; Gi 11，H.S.和 K.J.Rutherf urd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289;Kaila, Μ.，等人，1995, Arch.Dis.Child72:51-53.)。[0003]然而，一些研究显示被杀死的益生菌可以保留一些健康效应。该效应可能取决于例如用于使益生菌失活的方法(Rachmilewitz, D.,等人，2004, Gastroenterologyl26:520-528;Gill, H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289)。在文献中用于杀死益生菌菌株的技术主要是热处理，Y-照射，紫外线处理或使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。[0004]在食品中能够使用非复制性益生菌将有一些明显的优点。因为在较长的存储时间后提供具有存活的益生菌的食品并非简单的工作，而使用非复制性益生菌的可能性将消除与之相关的任何问题。[0005]此外，可以补充益生菌和相关的健康益处的产品的范围可以显著地扩大。[0006]然而，为了应用到食品工业中，用于使益生菌成为非复制性的方法必须能适用于工业规模。在这方面，Y-照射，紫外线处理或化学剂的使用可能是有问题的。即使是热处理，也可能不容易适用于一些产品类别。[0007]此外，所希望的是与非复制性益生菌微生物的活的对应物相比，所述非复制性益生菌微生物不仅保留它们的健康效应的少部分，而且保留它们的健康效应的重要部分或全部。
[0008]本发明人处理了这些需要。
[0009]因此，本发明的目的是给本领域提供用于非常广泛的产品的组合物，其可以很容易地以工业规模生产并且包含非复制性益生菌微生物，所述非复制性益生菌微生物与它们的活的对应物相比，具有基本上相同或甚至改进的健康益处。
[0010]本发明人通过独立权利要求的主题已经实现该目的。从属权利要求进一步发展了本发明的思想。
[0011]本发明人惊奇地看到，包含通过挤出而成为非复制性的益生菌微生物或乳品起始菌株的组合物能够满足上述需求。[0012]如今挤出是在食品工业中常用的一种技术。挤出通过强制材料通过高温和/或压力区同时伴随着剪切，允许形成形状。可以调节加工参数，如热、压力、机械剪切和在经挤出的材料上任选的闪蒸及其组合以产生不同类型的最终产品。挤出允许从多种原料起始产生多种质地和形状。通常，挤出的材料包括金属、聚合物、陶瓷制品和食品。食品，如面食、点心、早餐的谷类食品、冰淇淋、糕点、甚至一些宠物食品和方便的零食，包括指状食品大部分是通过挤出生产的。
[0013]挤出机可以由控制一个或两个螺杆的电源、在原料中计量的给料机和围绕螺杆的桶组成。螺杆的设计诱发压缩、产生剪切应力并护送原料。取决于制作的产品，液体成分和水可以被注入到桶中。当食品由于产生的压力而产生自身的摩擦和热量，也可能在挤出机内发生蒸煮过程。通过用于加热的电感带和用于冷却的水循环控制桶部分的温度。最后，迫使食品成分通过成形的孔——模具，所述模具使产品成形以增加质地和形状的多样性。
[0014]挤出方法相对于其他制造方法的两个主要优点是挤出能产生非常复杂的横截面并且能以连续的工序工作。
[0015]本发明人已经发现，例如，通过人PBMC36h的温育，经挤出的长双歧杆菌(B.longum) NCC3001显示出了细胞因子产生的剂量-反应曲线。
[0016]因此，本发明的一个实施方案是包含非复制性益生菌微生物的组合物，其中所述益生菌微生物通过挤出成为非复制性的。
[0017]“非复制性”益生菌微生物包括失活的、死的、无生活力的和/或以碎片如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质存在的益生细菌。
[0018]“非复制性”指的是通过经典的平板接种方法可以检测的无生活力的细胞和/或菌落形成单位。在微生物书:James Monroe Jay, Martin J.Loessner, David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, Springer Science, New York, N.Y.790p 中概述了这些经典的平板接种方法。通常地，存活细胞的缺失可以按照以下显示:用不同浓度细菌制备物(“非复制”的样品)接种并且在适合的条件(有氧和/或厌氧空气中持续至少24小时)下培育后，在琼脂平板上没有可见的菌落或者在液体生长培养基中没有增加的浊度。
[0019]为本发明的目的将益生菌定义为“对宿主的健康或者安康有有益作用的微生物细胞制剂或者微生物细胞组分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:howshould they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0020]使用非复制性益生菌微生物的可能性提供了几个好处。可以将所述非复制性益生菌微生物容易地应用于广泛的产品。使用挤出使益生菌成为非复制性的可能性，甚至进一步地增加了仍然有生物活性的非复制性的益生菌微生物可以应用到的产品的数目。可以规避试图保持益生菌有生活力的问题，直到它们被消费或者甚至直到它们到达肠中。
[0021]此外，例如在严重的免疫受损的婴儿或幼儿中，在特殊的情况下由于患上菌血症的潜在风险，活的益生菌的使用受到限制。可以没有任何问题地使用非复制性益生菌。
[0022]另外，非复制性益生菌微生物的提供在保留健康益处的同时允许热重构。
[0023]例如可以将基质与益生菌微生物共挤出，然后可以将基质作为成分添加到广泛的产品中。本领域技术人员将能够确定适用于此类步骤的基质。
[0024]备选地，可以将益生菌微生物与原料的混合物共挤出，以直接产生最终产品。
[0025]因此，在一个实施方案中可以将益生菌微生物与组合物共挤出。[0026]任意类型的挤出方法均适用于本发明的目的。优选的挤出方法取决于所希望的组合物和最终产品的形状。本领域技术人员将能够适当地选择挤出方法。Marshall，R.T,等人(2003), Ice cream, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York;Smith, J.S.&Hui, Y.H.(2004).Food processing:principles and applications.Blackwell PublishingLtd., Oxford, UK; and Bouvier, J.-M.(2001).Breakfast cereals.1n: Robin, G.editor,Extrusion cooking:technologies and applications, Woodhead PublishingLtd., Cambridge, England;概述了挤出技术。
[0027]例如，挤出可以选自低温冷冻挤出、冷挤出、挤出蒸煮或它们的组合。
[0028]低温冷冻挤出通常用于生产冰淇淋或冷冻酸奶，并且通常在0°C至_20°C的温度范围内的温度，例如在_15°C下进行。
[0029]冷挤出可用于，例如生产面食，并且可以在20-90° C，例如，在25_40°C或60_90°C的温度范围内的温度下，在高于30重量％ (例如30-40%重量之间)的含水量下进行所述冷挤出。在工业条件下，可以以1000-8000kg/h的生产速率进行冷挤出。
[0030]挤出蒸煮可以在直接膨胀或间接膨胀条件下进行。
[0031]直接膨胀可以用于例如，生产经挤出的早餐谷类食品、宠物食品和鱼饲料。可以在高于IOO0C (例如在110。。和180°C之间)的温度和低于20重量％ (例如在16重量％和20重量％之间)的含水量下进行所述直接膨胀。在1-150巴，例如100-150巴之间的模具压力的情况下，螺杆转速可以是在200rpm和1300rpm之间，例如在200rpm和450rpm之间。
[0032]当使用间接膨胀时，挤出机可用于蒸煮生面团，之后是颗粒成形、刨片、烘烤和/或涂层。该方法可以用于生产，例如零食和早餐谷类食品。所述间接膨胀是在高于100°c的温度下和22-26重量％的范围内的含水量下进行。螺杆速度可以低于200rpm。
[0033]特别地，在冷挤出或挤出蒸煮的情况下，益生菌微生物可以提供为原料的干混合料的部分，或提供为在挤出步骤中被添加到干混合物中的湿混合物的部分。图1和图2说明了这两种方法的实例。当然，也可以将益生菌微生物添加到干混合物和湿混合物中。
[0034]因此，在一个实施方案中通过这样的方法可以获得本发明的组合物(或本发明的组合物是可获得的)，所述方法包括将益生菌微生物添加到原料中，在水的添加下挤出干混合物，并且回收经挤出的材料，其包含非复制性益生菌微生物。
[0035]在一个备选实施方案中通过这样的方法获得或可以获得本发明的组合物，所述方法包括将原料转变成干混合物，在挤出步骤中将包含水和益生菌微生物的湿混合物添加到干混合物中，并且回收经挤出的材料，其包含非复制性益生菌微生物。
[0036]两种方法的组合是可行的。
[0037]本发明的组合物可以是最终产品或可以是用于制备产品的成分。
[0038]可以在-20°C至(TC的范围内，在15。?45°C的范围内，在60°C至90°C的范围内，在90°C至130°C的范围内或在110°?180°C的范围内，例如85。C到160° C或110?130°C的温度下进行挤出步骤。在挤出步骤中的含水量可在30-40重量％或16-20重量％的范围内。在模具处的压力可以是在1-200巴的范围内，例如50-200巴，100-150巴，或者例如，55-125巴(挤出中)和1-55巴(冷挤出中)。
[0039]可以使用任何原料。原料的选择将在很宽的范围内变化并且将取决于最终产品。本领域技术人员将能够选择适当的原料[0040]例如谷物产品的原料可以包括面粉、淀粉或衍生物、糖、盐、麦芽提取物或其他甜味剂、热稳定的维生素、矿物质、调味料和/或着色剂。
[0041]宠物食品的原料可包括谷物、肉、脂质来源、维生素和/或矿物质。
[0042]面食产品的原料可包括粗面粉、粗面粉和面粉的混合物，和/或蛋黄。
[0043]冰淇淋产品的原料可以包括蛋、奶、奶油、糖和/或调味料。
[0044]冷冻酸奶产品的原料可以包括酸奶、糖和调味料。
[0045]益生菌微生物可以以每一份最终产品将包含相应于约IO6至IO12当量cfu的量的非复制性益生菌微生物的量被添加到挤出过程中。
[0046]因此，对于是其它的产品的成分的组合物，待添加的益生菌的量应当更高。
[0047]根据本发明的组合物可以包含任何有效量，例如每一份相应于约IO6至IO12当量cfu的量的非复制性益生菌微生物。
[0048]本发明的组合物包含足够至少部分产生健康益处的量的非复制性益生菌微生物。将足够实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该目的的有效量将取决于本领域技术人员已知的很多因素如体重和一般健康状况以及食品基质的影响。
[0049]在预防应用中，根据本发明的组合物以一定量施用给易感染病症或者处在该病症的风险中的人，所述量足够至少部分地降低患上这种病症的风险。这种量被定义为“预防有效剂量”。再次，该精确量取决于很多因素如健康状况和体重以及食品基质的影响。
[0050]本领域技术人员将能适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。
[0051]一般本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非复制性益生菌微生物。
[0052]通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量可以是在每日剂量约0.005mg -1OOOmg非复制性益生菌微生物范围内。
[0053]在数值的量方面，经挤出的非复制性益生菌微生物可以在组合物中以相应于IO4至IO12当量cfu/g干组合物的量存在。显然，非复制微生物不形成菌落，因此，该术语将被理解为从IO4至1012cfu/g复制细菌得到的非复制微生物的量。该非复制微生物包括灭活的、无生活力的、死的或以碎片如DNA或细胞壁或胞质化合物存在的微生物。换句话说，组合物包含的微生物的数量用该数量微生物的菌落形成能力(cfu)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考虑事实上它们是非复制的如灭活的或者死的、碎片化的或者这些状态的任一个或者全部的混合物。
[0054]优选地，非复制性益生菌微生物以相当于IO4至109cfu/g干组合物的量，更优选地以相当于IO5至109cfu/g干组合物的量存在。
[0055]非复制微生物的任何量将是有效的。然而，通常优选地，至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非复制的。
[0056]在本发明的一个实施方案中，所有微生物是非复制的。
[0057]因此，在本发明的组合物中，至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非复制的。
[0058]所有益生菌微生物可用于本发明的目的。
[0059]例如,益生菌微生物可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌、乳球菌属、肠球菌和埃希氏菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilu)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。
[0060]根据本发明的组合物可以例如包含非复制性的益生菌微生物，所述益生菌微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、乳双歧杆菌Bbl2、约汉逊氏乳杆菌NCC533、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17938、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或它们的组合。
[0061 ] 所有这些菌株按照布达佩斯条约保藏和/或可以通过商业途径得到。
[0062]按照布达佩斯条约已经保藏的菌株如下:
[0063]长双歧杆菌NCC3001:ATCC BAA-999 (分离于 1969 年 6 月)
[0064]双歧杆菌NCC2705:CNCM 1-2618 (保藏于 29.01.2001)
[0065]短双歧杆菌NCC2950:CNCM 1-3865 (保藏于 15.11.2007)
[0066]乳双歧杆菌NCC2818: CNCM 1-3446 (保藏于 OL 06.2005)
[0067]类干酪乳杆菌NCC2461: CNCM 1-2116 (保藏于 12.01.1999)
[0068]鼠李糖乳杆菌NCC4007: CGMCC1.3724 (保藏于2004年10月)
[0069]嗜热链球菌NCC2019:CNCM 1-1422 (保藏于 10.05.1994)
[0070]嗜热链球菌NCC2OM:CNCM 1-4153 (保藏于 24.04.2009)
[0071]乳乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154 (保藏于 24.04.2009)
[0072]干酪乳杆菌NCC4006:CNCM 1-1518 (保藏于 30.12.1994)
[0073]干酪乳杆菌NCC1825:ACA-DC6002
[0074]嗜酸乳杆菌NCC3009:ATCC700396
[0075]保加利亚乳杆菌NCC15: CNCM 1-1198 (保藏于 02.04.1992)
[0076]约汉逊氏乳杆菌Lal:CNCM 1-1225 (保藏于 30.06.1992)
[0077]路氏乳杆菌DSM17938: DSM17938 (保藏于 06.02.2006)
[0078]路氏乳杆菌ATCC55730: ATCC55730 (保藏于 07.12.1995)
[0079]大肠杆菌Nisslel917: DSM6601 (保藏于 11.07.1991)
[0080]命名为ATCC的菌株保藏在ATCC专利保藏中心(ATCC Patent Depository),10801University Blvd., Manassas, VA20110,美国。
[0081]命名为CNCM的菌株保藏在国立微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMESXCNCM),25rue du Docteur Roux，F_75724PARIS Cedexl5,法国。
[0082]命名为CGMCC的菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center),微生物学研究所(Institute ofMicrobiology),中国科学院(Chinese Academy of Sciences),中关村(Zhongguancun)，P.0.Box2714，北京(Beijing) 100080，中国。
[0083]命名为ACA-DC的菌株保藏在希腊协调微生物保藏中心(Greek CoordinatedCollections of Microorganisms),Dairy Laboratory, Department of Food Science andTechnology, Agricultural University of Athens,75, Iera odos, Botanikos, Athens,11855，希腊。
[0084]命名为DSM的菌株保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,德国。
[0085]本发明的组合物可以是任意组合物。例如，该组合物可选自食品、宠物食品、谷物、营养组合物、营养食品、化妆品组合物、食品添加剂、化妆品组合物、营养补剂和/或甜点。
[0086]本发明人能够证明益生菌微生物的挤出导致仍具有生物活性的非复制性益生菌微生物。特别地，与相应的活的益生菌微生物相比，所述非复制性益生菌微生物显示出增强的或新的强大的免疫刺激活性。
[0087]因此，本发明的组合物可以用于治疗或预防与受损的或受攻击的免疫系统有关的病症。
[0088]本发明还扩展到通过挤出成为非复制性的益生菌微生物在制备用于治疗或预防与受损的或受攻击的免疫系统有关的病症的组合物中的用途。
[0089]通过体外免疫作图证实非复制性益生菌的免疫增强效果。体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子作图，并且在本领域中被接受为用于免疫调节化合物测试的标准模型(Schultz 等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165-173;Taylor等 人,2006,Clinical and Experimental Allergy,36, 1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203)。
[0090]一些作者/研究团队已经使用了体外的PBMC测定，例如根据它们的免疫谱，即它们的抗-或者促-炎症特征对益生菌分类(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203)。例如，在肠结肠炎的小鼠模型中已经显示该测定允许候选益生菌抗炎效应的预测(Foligne，B.，等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在临床试验中该测定通常用作读出并且显示得到与临床结果一致的结果(Schultz等人，2003，Journalof Dairy Research70, 165-173;Taylor 等 人,2006, Clinical and ExperimentalAllergy, 36，1227-1235)。
[0091]在过去的几十年中变应性疾病已经逐步增加并且如今被WHO认为是流行病。一般来说，认为免疫系统的Thl和Th2反应之间的不平衡导致对Th2介体产生的强烈的偏向，引起变态反应。因此，可通过恢复免疫系统的Thl和Th2臂之间适当的平衡减轻、下调或者预防变态反应。这暗示了减轻Th2反应或者至少暂时地增强Thl反应的必要性。后者将是免疫增强反应的特征，常伴随着例如IFNY，TNF_a和IL-12的更高水平(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203;Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0092]因此，与受损的免疫防御相关的病症可以选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫的感染，例如呼吸道感染或胃肠道感染；吞噬细胞缺失；低到严重的免疫抑制水平，如通过应激或者免疫抑制药物、化学疗法或者放射疗法诱导的那些；免疫活性降低的免疫系统的天然状态，如新生儿或老人的免疫系统；变态反应；炎症病症以及它们的组合。
[0093]由于在新生儿或老人中免疫系统的活性通常更低，对于这些组群，本发明的组合物可能是特别有用的。
[0094]由于在学校或托儿所与其他儿童密切接触，儿童的免疫系统通常会面临很多的攻击。
[0095]儿童是直到18岁，幼儿是直到12岁，并且婴儿是少于12个月的儿童。
[0096]老人是已经超过他们的预期寿命的前3/4的人。
[0097]因此，可以将本发明的组合物施用于儿童(例如，幼儿或婴儿)、老人或宠物。
[0098]此外，由于对免疫系统的大多数攻击发生在白天，可能优选的是在早晨消费本发明的组合物以为对免疫系统的即将来临的攻击作充分的准备。
[0099]因此，可以在早晨施用本发明的组合物。
[0100]本领域的技术人员将理解他们可以自由组合本文描述的本发明的所有特征，而不背离公开的本发明范围。特别地，可将所描述的本发明的组合物的特征应用于本发明的用途中，反之亦然。
[0101]本发明其他的优点和特征从以下的实施例和附图中是明显的。
[0102]图1显示了用于产生包含非复制性益生菌微生物(将益生菌微生物以湿混合物注入到挤出机中)的经挤出的基质的方法的流程图。
[0103]图2显示了使用冷挤出产生包含非复制性益生菌微生物(将益生菌微生物以湿混合物注入到挤出机中)的经挤出的基质的方法的流程图。
[0104]图3显示了备选方法的流程图，所述方法可用于产生含有非复制益生菌微生物(益生菌微生物是干混合料的一部分)的经挤出的基质。
[0105]图4显示了将人PBMC与在130° C产生的经挤出的长双歧杆菌NCC3001样品(黑色条形)以及经挤出的对照(灰色条形)温育36小时后细胞因子产生的剂量-反应曲线。通过多重测定测量细胞因子。结果是4个个体供体的平均值+/-SEM。
[0106]图5显示了将人PBMC与经挤出的益生菌(长双歧杆菌NCC3001)以及经挤出的对照温育36小时后的细胞因子产生。在110° C (灰色条形)，120° C (阴影条形)或130° C(黑色条形)挤出细菌。经挤出的对照(空心条形)。通过多重测定测量细胞因子。结果是4个个体供体的平均值+/-SEM。
[0107]图6显示了一些经挤出样品的细胞因子谱的PCA分析结果。图例:A:BL818800rpm, B:BL818 IOOOrpm, C:BL818 1200rpm, D:BL818 85° C，E:BL818 100° C，F:BL818120。C，G:BL818 140。C，H:BL818 120。C/15’’，1:BL818 140。C/15，，，J:LPR800rpm, K:LPR1000rpm, L:LPR1200rpm, M:LPR85° C，N:LPR100° C，0:LPR120° C，P:LPR140° C，Q:LPR120° C/15’’，R:LPR140。C/15’’，S:STll 800rpm, T:ST11 IOOOrpm, U:ST111200rpm, V:ST1185。C,ff:STll 100。C，X:ST11 120。C，Y:ST11 140。C，Z:ST11 120。C/15，，，AZ:STll140。C/15，，。
[0108]图7显示了在不同的经挤出的乳双歧杆菌BL818制备物的细胞因子谱上PCA分析结果。
[0109]图8显示了在不同的经挤出的约汉逊氏乳杆菌Lal制备物的细胞因子谱上PCA分
析结果。
[0110]图9显示了在不同的经挤出的类干酪乳杆菌STll制备物的细胞因子谱上PCA分
析结果。
[0111]图10显示了在经挤出的长双歧杆菌NCC3001样品中通过光学显微镜检测细菌。
[0112]图11显示了在经挤出的样品中通过PCR分析检测细菌DNA。
[0113]材料和方法
[0114]细菌制备:
[0115]将鼠李糖乳杆菌NCC4007 (CGMCC1.3724，LPR)、类干酪乳杆菌 NCC2461 (CNCM1-2116，ST11)、乳双歧杆菌 NCC2818 (CNCM 1-3446，BL818)、约汉逊氏乳杆菌 NCC533 (CNCM1-1225，Lal)和长双歧杆菌NCC3001 (ATCC BA-999，BL999)的粉末重悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中(PBS，Sigma公司)中以达到35%的最终TS或得到包含约5X109cfu/ml的最终的湿溶液。
[0116]挤出方法:
[0117]根据表I和表2给出的配方制备大米淀粉、玉米粗面粉、磷酸氢钙、碳酸钙、麦芽糖糊精和奶粉的干混合物。使用批混合器[Prodima混合器,AC-MS (Prodima, St-Sulpice,瑞士)]将所有的成分在30分钟内混合。
[0118]表1:用于挤出(w/w百分比)的干混合物配方，
[0119]实施例1
[0120]
成分(重量％)
大米淀粉16.0 玉米粗面粉49.0 鱗酸氢钓0.2
碳酸钥0.8
麦芽糖糊精17.0
奶粉17.0
[0121]表2:用于挤出(w/w百分比)的干混合物配方，
[0122]实施例2
[0123]