雪菊抗氧化活性提取物及其制备方法【技术领域】[0001]本发明涉及雪菊提取【技术领域】，是一种雪菊抗氧化活性提取物及其制备方法。[0002]随着人们生活水平的提高，活性氧和自由基导致的各种疾病严重危害了人类的健康，已经引起了社会各界的广泛关注。近年来，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。[0003]雪菊，又名“血菊”，学名为两色金鸡菊(Coreopsis tinetoria),是菊科(Compositae)金鸡菊属一年生草本植物,主要分布于新疆和田地区海拔约3000m的昆仑山区。长期以来，昆仑雪菊被当地居民当花茶饮用，也是一种新疆常用药材。其具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾、降血压、降血脂和降血糖等功效。昆仑雪菊中含有丰富的营养成分，以及多酚、黄酮、花色素等抗氧化活性成分，在防治人类一些与自由基损伤相关的疾病以及抗衰老过程中可能起着十分重要的作用。但是目前国内外尚无高效制取雪菊抗氧化活性提取物的技术手段，因此，还未见有以抗氧化活性作为指标分离提取雪菊抗氧化活性成分的研究报道，这对雪菊资源的开发具有重要的意义。
[0004]本发明提供了一种雪菊抗氧化活性提取物及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决目前国内外尚无高效制取雪菊抗氧化活性提取物的技术手段的问题。[0005]本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种雪菊抗氧化活性提取物按下述方法得到: 第一步，将雪菊粉碎并过10目筛至50目筛得到雪菊粉碎物，向雪菊粉碎物中加入体积分数为70%至95%的乙醇水溶液提取I次至3次，每次提取的时间为0.5小时至2小时、温度为76°C至80°C，每次提取向雪菊粉碎物中加入雪菊粉碎物6倍重量份至20倍重量份的体积分数为70%至95%的乙醇水溶液，每次提取后进行过滤得到滤液，将滤液合并后进行减压浓缩，得到乙醇提取物； 第二步，在常温下向乙醇提取物中加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的水混悬后得到混悬液，再向混悬液中加入石油醚进行萃取3次至6次后得到石油醚萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的石油醚；
第三步，在常温下向石油醚萃余液中加入三氯甲烷进行萃取3次至6次后得到三氯甲烷萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的三氯甲烷；
第四步，在常温下向三氯甲烷萃余液中加入乙酸乙酯进行萃取3次至5次后得到乙酸乙酯萃取液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥后得到乙酸乙酯萃取物；
第五步，将乙酸乙酯萃取物用大孔树脂吸附，再用体积浓度为10%至70%的乙醇水溶液进行洗脱，收集流份，进行减压浓缩并干燥后得到雪菊抗氧化活性提取物。
[0006]下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进:上述第一步中，将滤液合并后进行减压浓缩至乙醇提取物中的质量含水量为40%至50%;或/和，第一步中，减压浓缩在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行。
[0007]上述第四步中，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的乙酸乙酯萃取物；或/和，减压浓缩是在50°C至70°C、-0.06Mpa至-0.1Mpa下进行的；或/和，第四步中，干燥是在温度为-60°C至_40°C、压力为OMpa至0.0IMpa的真空冷冻干燥机内，或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的。
[0008]上述第五步中，将乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂吸附，用AB-8大孔树脂吸附时上柱液流速为1.4 bv/h至1.7 bv/h,再用体积浓度为40%至50%的乙醇水溶液以1.4 bv/h至1.7 bv/h的流速进行洗脱；或/和，第五步中，将收集的流份进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的雪菊抗氧化活性提取物；或/和，第五步中，减压浓缩是在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行的；或/和，第五步中，干燥是在温度为_60°C至_40°C、压力为OMpa至0.01Mpa的真空冷冻干燥机内或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的；或/和，第五步中，用乙醇水溶液进行洗脱时，乙醇水溶液的体积浓度分别为10%或30%或50%或70%。
[0009]本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的:一种雪菊抗氧化活性提取物的制备方法，按下述步骤进行:第一步，将雪菊粉碎并过10目筛至50目筛得到雪菊粉碎物，向雪菊粉碎物中加入体积分数为70%至95%的乙醇水溶液提取I次至3次，每次提取的时间为0.5小时至2小时、温度为76 V至80°C，每次提取向雪菊粉碎物中加入雪菊粉碎物6倍重量份至20倍重量份的体积分数为70%至95%的乙醇水溶液，每次提取后进行过滤得到滤液，将滤液合并后进行减压浓缩，得到乙醇提取物；
第二步，在常温下向乙醇提取物中加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的水混悬后得到混悬液，再向混悬液中加入石油醚进行萃取3次至6次后得到石油醚萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的石油醚；
第三步，在常温下向石油醚萃`余液中加入三氯甲烷进行萃取3次至6次后得到三氯甲烷萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的三氯甲烷；
第四步，在常温下向三氯甲烷萃余液中加入乙酸乙酯进行萃取3次至5次后得到乙酸乙酯萃取液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥后得到乙酸乙酯萃取物；
第五步，将乙酸乙酯萃取物用大孔树脂吸附，再用体积浓度为10%至70%的乙醇水溶液进行洗脱，收集流份，进行减压浓缩并干燥后得到雪菊抗氧化活性提取物。
[0010]下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进:
上述第一步中，将滤液合并后进行减压浓缩至乙醇提取物中的质量含水量为40%至50%;或/和，第一步中，减压浓缩在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行。
[0011]上述第四步中，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的乙酸乙酯萃取物；或/和，减压浓缩是在50°C至70°C、-0.06Mpa至-0.1Mpa下进行的；或/和，第四步中，干燥是在温度为-60°C至_40°C、压力为OMpa至0.0IMpa的真空冷冻干燥机内，或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的。[0012]上述第五步中，将乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂吸附，用AB-8大孔树脂吸附时上柱液流速为1.4 bv/h至1.7 bv/h,再用体积浓度为40%至50%的乙醇水溶液以1.4 bv/h至1.7 bv/h的流速进行洗脱；或/和，第五步中，将收集的流份进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的雪菊抗氧化活性提取物；或/和，第五步中，减压浓缩是在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行的；或/和，第五步中，干燥是在温度为_60°C至_40°C、压力为OMpa至0.01Mpa的真空冷冻干燥机内或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的；或/和，第五步中，用乙醇水溶液进行洗脱时，乙醇水溶液的体积浓度分别为10%或30%或50%或70%。
[0013]本发明获得的雪菊抗氧化活性提取物在DPPH、ABTS自由基清除和还原能力的实验结果表明，根据本发明实施例得到的雪菊抗氧化活性提取物具有较好的抗氧化作用，并且本发明工艺简单方便操作，提取过程安全可靠，是一种能够有效提取雪菊抗氧化活性提取物的工艺方法。



[0014]附图1为本发明中10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc对
还原能力测定结果曲线图。

[0015]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例1，一种雪菊抗氧化活性提取物按下述制备方法得到:第一步，将雪菊粉碎并过10目筛至50目筛，加入雪菊6倍重量份至20倍重量份的体积分数为70%至95%的乙醇水溶液，浸泡至透心，提取I次至3次，每次提取0.5小时至2小时，每次提取的温度为76°C至80°C，每次提取后进行过滤得到滤液，将滤液合并后进行减压浓缩，得到乙醇提取物；第二步，在常温下向乙醇提取物中加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的水混悬后得到混悬液，再向混悬液中加入石油醚进行萃取3次至6次后得到石油醚萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的石油醚，此处所用的水为纯净水；第三步，在常温下向石油醚萃余液中加入三氯甲烷进行萃取3次至6次后得到三氯甲烷萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的三氯甲烷；第四步，在常温下向三氯甲烷萃余液中加入乙酸乙酯进行萃取3次至5次后得到乙酸乙酯萃取液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份至4倍重量份的乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥后得到乙酸乙酯萃取物；第五步，将乙酸乙酯萃取物用大孔树脂吸附，再用体积浓度为10%至70%的乙醇水溶液进行洗脱，收集流份，进行减压浓缩并干燥后得到雪菊抗氧化活性提取物。
[0017]实施例2，一种雪菊抗氧化活性提取物按下述制备方法得到:第一步，将雪菊粉碎并过10目筛或50目筛得到雪菊粉碎物，向雪菊粉碎物中加入体积分数为70%或95%的乙醇水溶液提取I次或3次，每次提取的时间为0.5小时或2小时、温度为76°C或80°C，每次提取向雪菊粉碎物中加入雪菊粉碎物6倍重量份或20倍重量份的体积分数为70%或95%的乙醇水溶液，每次提取后进行过滤得到滤液，将滤液合并后进行减压浓缩，得到乙醇提取物；第二步，在常温下向乙醇提取物中加入乙醇提取物I倍重量份或4倍重量份的水混悬后得到混悬液，再向混悬液中加入石油醚进行萃取3次或6次后得到石油醚萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份或4倍重量份的石油醚；第三步，在常温下向石油醚萃余液中加入三氯甲烷进行萃取3次或6次后得到三氯甲烷萃余液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份或4倍重量份的三氯甲烷；第四步，在常温下向三氯甲烷萃余液中加入乙酸乙酯进行萃取3次或5次后得到乙酸乙酯萃取液，每次萃取加入乙醇提取物I倍重量份或4倍重量份的乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥后得到乙酸乙酯萃取物；第五步，将乙酸乙酯萃取物用大孔树脂吸附，再用体积浓度为10%或70%的乙醇水溶液进行洗脱，收集流份，进行减压浓缩并干燥后得到雪菊抗氧化活性提取物。
[0018]实施例3，作为上述实施例的优选，第一步中，将滤液合并后进行减压浓缩至乙醇提取物中的质量含水量为40%至50% ;或/和，第一步中，减压浓缩在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行。
[0019]实施例4，作为上述实施例的优选，第四步中，将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的乙酸乙酯萃取物；或/和，减压浓缩是在50°C至70°C、_0.06Mpa至-0.1Mpa下进行的；或/和，第四步中，干燥是在温度为_60°C至_40°C、压力为OMpa至0.01Mpa的真空冷冻干燥机内，或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的。
[0020]实施例5，作为上述实施例的优选，第五步中，将乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂吸附，用AB-8大孔树脂吸附时上柱液流速为1.4 bv/h至1.7 bv/h,再用体积浓度为40%至50%的乙醇水溶液以1.4 bv/h至1.7 bv/h的流速进行洗脱；或/和，第五步中，将收集的流份进行减压浓缩并干燥得到质量含水量为5.5%至6.9%的雪菊抗氧化活性提取物；或/和，第五步中，减压浓缩是在温度为50°C至70°C、压力为-0.06Mpa至-0.1Mpa条件下进行的；或/和，第五步 ，干燥是在温度为-60°C至_40°C、压力为OMpa至0.0IMpa的真空冷冻干燥机内或是在进风温度130°C至190°C、出风温度30°C至90°C的喷雾干燥下进行的；或/和，第五步中，用乙醇水溶液进行洗脱时，乙醇水溶液的体积浓度分别为10%或30%或50%或 70%ο
[0021]测定根据本发明上述实施例方法得到的雪菊抗氧化活性提取物的抗氧化能力:
按照本发明上述实施例的方法，将乙酸乙酯萃取物用大孔树脂吸附后分别用体积浓度
为10%、30%、50%和70%的乙醇水溶液进行洗脱后得到的雪菊抗氧化活性提取物的抗氧化能力进行测定，并分别与阳性对照品BHT和Vc进行比较，下述实验过程中，体积浓度为10%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物简称10%提取物、体积浓度为30%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物简称30%提取物、体积浓度为50%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物简称50%提取物、体积浓度为70%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物简称70%提取物。
[0022]、DPPH自由基清除率测定:
将 10% 提取物用无水甲醇配置成 0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml不同浓度的溶液，将30%提取物用无水甲醇配置成0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml 不同浓度的溶液，将 50% 提取物用无水甲醇配置成 0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.0 lmg/ml、0.02mg/ml不同浓度的溶液，将70%提取物用无水甲醇配置成0.002mg/ml、0.004mg/ml>0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml>0.015mg/ml、0.02mg/ml 不同浓度的溶液，将 BHT 用无水甲醇配置成 0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml不同浓度的溶液，将Vc用无水甲醇配置成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml 不同浓度的溶液，分别取 2mL 不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc分别加入2mL DPPH甲醇溶液，混匀，室温下避光反应30 min，在517nm处测定吸光度，每种不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc平行测三次，取平均值，BHT和Vc作为参照品，计算清除率。
[0023]清除率％= (1-Asample / Acontrol) X 100%
式中，Asample是不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc的吸光度，Acontrol是DPPH本底的吸光度，实验结果见表1。
[0024]由表1可见，10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物对DPPH自由基均有一定的清除作用，30%乙醇洗脱物和50%乙醇洗脱物对DPPH自由基均有较好的清除能力，其中，10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物清除DPPH自由基的能力优于阳性对照品BHT、与Vc接近，并且50%提取物对DPPH自由基清除能力远大于阳性对照品BHT和Vc，其 IC5tl 为 3.2lug/ml。
[0025]、ABTS自由基清除率测定:
将 10% 提取物用无水甲醇配置成 0.03mg/ml、0.05mg/ml、0.07mg/ml、0.lmg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml不同浓度的溶液，将30%提取物用无水甲醇配置成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0 .06mg/ml、0.08mg/ml、0.lmg/ml>0.2mg/ml、0.3mg/ml 不同浓度的溶液，将50% 提取物用无水甲醇配置成 0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08 mg/:ml、0.lmg/ml不同浓度的溶液，将70%提取物用无水甲醇配置成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.lmg/ml不同浓度的溶液，将BHT用无水甲醇配置成0.02mg/ml、0.04mg/ml>0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.lmg/ml不同浓度的溶液，将Vc用无水甲醇配置成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.lmg/ml不同浓度的溶液，分别取2mL不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc分别加入2mL DPPH甲醇溶液，混匀，室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度，每种不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc平行测三次，取平均值，BHT和Vc做为参照品，计算清除率。
[0026]清除率％= (1-Asample / Acontrol) X 100%
式中，Asample是不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc的吸光度，Acontrol是ABTS本底的吸光度，实验结果见表1。
[0027]由表1可见，10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物对ABTS自由基均有一定的清除作用。其中，50%提取物、70%提取物优于阳性对照品Vc、与BHT接近，并且50%提取物对ABTS自由基的清除能力大于阳性对照品Vc和BHT，其IC5tl为0.06288 mg/ml。
[0028]、还原能力测定:
以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3]之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3Fe(CN)6]还原成K4Fe (CN)6，再利用Fe3+形成Fe4 (Fe(CN)6)3,由700 nm处吸光值变化检测还原力大小，吸光值愈高表示样品的还原力愈强。
[0029]将10% 提取物用无水甲醇配置成 0.002mg/ml,0.004mg/ml,0.006mg/ml,0.008mg/ml、0.01mg/ml>0.015mg/ml、0.02mg/ml不同浓度的溶液，将30%提取物用无水甲醇配置成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.0 lmg/ml >0.015mg/ml、0.02mg/ml 不同浓度的溶液，将50%提取物用无水甲醇配置成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml>
0.008mg/ml、0.01mg/ml>0.015mg/ml、0.02mg/ml 不同浓度的溶液，将 70% 提取物用无水甲醇配置成 0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.0 lmg/ml >0.015mg/ml、
0.02mg/ml不同浓度的溶液，将BHT用无水甲醇配置成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.01mg/ml>0.015mg/ml、0.02mg/ml 不同浓度的溶液，将 Vc 用无水甲醇配置成 0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.0 lmg/ml >0.015mg/ml、0.02mg/ml不同浓度的溶液，各取2.5mL不同浓度的10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT 和 Vc，分别加入 2.5mL PBS (0.2mol/ml,pH=6.6) ,2.5mL 质量浓度为 1% 的 K3Fe(CN)6溶液，于50°C水浴中恒温20 min，快速冷却，加2.5ml质量浓度为10%的三氯乙酸溶液，3000r / min离心10 min,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸懼水、0.5ml质量浓度为0.1%的三氯化铁溶液，混匀后静置10 min，在700 nm下测吸光度。所有测定平行进行三次，取平均值。
[0030]实验结果:一般情况下，样品的还原力与抗氧化活性有明显的相关性，还原能力越强，表明抗氧化能力越强，在测定浓度范围内，10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物均显示出一定的还原能力，且还原能力与提取物浓度呈明显的量效关系，50%提取物浓度为0.1 mg/mL时吸光度值与阳性对照Vc接近，为1.453。
[0031 ] 附图1为本发明中10%提取物、30%提取物、50%提取物、70%提取物、BHT和Vc对
还原能力测定结果曲线图。
[0032]综上所述，本发明 主要从三个方面验证了雪菊抗氧化活性提取物的抗氧化活性作用，结果显示根据本发明上述实施例得到的雪菊抗氧化活性提取物具有较好的抗氧化活性作用，尤其是用体积浓度为50%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物，与对照品Vc和BHT相比，用体积浓度为50%乙醇水溶液进行洗脱得到的雪菊抗氧化活性提取物的抗氧化效果均优于Vc和BHT，因此，根据本发明上述实施例得到的雪菊抗氧化活性提取物具有较好的抗氧化活性作用具有较好的抗氧化作用，可以用于制备抗氧化保健品。
[0033]本发明获得的雪菊抗氧化活性提取物在DPPH、ABTS自由基清除和还原能力的实验结果表明，根据本发明实施例得到的雪菊抗氧化活性提取物具有较好的抗氧化作用，并且本发明工艺简单方便操作，提取过程安全可靠，是一种能够有效提取雪菊抗氧化活性提取物的工艺方法。
[0034]表1.清除DPPH、ABTS自由基的IC5tl值