质子泵抑制剂的新应用的制作方法[0001]本申请是申请日为2005年2月14日的中国专利申请200580012362.1的分案申请。[0002]本发明提供质子泵抑制剂，诸如奥美拉唑，在抗肿瘤治疗中的应用。[0003]现有的抗肿瘤方法已经表现出低水平的抗实体瘤的功效，以及高的体内全身性毒性，并且存在对于具有低全身性毒性的新的抗肿瘤方法的需要。[0004]我们最近的数据表明肿瘤的恶性和入侵性与两种主要机制相关:(i)异常的吞噬活性(Lugini等,2003);和，(ii)释放能够通过Fas-介导的凋亡机制杀死淋巴细胞的外来体(Andreola等，2002)。可以想象一种普通机制联系这两种机制，其可能包括强酸化小泡的运输，属于强大的溶酶体网络。对肌动蛋白细胞骨架与溶酶体膜联系的抑制可以消弱这些肿瘤功能。[0005]在癌症细胞内，已经研究pHi (细胞内pHi)对于细胞生长、细胞运动性、肿瘤发生、转移和程序性细胞死亡的影响(Perona等，1988 ；Schlappack等，1991 ；Gottlieb等，1995 ；Helmlinger 等，1997 ;Martinez_Zaguilan 等.,1998)。[0006]实体瘤的微环境包含低氧合和高酸性的区域。来自临床和实验研究的越来越多的证据指出酸性肿瘤微环境在转移进展中的重要作用(Subarsky和Hill, 2003)。减少的p02,酸度和营养的缺乏改变基因表达。在血管发生，组织重塑和存活中起作用的基因是肿瘤细胞存活所必需的，并且，在转移进展中起关键作用(Subarsky和Hill，2003)。[0007]实体瘤的细胞外(间质的)pH比正常组织的pH显著更酸(Izumi H等，2003)。尽管数据有限，在人体中的PH测定表明肿瘤和正常组织之间的差异(Tannock和Rotinl989)。并且，酸性的细胞内细胞器也可以参与对化学治疗药物的抗性(Altan等，1998 ；Hurwitz等，1997 ；Schindler 等，1996 ；Larsen 等，2000 ;Raghunand 等，1999 ；0uar 等，1999)，因此赋予肿瘤细胞累积的整体选择优势。[0008]已经提议将肿瘤所显示的酸性作为区分肿瘤组织和健康组织的潜在有用的工具。可能的肿瘤功能，其中细胞外环境和溶酶体区室的酸化可以具有作用，包括:(i)通过酸性直接损伤淋巴细胞功能(Ratner和Heppner, 1985);和，(ii)提高能够钝化和/或螯合化学治疗药物的化学/物理屏障(Altan等.，1998)。
[0009]可以想到的是，肿瘤细胞的酸性的肿瘤微环境，以及高度有效的肿瘤溶酶体区室，合起来可以代表一种消化系统，其允许肿瘤细胞通过细胞外基质的方式以死亡细胞为食(Lugini等，2003)。因此，可能肿瘤微环境酸化表现出整体选择优势。
[0010]在肿瘤细胞中，液泡型H+腺苷三磷酸酶(VH+ATP酶)，一类活性H+转运蛋白的增强的表达和活性可以在肿瘤细胞外微环境和细胞内酸性区室的酸化中起关键作用。
[0011]癌症细胞的酸性微环境还与多药耐药性相关。对化疗药物的抗性是癌症患者中治疗失败的主要原因，并且可以由生化和/或生理机制引起。生化机制包括赋予抗性的蛋白，诸如例如，P-糖蛋白(P-gp)，一种质膜药物流出转运蛋白的过量表达。生理抗性包括肿瘤微环境，并且可以由胞内和/或胞外pH的改变引起。
[0012]在体外，低pH减少弱碱性化学治疗药物的吸收，并且因此，减少它们的细胞毒性(Raghunand等,1999)。已经假定该现象在体内有利于对弱碱性药物的‘生理’抗性,并且在动物模型中获得的数据显示，碳酸氢盐诱导的细胞外碱化作用导致包括多柔比星在内的一些化学治疗药物在体外和体内抗人肿瘤细胞的治疗功效的显著提高(Raghunand等，2003 ；Mahoney等，2003)。模型系统中的研究已经证明肿瘤pH会是治疗反应的决定因素。
[0013]酸性细胞内细胞器还可以参与对化学治疗药物的抗性(Altan等，1998 ；Hurwitz等，1997 ；Schindler 等，1996 ；Larsen 等,2000 ；Raghunand 等，1999 ；0uar 等，1999)。酸性小泡的转换可以代表药物抗性中，特别是在不过量表达质膜结合药物泵，诸如P-糖蛋白的细胞中的重要因子。实际上，一些数据表明，化学治疗药物通过药物敏感细胞的细胞质和核质分配，但是被排斥在药物抗性细胞的细胞核外(Altan等，1998 ；Hurwitz等，1997 ；Schindler 等，1996 ；Larsen 等，2000 ；Raghunand 等，1999 ；0uar 等，1999)。实际上，一些报道表明溶酶体型小泡的增加的酸化因此与药物抗性相关，并且与下述假说一致，即在酸性细胞器中药物的螯合以及随后通过分泌途径从细胞内排出有利于化学治疗的抗性(Schindler 等，1996 ；Hurwitz 等，1997 ；Cleary 等，1997 ；Altan 等，1998 ；Raghunand 等，1999 ;0uar 等，1999 ;Bour_Dill 等，2000 ;Larsen 等，2000)。并且，一些最近的发现表明，在具有扩大的酸性溶酶体区室的MDR细胞中，消弱弱碱性化学治疗药物的酸性-pH-依赖型聚集的抗溶酶体剂可以逆转蒽环霉素抗性(Ouar等，2003)。
[0014]液泡H+-ATP酶(V-H+-ATP酶)是一类在许多细胞区室中涉及pH控制的转运蛋白。在真核生物中，该流出泵家族具有许多功能，并且在包括一些人肿瘤细胞在内的许多细胞类型中广泛地表达(Beck, 1987 ;Vaananen等.，1990 ；Marquardt等，1991 ；Martinez-Zaguilan, 1993 ；Moriyama, 1996 ；Murakami 等.,2001)。这些 ATP 酶进行从细胞质区室到膜的对侧的ATP-依赖型质子转运，其又可以由细胞内细胞器的腔或细胞外空间所代表。
[0015]质子泵抑制剂(PPIs)，包括奥美拉唑及其类似物，诸如依美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑，特异性地抑制负责从细胞质穿过质膜(到细胞外空间)或穿过液泡膜(到酸性小泡的腔)的H+离子的活性转运的泵。这些分子是目前用于治疗消化性疾病的症状的药物。
[0016]JP2003277262公开用作消化道内抗癌剂的兰索拉唑和酯类混合物的组合，其中所述酯类增加了兰索拉唑的生物利用度。
[0017]JP2001286284公开V-ATP酶的一种肽亚单位以及具有PPI活性的针对其的抗体。由于V-ATP酶与肿瘤相关，所以推测这些抗体可能具有抗癌活性。
[0018]W002/080917公开在包括疟疾和癌症的病症中，质子泵抑制剂用于治疗诱导的多药耐药性(MDR)的应用。建议同时施用质子泵抑制剂和抗癌剂。诱导的MDR与特征性蛋白表达，诸如蛋白转运蛋白，包括ABC蛋白转运蛋白相关。没有研究与这样的表达不相关的固有抗性，并且所述固有抗性为癌症治疗中不可忽视地更加严重的问题。该作者报道使用PPI和药物，诸如多柔比星或长春新碱，的同时治疗明显导致了肿瘤细胞药物敏感性的稍微增加。
[0019]EP0567643公开许多新型抗溃疡剂，并且作者推测这些药剂可能还具有抗癌活性，尽管没有支持这一推测的数据存在。
[0020]令人惊讶地，现在我们已经发现质子泵抑制剂本身能够发挥对实体瘤的抗肿瘤作用，并且当被用作预治疗时，它们能够基本上完全地恢复对于这些肿瘤的药物敏感性，在所述肿瘤中存在抗性。
[0021]因此，在第一方面，本发明提供PPI在制备用于治疗癌症病症的药物中的应用。
[0022]优选要治疗的癌症，或肿瘤的病症为肿瘤，并且还优选所述肿瘤是转移性的，或者存在所述肿瘤是或将要转移的明显的可能性，如例如，有经验的医师所诊断的那样。
[0023]如上文所述，特别是转移性肿瘤在细胞内和细胞外都与酸性条件相关，并且已经发现，令人惊讶地，奥美拉唑和其它PPIs能够发挥对这些肿瘤的系统效应。
[0024]能够在施用PPI之前和之后评估肿瘤的pH是有利的，因为这可以帮助有经验的医师确定最适于治疗个体患者的PPI的量和类型。这样的监测还为体内测定PPI治疗对肿瘤pH的直接作用作准备。
[0025]实际上，在随附实施例中，我们提供使用衍生于各种组织学的肿瘤的人细胞系的体外实验，和将同样的肿瘤细胞移植到重度联合免疫缺损(SCID)的小鼠中的体内实验的结果(Lozupone等，2000 ；2003 ；2004印刷中)，并且显示:(i)奥美拉唑以剂量依赖型方式对于在微酸性培养基中培养的肿瘤细胞具有细胞毒性；(ii)其对于在缓冲的培养基中培养的同样的肿瘤细胞没有毒性；(iii)使用奥美拉唑或其类似物对人-SCID的体内治疗能够显著地减少肿瘤生长，和(iv)使用奥美拉唑预治疗一般能够逆转，通常基本上完全地逆转多药耐药性(MDR)。
[0026]PPIs表现出重要的化学特征，其中，作为弱碱，它们在酸性区室中聚集，并且通过质子化作用激活，发挥它们作为质子泵抑制剂的功能。因此，它们通常聚集在胃部。
[0027]质子泵抑制剂(PPIs)已经作为用于治疗患有酸相关疾病的患者的选择药物种类而出现，其中所述酸相关疾病包括胃食管反流疾病、十二指肠和胃溃疡。这些药剂通过革巴向胃酸泵抑制胃酸分泌(Larsson等，1985 ;WalImark等，1985 ；Puscas等，1999 ；Horn2000)。PPIs (典型地奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑)是共享相似核心结构的取代的2-卩比唳基甲基亚横酸苯并咪唑(2-pyridyl methylsulphinyl benzimidazole)(Horn2000)。这些药剂是可质子化的弱碱，具有?4的pKa值，并且因此，选择性地在pH < 4的酸性空间中聚集。在这样的酸性环境中，卩比唳和苯并咪唑氮(benzimidazole nitrogens)的质子化作用导致形成四环次磺酰胺，其代表所述药物的活性形式(Horn2000)。
[0028]因此，优选的PPI’s是2-吡啶基甲基亚磺酰苯并咪唑PPI’S，特别地是奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑。
[0029]在一方面，优选治疗非消化道癌的癌症疾病。在另一方面，优选不使用兰索拉唑，特别是在癌症疾病与消化道相关的情形。
[0030]尽管肿瘤细胞能够在中性、缓冲的培养基中存活，我们惊讶地发现，当在肿瘤细胞中使用PPIs阻断由液泡型H+-ATP酶的表达和活性诱导的pH波动时(更低的细胞外、更低的液泡内PH和更高的细胞质pH)，可以控制甚至杀死这些肿瘤。
[0031]特别令人惊讶地，当摄食后在胃中，不管预计是结合还是螯合，PPIs能够对肿瘤发挥系统效应。然而，例如，为了任何酸性胃条件不必减少任何口服施用的PPI的效力，优选与解酸药联合施用PPI。因此，优选给患者施用足够的解酸药，以促进PPI的吸收。这样的剂量可以是由有经验的医师容易地确定的任何剂量，但是，作为指导，可以是例如，由制造商推荐的治疗酸反流的量。应该理解在本文提及奥米拉唑，或者PPI的情形中，那么任一术语涉及有效用于本发明中的任何PPI，除非其它显而易见的意思。同样地，在涉及术语“肿瘤”的情形中，这同样地应用于本发明应用的任何癌症疾病，除非另外指出或者显而易见，并且特别地是与酸性微环境相关的癌症疾病。
[0032]PPI可以以任何有效发挥抗肿瘤作用的量施用。例如，一般地，这可以是与治疗胃溃疡所用的大致相同的量。对于奥美拉唑，可接受的剂量一般为20-40mg/天。对于其它类似物，该剂量可以增加一例如，泮托拉唑可以典型地以40-80mg/天进行施用。然而，即使560或2400mg/天的过量剂量也没有表现出相当大的或者稳定的副作用。
[0033]例如，应该理解，所用的PPI的量可以随患者及其病症而不同，如对有经验的医师显而易见的那样，并且可以典型地向上变化，例如，特别地如果患者患有没有用解酸药治疗的消化性疾病。所述PPI可以以常规形式适当地施用，如制造商提供的那样，这些形式特别包括适于口服施用的任何形式，其包括片剂、胶囊和锭剂，例如，以及延缓的和持续的释放制剂。
[0034]为了抑制胃中的酸分泌，由此增加能够到达肿瘤位点的PPI浓度，并且使残留在胃中的浓度最小，一般地优选使用另外的解酸药或抗酸药物预治疗肿瘤患者，所述解酸药诸如碳酸钙，所述抗酸药物诸如H2-受体拮抗剂，例如雷尼替丁或西咪替丁。因此，使用解酸药治疗有效地增加PPI向酸性肿瘤的递送，因为基本上减少了体内仅有的酸性位点的数目，或者至少暂时性地中和或改善了最显著的位点。
[0035]为了避免胃及其可能具有的稀释作用，治疗还可以通过其它途径进行。可以接受任何其它适当的途径，并且这可以包括吸入剂、滴眼剂、阴道栓剂、延迟释放的片剂、贴片、栓剂、导管和注射剂，诸如腹膜内(1.P.)、肌内(1.m.)或静脉内(1.v.)注射剂。任何这样的制剂可以按需要制备，并且可以典型地含有任何对所述制剂适宜的成分，诸如赋形剂、稳定剂、乳化剂、调味剂、杀菌剂和抗菌剂。
[0036]一般地，在肿瘤治疗中，所述PPI药物似乎同样有效。特别优选的是奥美拉唑、依美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑，其中奥美拉唑是更加优选的。任何药物可以含有一种或多种PPI作为活性成分。
[0037]在已经变得或者就是为其它药物难以治疗的肿瘤的治疗中，已经发现PPIs令人惊讶地有效。特别地，我们已经发现，当使用PPI预治疗时，具有MDR表型的肿瘤失去其药物抗性，或者抗性被显著地减少。这样的预治疗看来妨碍所述抗性肿瘤的酸化作用，使得肿瘤暴露于被选定用于其治疗的药物的作用中，所述酸化作用还看来可能提高药物抗性。这一结果是完全出乎意料的。
[0038]特别令人惊讶的是，在所有测试的药物中，所述作用似乎没有局限在微碱性药物，但是似乎提高穿过光谱的抗性，并且恢复功效，而不管药物类型如何。也似乎是这种情形的是，不使用PPI预先治疗的同时治疗没有效果或有非常小的有用功效，和所述肿瘤需要进行预治疗以恢复敏感性。
[0039]当与另一种抗癌药物诸如顺钼同时施用时，PPI缺乏功效的原因还不清楚，但是在随附实施例中得以清楚地证明。预治疗产生良好的结果，但是没有预治疗和只有同时进行PPI治疗的结果与没有PPI存在的对照相当。不被理论所局限，似乎可能的是，药物诸如顺钼具有与PPI相反的作用，并且激活酸化ATP酶，由此中和PPI的作用，如果所述PPI尚没有机会生效的话。还可能的是，假定绝大多数的抗癌药物是弱碱，并且同PPI’s—样需要质子化以被激活，那么在酸性肿瘤环境中，两种药物竞争螯合。
[0040]因此，在癌症的联合治疗中，在PPI与第二种或其它抗癌药物联合使用的情形中，患者应该在施用第二种或其它抗癌药物之前用PPI预治疗，其可以是标准的癌症治疗。使用PPI的这种治疗可以是一种或者一系列治疗，或者连续治疗，诸如通过导管或透皮贴片，在前一天左右的时间里(over the prev1us day or so),通过任何适当的方式,诸如口服、全身性或局部施用。时间的长度不是特别重要的，条件是PPI有机会作用，并且当施用其它抗癌药物时，PPI的作用仍然存在，在这种情况下，在随后治疗时，仍然至少部分破坏了酸性环境。
[0041]因此，在另一方面，本发明提供质子泵抑制剂在制备用于联合治疗癌症疾病的药物中的应用，其中所述质子泵抑制剂药物在联合治疗之前进行施用。
[0042]在这样的应用中，特别优选所述施用充分先于联合治疗之前，以便减少与所述疾病的位点相关的酸度。在联合治疗施用之前的周期优选地为介于30分钟和3天之间。优选地，在施用联合治疗之前，一次或多次施用PPI，第一次施用在治疗前至少一天，并且优选地接着在联合治疗之前2到12小时进行另一次施用。
[0043]为了允许PPI的最大效果，大约24小时的预治疗周期可以是合适的，但是优选PPI在治疗前至少I小时施用，并且优选至少2或更多小时。由于已经发现PPI对肿瘤酸度的作用持续少数几天，诸如2或3天，所以一旦开始，所述治疗不需要必定是连续的。然而，由于PPI治疗是安全的，一般只优选连续进行治疗。
[0044]在治疗期间PPI可以与其它药物一起连续地施用，但是优选作为治疗方案的一部分施用其，其中比方说在其它药物之前6-24小时的期间给予使用PPI的治疗，接着施用其它药物，对于药物适当地重复周期，否则肿瘤对所述药物将产生抗性。在这种通常要基于每日施用的情形中，所述PPI可以在连续的基础上，或者比方说在药物之前6小时有效地施用。
[0045]其它药物的实例，针对其的抗性可以被PPIs克服，包括:其中MDR似乎与流出泵蛋白相关的那些药物，其包括；长春花生物碱，诸如长春碱、长春新碱、长春瑞滨和长春地辛；紫杉烷类，诸如紫杉醇和多西他赛；蒽环霉素类，诸如多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星；蒽类，诸如bisanthrene和米托蒽醌(mitoxanthrene);表鬼白毒素,诸如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱，诸如托泊替康和伊立替康/sn38 ;重金属氧负离子(oxyan1ns)，诸如亚砷酸盐和三价锑；放线菌素d ;丝裂霉素c ;甲氨喋呤；三甲曲沙；安吖啶；imitinib ;和美法仑；以及其中MDR似乎与蛋白介导的流出泵不相关的那些药物，其包括5-氟尿嘧啶(5-fu)和顺钼。
[0046]应该理解，尽管PPI’ s具有抗癌活性，但是当用作联合治疗的一部分时，一般地，重要的是其减少对另一种抗癌药物的药物抗性的能力，尽管任何累积的抗癌作用只会是有益的。
[0047]因此，在备选方面，本发明提供PPI在制备用于在患者中治疗对一种或多种抗肿瘤药物有抗性的癌症疾病的药物中的应用，其中所述患者具有药物的亚有效(sub-effective)水平,所述疾病对于所述药物具有抗性。在这样的情形中，患者可以进行用于癌症疾病的药物的疗程，并且PPI的施用是这样安排时间的，以便当其它抗癌药物水平充分下降足以允许PPI具有这样的作用时，PPI具有对肿瘤酸性微环境的作用。考虑到大多数抗癌药物的毒性作用，常规地允许患者在施用之间恢复，以便本领域那些技术人员容易发现并且确定机会的窗口(windows)。在2或3天后PPI’s继续具有需要的作用也是有帮助的，以致患者可以容易地在抗癌药物的下一疗程的前一天服用适量的PPI。
[0048]因此，在上下文中，"亚有效"是指，在施用时，或者在当足够的PPI全身性有效的后续阶段，药物水平不足以阻止PPI减少MDR的作用。优选地，应该允许疾病所抗的药物水平至少在短期内下降到可以忽略的水平，在这段时间期间，优选地施用PPI并且其可以作用。
[0049]例如，本发明还有效用于这样的疾病诸如AIDS的治疗，其可以变得对高度活性的抗逆转录病毒治疗(HAART)敏感(refractive)。此外，优选地在先前的HAART施用后足够的时间施用PPI，以便每种治疗对疾病病症的作用不相抵触。
[0050]因此，本发明还提供PPI在制备用于治疗药物抗性疾病病症的药物中的应用，特别当所述疾病病症是AIDS的情形，并且特别当所述抗性是针对HAART的情形。
[0051]适于按照本发明的治疗的其它潜在的药物抗性疾病病症及其治疗包括例如，一些慢性疾病的抗炎治疗，所述慢性疾病诸如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或局限性回肠炎。认为最适合的是在所述抗炎治疗基于皮质留类的应用的情形中，已知皮质留类产生抗性。因此，PPI的作用还可以改善基于皮质留类治疗的顺应性，减少由于高剂量或者延长的治疗方案引起的药物相关的副作用。
[0052]本发明还有效用在长期治疗和癌症疾病的治疗中，以及这些疾病的预防中。例如，他莫昔芬用于在被认为有高风险患乳腺癌的妇女中预防乳腺癌，以及用于在已经治愈了乳腺癌的个体中继续进行治疗，以防止复发。特别地，存在关于他莫昔芬增加细胞内PH的证据。
[0053]在经受正在进行的治疗的个体中，发展抗性的风险被增加了，以致PPI的同时施用，例如，在不施用药物诸如他莫昔芬的天数施用PPI，能够帮助预防抗性发展，或者帮助阻止阻碍正在进行的治疗的抗性。
[0054]尽管已经确定PPI’ s即使在过量剂量方案中也是无毒性的，但是他莫昔芬具有高水平的全身性毒性。因此，按照本发明，在预防癌症复发时，PPI’S可以用作他莫昔芬的备选药物，或者与他莫昔芬组合。
[0055]同样地，在预防性基础上治疗的遗传性癌症的其它形式也对这样的治疗敏感。一个实例是结肠息肉病，以及环境因子可能激发的其它疾病。
[0056]因此，本发明还提供PPI在制备用于预防癌症疾病的药物中的应用。优选这样的预防与其它药物组合，并且PPI和药物的施用在时间上分开，优选地至少30分钟。就本发明来说，适当的间隔时间如本文其它部分所述。
[0057]用于治疗或预防需要其的患者中的癌症疾病的方法，包括向所述患者施用质子泵抑制剂，所述癌症疾病具有与其相关的酸性微环境，并且其中所述质子泵抑制剂以足以提高所述微环境的PH的量进行施用。
[0058]因此，胃癌的预防将不同于溃疡的治疗，因为其必须不确定地继续。另外，对于其它癌症疾病，施用PPI的方案不必如对于治疗胃溃疡那样高，因为对于肿瘤酸性微环境的作用持续高达3天，或者甚至更久，从而使得患者可以例如，只要每隔一天，或者甚至只要每隔2天服用类似于为胃溃疡所开处方的PPI量。
[0059]本发明还提供用于治疗或预防疾病病症的组合治疗，所述组合治疗包括给需要其的患者施用
[0060]a)质子泵抑制剂,和
[0061]b)除了质子泵抑制剂外，用于所述疾病的治疗的至少一种药物，并且其中所述质子泵抑制剂在所述至少I种药物之前施用给所述患者。
[0062]PPI的施用优选地在第二种药物之前足够的时间进行，以允许PPI至少部分中和与所述疾病相关的任何酸性微环境。更加优选地，在第二种药物作为正在进行的方案的一部分施用的情形中，所述第二种药物浓度应该低于认为对所述疾病有效的浓度。因此，优选第二种药物不通过贴片施用，或者，如果是这样，那么应该移除贴片，以允许药物水平降到有效之下。
[0063]应该理解，这样的方案可以在连续的治疗中进行，以预防疾病的复发，以及治疗所述疾病，并且还可以应用在疾病预防中，特别是在高风险的个体中。
[0064]尽管尚未确定，但似乎可能的是，肿瘤中的pH改变表现出整体选择优势，其使得肿瘤细胞能够存活，阻断免疫应答和扩散。能够通过抑制质子泵而发挥作用，并且因此调节细胞PH的药物似乎能够妨碍pH改变所代表的优势。这种优势可以由V-H+ATP酶赋予，并且，实际上，我们已经发现这些酶的特异的抑制剂，包括奥美拉唑及其类似物兰索拉唑、雷贝拉唑和泮托拉唑，具有有效的抗肿瘤活性。
[0065]附图简述
[0066]图1:奥美拉唑在体外的细胞毒效应
[0067]该图显示剂量反应曲线，其在缓冲的(?，中性，pH7, 2)或未缓冲的(■，微酸性的)培养基中使用奥美拉唑的4次对数稀释物(X轴:0 μ g/ml,0.01 μ g/ml,0.1 μ g/ml,I μ g/ml, 10 μ g/ml)处理人黑素瘤细胞获得。所述结果清楚地表明，奥美拉唑以剂量依赖型方式只对于在微酸性培养基中生长的肿瘤细胞具有细胞毒性。图显示来自3次独立实验的中位值结果。误差条等于标准偏差。
[0068]图2:奥美拉唑在体内对人肿瘤生长的作用
[0069]该图显示对于CB.17scid/scid小鼠的3个代表性体内实验的中位值结果，其中所述小鼠移植了来自原发病灶的人黑素瘤细胞系。将移植肿瘤细胞的小鼠通过管饲法用奥美拉唑处理((_)，4次，如箭头所示)，或不处理(令)。将肿瘤重量(mg)表示为时间的函数。记录奥美拉唑在抑制肿瘤生长中的直接作用。误差条等于标准偏差。
[0070]图3:奥美拉唑对顺钼抗性的作用
[0071]该图显示3种(A，B, C)代表性剂量反应曲线，其单独使用顺钼的3次对数稀释物(如在X轴上所示)(CTR线)或者在使用奥美拉唑预处理24小时后用顺钼的3次对数稀释物(0M线)处理人黑素瘤细胞获得。作为对照(DMS0线)，由于贮存液中溶解奥美拉唑的介质是DMS0，所以将细胞用顺钼加DMSO处理。DMSO的终浓度与用奥美拉唑处理细胞导致的浓度相同，即0.0008%。所述结果清楚地表明，奥美拉唑能够几乎完全恢复抗顺钼治疗的人黑色瘤细胞(CTR线)对顺钼的细胞敏感性(0M线)。
[0072]图4:奥美拉唑对5-氟尿嘧啶(5-FU)抗性的作用
[0073]该图显示3种代表性剂量反应曲线，其单独使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的5次对数稀释物(如在X轴上所示)(CTR线)或者在使用奥美拉唑预处理24小时后用5-FU的5次对数稀释物(OM线)处理人结肠腺癌㈧或黑素瘤(B，C)细胞获得。作为对照(DMS0线)，由于贮存液中溶解奥美拉唑的介质是DMS0，所以将细胞用5-FU加DMSO处理。DMSO的终浓度与用奥美拉唑处理细胞导致的浓度相同，即0.0008%。所述结果清楚地表明，奥美拉唑能够几乎完全恢复抗顺钼治疗的人肿瘤细胞系(CTR线)对5-FU的细胞敏感性(0M线)。
[0074]图5:奥美拉唑对表达P-gp的多药耐药性细胞的作用
[0075]该图显示一种代表性的剂量反应曲线，其单独使用硫酸长春碱(VBL)的5次对数稀释物(如在X轴上所示)(CTR线)或者在使用奥美拉唑预处理24小时后用硫酸长春碱的5次对数稀释物(0M线)处理CEM-VBL100细胞系获得。作为对照(DMS0线)，由于贮存液中溶解奥美拉唑的介质是DMS0，所以将细胞用VBL加DMSO处理。DMSO的终浓度与用奥美拉唑处理细胞导致的浓度相同，即0.0008%。所述结果清楚地表明，奥美拉唑能够几乎完全恢复抗顺钼治疗的人肿瘤细胞系(CTR线)对VBL的细胞敏感性(0M线)。
[0076]图6:在人/SCID小鼠模型中，奥美拉唑对肿瘤生长的体内作用
[0077]将黑素瘤细胞系通过皮下(s.c.)注射到右胁来移植SCID小鼠。在肿瘤出现时，将小鼠不处理(CTR线)或者使用奥美拉唑(在第I天I次单独的管饲法处理，深的向下的箭头)和顺钼(在第2天I次单独的腹膜内处理，更淡的向上的箭头)(0M-CPL线)或者只用顺钼(CPL线)处理其。曲线图代表以mg重量(参见材料与方法)作为时间的函数表示的肿瘤生长。所述结果清楚地表明，奥美拉唑强烈地提高了肿瘤对顺钼的敏感性(0M-CPL线)，如果单独施用，其几乎是无效的(CPL线)。
[0078]图7:处理方法
[0079](A)同时(om/cpl)或者在用奥美拉唑处理来自原发病灶的代表性的人黑素瘤细胞系后(om+cpl)施用顺钼的3次对数稀释物的剂量反应曲线。所述结果(3次独立的实验的平均值)表明，只有用奥美拉唑预处理黑素瘤细胞能够逆转顺钼抗性。所述曲线图表示死亡细胞的百分数与药物浓度的函数(X轴:0μΜ，0，5μΜ，5μΜ，50μΜ)。误差条等于标准偏差。
[0080](B)该图显示对于CB.17scid/scid小鼠的3个代表性体内实验的平均值结果，其中所述小鼠移植了来自原发病灶的人黑素瘤细胞系。将移植肿瘤细胞的小鼠只用顺钼处理(cpl)，在奥美拉唑预处理后用顺钼处理(om+cpl线)，在用奥美拉唑处理的同时用顺钼处理(om/cpl线)，或者不处理(ctr)。将肿瘤重量(mg)表示为时间的函数。尽管顺钼/奥美拉唑同时处理没有诱导任何对药物抗性的抑制，奥美拉唑预处理在逆转SCID小鼠中移植的人黑素瘤细胞的顺钼抗性中的直接作用是显著的。误差条等于标准偏差。
[0081]现在将参考随附的、非限制性的实施例进一步举例说明本发明。
[0082]实施例1
_3] 使用奥美拉哔的体外实验
[0084]材料和方法
[0085]体外实验
[0086]药物:将奥美拉唑(Astra-Zeneca),依美拉唑(Astra-Zeneca),浮托拉唑(SigmaTau),兰索拉唑(Pharmacia,瑞典)和雷贝拉唑(Janssen)钠盐以lmg/ml重新悬浮在PBSlX中，作为贮存液并存储在_20°C。
[0087]肿瘤细胞:在潮湿的5% 0)2和95%空气氛围下，将获得于原发肿瘤的人肿瘤细胞(24株黑素瘤细胞系，2株结肠腺癌细胞系和2株乳腺癌细胞系)在缓冲的(用碳酸氢盐)或未缓冲的(不用碳酸氢盐)RPMI1640培养基中培养，所述培养基添加了 10%胎牛血清和抗生素。肿瘤细胞由意大利米兰国立肿瘤研究所(Istituto Naz1nale per la cura dieTumori, Milan, Italy)友好提供。
[0088]剂量反应曲线:将生长在混悬液中的肿瘤细胞以1.5 XlOVml接种在24孔细胞培养板(Costar)中。将黏着生长的肿瘤细胞以3 X 14细胞/孔接种在24孔细胞培养板中。使用4次对数稀释物测试每种药物对每种细胞类型的细胞毒性，如图所示。在每次实验中，每种稀释物测试至少3次重复。
[0089]细胞毒性测定:在用每种化学治疗药物处理后，使用锥虫蓝排除方法评估细胞毒性。简要地，处理后，将在混悬液中生长的细胞收集下来，离心并重悬在PBSlX中。备选地，将黏着生长的细胞收集下来，合并胰蛋白酶消化后的黏着细胞(活的)和在混悬液中的细胞(假定是死的)。由此将细胞离心(10分钟，1500rpm)并重悬在PBSlX中。将细胞混悬液的等分试样用0.4%锥虫蓝1:1 (v/v)稀释。5分钟后，将细胞上样到血细胞计数器(Neubauer)上，并且在光学显微镜下计数活细胞(未被染色)和死细胞(染成蓝色)。使用下述公式计算死细胞的百分比来评估细胞的生存力:
[0090]%死细胞=(死细胞数/死细胞数+活细胞数)X 100。
[0091]活/死生存力/细胞毒性测定法?,.这种测定法(Molecular Probes, OR,USA)提供2色荧光细胞生存力测定，其基于使用2种探针(钙荧光素AM和溴乙非啶(Ethidium)同型二聚体I)同时确定活细胞和死细胞，所述2种探针测量细胞生存力的2种识别参数一细胞内的酯酶活性和质膜完整性。通过遍在的细胞内酯酶活性的存在区分活细胞，所述酯酶活性通过完全没有荧光的细胞渗透性钙荧光素AM向强烈的荧光钙荧光素(ex/em495nm/515nm)的酶促转换确定,其保留在细胞内。相反地，溴乙非唳同型二聚体I (EthD-1)进入损坏的膜并且在与核酸结合时发生40倍的荧光增加，由此在死细胞中产生亮红色荧光(eX/em495nm/595nm)。EthD-1被活细胞的完整的质膜排除在外。按照制造商的说明书，确定了对于本研究所用的细胞类型的最佳染色浓度，从而获得死细胞和活细胞的清晰易辨的标记，因而允许细胞毒效应的精确定量。处理后，将生长在混悬液中的细胞收集下来，离心，并且重悬在PBSlX中。备选地，将黏着生长的细胞收集下来，合并胰蛋白酶消化后的黏着细胞(活的)和在混悬液中的细胞(假定是死的)。由此将细胞离心(10分钟，1500rpm)并重悬在PBSlX中。由此将细胞分别用钙荧光素AM和EthD-1处理，终浓度为0，I μ M和I μ Μ，并且在室温放置30分钟。这一温育时间过后，将细胞用PBSlX洗涤一次，并且再一次重悬在PBSlX中。使用装备488氩激光器的FACScan细胞计数器(BectonDickinson)分析样品。获得了至少20，000个结果。记录数据并且通过使用CellQuest软件的Macintosh计算机进行统计学分析。在将对数放大的信号以线性比例转换成值后，进行突光的计算(表示为中位值)，并且通过使用参量的Kolmogorov-Smirnov (Κ/S)检验计算统计学显著性。使用斯氏t-检验进行程序性细胞死亡数据的统计学分析。报告的全部数据都是至少4次单独实验的平均值土标准偏差(S.D.)。只有小于0.01的P值才被认为是显著的。由此获得的双变数频率分布表明在绿色荧光(530nm)活细胞群体和红色荧光(585nm)死细胞群体之间的清楚的分离(无论何时存在)。
[0092]统计学分析:使用用于不成双的双尾(two-tailed)比较的斯氏t_检验进行统计学比较。认为小于0.05的P值是显著的。
[0093]结果
[0094]在体外奥美拉唑对肿瘤细胞具有细胞毒性
[0095]实验的首要目的是确定通过使用奥美拉唑及其它PPIs治疗抑制VH+ATP酶是否将对肿瘤细胞具有细胞毒性。在来自原发病灶的24株人黑素瘤，2株人结肠腺癌和2株人乳腺癌细胞系中测试奥美拉唑的细胞毒效应。这些细胞都能够在微酸性培养基中生长，而对细胞周期或生存力没有任何影响，所述微酸性培养基由不补充碳酸氢盐的RPMI1640培养基代表。由于通过与正常组织的比较，先前的数据已经表明肿瘤微环境是微酸性的，所以进行这种测试。
[0096]为了验证肿瘤细胞对奥美拉唑敏感，我们使用由在微酸性培养基中生长的细胞所代表的实验条件，其中我们完成了奥美拉唑剂量反应曲线。作为对照，在缓冲的培养基(pH7.2)中培养细胞进行了同样的实验。在图1中，显示关于一种代表性人黑素瘤细胞系的结果。在缓冲的中性或者未缓冲的酸性培养基中，使用所述药物的5次对数稀释物处理细胞，获得奥美拉唑的剂量反应曲线(图1)。所述结果表明:(i)在中性PH培养基中，单独的奥美拉唑对于测试的细胞没有表现出明显的细胞毒效应，但是(ii)奥美拉唑存在于酸性培养基中对于肿瘤细胞显著地表现出剂量依赖型方式的细胞毒效应。在其它肿瘤细胞系和使用其它PPIs进行的实验给出类似的结果(数据没有显示)。所述结果由活/死生存力/细胞毒性测定法充分验证。
[0097]实施例2
[0098]使用奥美拉哔的体内实验
[0099]材料和方法
[0100]体内
[0101]动物:使用4-5周龄的CB.17SCID/SCID雌性小鼠(Harlan，意大利)，并且在特殊的无病原体条件下饲养。将SCID小鼠安置在微隔离的笼子中，并且所有的食物，水和垫料都在使用前高压灭菌。
[0102]肿瘤细胞:在潮湿的5% 0)2和95%空气氛围下，将获自两个原发病灶的人肿瘤细胞(黑素瘤，结肠腺癌)在补充了 10% FCS的RPMI1640中培养。
[0103]人肿瘤在SCID小鼠中的移植和生长:将每一只小鼠在右胁皮下(s.c.)注射重悬在0.2ml补充了 10% FCS的RPMI1640中的3X 16个细胞。移植后，使用测径规测量每一个肿瘤的大小。按照Geran等.(1972)使用下述公式估计肿瘤的重量:
[0104]肿瘤重量(mg)=长度(mm) X宽度2(mm)/2。
[0105]小鼠处理:如先前的描述(Watson和Smith, 2001),通过管饲法以75mg/kg的剂量施用奥美拉唑(Astra-Zeneca,意大利)和泮托拉唑(Sigma Tau),其为在PBSlX中的混悬液。如先前的描述(Watson和Smith，2001)，通过管饲法以25mg/kg的剂量施用兰索拉唑(Pharmacia,瑞典)和雷贝拉唑(Janssen),其为在PBSlX中的混悬液。
[0106]其它:除非另外说明，其它参数与在上述实施例1中提出的相同。
[0107]结果
[0108]在移植了人肿瘤细胞的SCID小鼠体内评估奥美拉唑对人肿瘤生长的作用
[0109]实施例1的体外实验表明在微酸性条件下奥美拉唑对人肿瘤细胞系的直接的细胞毒效应。因此，接着在体内系统测试功效。
[0110]为了这一目的，我们测试了奥美拉唑及其类似物对人/小鼠模型系统的作用，所述人/小鼠模型系统由通过皮下(S.C.)注射移植了人黑素瘤细胞的CB.17scid/scid小鼠代表。使用局部的或全身的治疗方法，已经证明这一模型有效用于在体内测试各种针对人肿瘤的抗肿瘤治疗的功效(Lozupone等，2000，2003，2004印刷中)。将移植了人肿瘤细胞的小鼠通过管饲法用奥美拉唑处理。根据在不同时间点肿瘤的生长测量处理的作用。所述结果表明，重复的奥美拉唑处理显著地减少肿瘤生长(图2)。使用奥美拉唑类似物处理小鼠获得的结果与使用奥美拉唑显示的结果十分相似(未显示)。显著地，停止实验后对人肿瘤的组织学检验显示，在来自奥美拉唑处理的小鼠的肿瘤中，肿瘤块被巨大的坏死区域占据，所述坏死区域是肿瘤的大小的主要原因(未显示)，这表明所述细胞毒效应要比通过体内肿瘤大小测量所量化的作用大得多。
[0111]实施例3
[0112]体外药物和PPIs
[0113]材料和方法
[0114]体外实验
[0115]药物:PPIs如在上述实施例1中一样。将顺钼(Aventis，法国)以lmg/ml的存储浓度重悬在PBSlX中，并在-20°C保存。在使用前将贮存液立即解冻并且不再冷冻。5-氟尿嘧啶(Teva Pharma，荷兰)以浓度为50mg/ml的溶液形式提供，并且在室温(r.t)保存，如提供者所示。将硫酸长春碱(Eli Lilly, Paris,法国)以O, lmg/ml的浓度重悬在EtOH/蒸馏水1:1000的溶液中，这样获得保存在4°C的贮存液，并且在重悬后3天内使用。
[0116]肿瘤细胞:人肿瘤细胞如在上述实施例1中一样。
[0117]通过将母体药物敏感的人T-成淋巴细胞瘤细胞系暴露于增加的亚致死性浓度直到100ng/mL的硫酸长春碱(VBL) (Eli Lilly,巴黎，法国)中，获得CCRF-CEM(CEM)细胞的MDR变体(CEM-VBL100)。本研究中所用的所有细胞都在添加了 10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培养基(碱性培养基，BM)中在潮湿的5% CO2和95%空气的氛围下培养。
[0118]通过将母体药物敏感的人T-成淋巴细胞瘤细胞系暴露于增加的亚致死性浓度直到 200ng/mL 的多柔比星(DX) (Pharmacia&Upjohn,意大利)，获得 MCF7 的 MDR 变体(MCF7/DX)。
[0119]剂量反应曲线:将生长在混悬液中的肿瘤细胞以1.5 XlOVml接种在24孔细胞培养板(Costar)中。将黏着生长的肿瘤细胞以3 X 14细胞/孔接种在24孔细胞培养板中。使用3-5次对数稀释物测试每种药物对每种细胞类型的细胞毒性，如图所示。在每次实验中，每种稀释物测试至少3次重复。
[0120]其它:除非另外说明，其它参数与在上述实施例1中提出的相同。
[0121]结果
[0122]奥美拉唑增强了人肿瘤细胞对顺钼的敏感性
[0123]实验的首要目的是证实通过使用奥美拉唑及其它PPIs处理抑制VH+ATP酶能逆转肿瘤细胞的多药耐药性。顺钼，由于在其分子中存在2个胺基而具有弱碱的化学特性，被选来测试奥美拉唑作为肿瘤细胞的弱碱性药物抗性的回复剂的活性。先前已经表明顺钼抗性肿瘤细胞展示出更高的细胞PH(和更低的细胞外pH)，以及液泡质子泵基因的增强的表达(Murakami等，2002)。在来自原发病灶的24株人黑素瘤，2株人结肠腺癌和2株乳腺癌细胞系中测试奥美拉唑对细胞针对顺钼的抗性的作用，并且选择其对顺钼的抗性。在图3中，显示关于3种代表性的黑素瘤细胞系的结果。通过只用所述药物的3次对数稀释物，或者在奥美拉唑存在下处理细胞获得对于顺钼的剂量反应曲线。所述结果表明:(i)在这些条件下，单独的奥美拉唑对于测试的细胞没有表现出任何细胞毒效应，以及(ii)在所有测试的人黑素瘤细胞中，奥美拉唑在培养基中的存在显著地增强了对顺钼的敏感性。在其它肿瘤细胞系和使用其它PPIs进行的实验给出类似的结果(数据没有显示)。
[0124]奥美拉唑增强了人肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性
[0125]接着研究PPIs作用在生理屏障上的可能性，所述生理屏障由肿瘤细胞抵抗任何攻击引起，改变细胞内和/或细胞外pH。在该实验中，我们尝试验证，除了弱碱，这种机制在逆转肿瘤对化学治疗药物的抗性中也是有效的。应用前文描述的相同的实验设计，我们测试奥美拉唑在逆转原发肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗性的功效。这一药物是尿嘧啶的衍生物和叶酸的类似物，并且表现出弱酸特性。在来自原发病灶的24株人黑素瘤，2株人结肠腺癌和2株人乳腺癌细胞系中测试奥美拉唑对细胞针对5-FU的抗性的作用，并且选择其对5FU的抗性。图4显示关于3种代表性实验的结果。通过只用5-FU的5次不同的对数稀释物，或者在奥美拉唑及其类似物存在下处理细胞获得剂量反应曲线(未显示)。所述结果清楚地表明，通过用奥美拉唑预处理细胞恢复了 5-氟尿嘧啶的敏感性。使用其它PPIs以及其它肿瘤细胞系获得了相似的结果(未显示)。
[0126]奥美拉唑对在体外选择为MDR的人细胞系的作用
[0127]为了验证细胞pH的改变是否能够是负责作为基本生理屏障的多药耐药性的机制，我们测试了奥美拉唑在体外选择为MDR表型并且表达P-糖蛋白的细胞中的作用，其中所述P-糖蛋白作为负责药物流出的专有(sole)转运蛋白。特别地，我们测试奥美拉唑对于CEM-VBL100细胞的作用(图5)，所述CEM-VBL100细胞通过将亲本人类淋巴母细胞⑶4+T细胞系CCRF-CEM在含有增加浓度直到100ng/ml的硫酸长春碱的培养基中选择而获得。CEM-VBL100细胞表达P-糖蛋白，并且表现出对100ng/ml的长春碱和对其它相关药物的抗性。图5显示3种代表性实验的结果。通过只用硫酸长春碱的5次不同的对数稀释物或者在奥美拉唑及其类似物存在下处理CEM-VBL100细胞获得剂量反应曲线(未显示)。所述结果清楚地表明，用奥美拉唑预处理细胞恢复了硫酸长春碱的敏感性。使用其它PPIs(未显示)，以及对通过选择MCF7亲本人乳腺癌细胞系获得的MCF7-DX细胞系实行相同的实验(未显示)获得了相似的结果。
[0128]实施例4
[0129]体内药物和PPIs
[0130]材料和方法
[0131]体内实验
[0132]将顺钼(Aventis,法国)以5mg/kg的剂量进行腹膜内(1.p.)施用(Son和Huangl994)。
[0133]其它:除非另外说明，其它参数与在上述实施例1和2中提出的相同。在移植了人肿瘤细胞的SCID小鼠体内评估奥美拉唑对于人肿瘤对化疗药物的敏感性的作用。
[0134]结果
[0135]体外实验已经表明奥美拉唑处理在人肿瘤细胞系中恢复对细胞毒性药物的敏感性的直接作用。然而，我们需要在体内系统测试功效。为了这一目的，我们在人/小鼠模型系统中测试了奥美拉唑及其类似物的作用，所述人/小鼠模型系统由通过皮下(s.c.)注射移植了人黑素瘤细胞的CB.17scid/scid小鼠代表。使用局部的或全身的治疗方法，已经证明这一模型有效用于在体内测试各种针对人肿瘤的抗肿瘤治疗的功效(LOZOpOne，2000，2002，印刷中)。将移植了人肿瘤细胞的小鼠用奥美拉唑预处理(通过管饲法)，并且用单一剂量的顺钼进行腹膜内注射。根据在不同时间点肿瘤的生长测量处理的作用。所述结果(图6)表明，尽管顺钼本身没有显示出对肿瘤生长的显著作用，但是奥美拉唑预处理显著地增加肿瘤对顺钼的敏感性。使用奥美拉唑类似物预处理小鼠获得的结果与使用奥美拉唑显示的结果十分相似(未显示)。此外，停止实验后人肿瘤的组织学检验显示，在来自奥美拉唑/顺钼处理的小鼠的肿瘤中，肿瘤块被巨大的坏死区域占据，所述坏死区域是肿瘤的大小的主要原因(未显示)，这表明所述细胞毒效应要比通过体内肿瘤大小测量所定量的作用大得多。
[0136]处理方法
[0137]用抗肿瘤药物诸如顺钼的处理，可能提高V-H+-ATP酶的活性(Murakami T等2001)。因此，使用PPIs和顺钼同时处理，或者使用顺钼预处理，可能减小PPI的回复作用。因此，我们进行了实验以评估导致PPI回复作用失败的可能的无效组合处理。体外实验清楚地表明顺钼预处理(未显示)和奥美拉唑-顺钼共同处理都没有引起对于人黑素瘤细胞的生存力的任何可测的作用(图7A)。一致地，使用顺钼和奥美拉唑对携带黑素瘤的SCID小鼠的体内共同处理没有表现出对肿瘤生长的任何显著作用(图7B)。
[0138]参考文献
[0139]1.Altan N，Chen Y，Schindler M and Sanford SM.Defective acidificat1nin human breast tumor cells and implicat1ns for chemotherapy.J Exp Medl998 ；187(10):1583-1598.
[0140]2.Andreola Gj Rivoltini L，Castelli C，Huber Vj Perego P，Deho Pj SquarcinaPj Accornero P., Lozupone F，Lugini L，Stringaro A，Molinari A，Arancia G，GentileM，Parmiani G and Fais S.1nduct1n of Lymphocytes apoptosis by tumor cellsecret1n of FasL—bearing microvesicles.J.Exp.Med.2002 ；10:1303-1316.
[0141]3.Beck WT.The cell b1logy of multiple drug resistance.B1chemPharmacol.1987 ；36:2879-87
[0142]4.Bour-Di 11 C，Gramain MP，Merlin JL，Marchal S and Gui I leminF.Determinat1n of intracellular organelles implicated in daunorubicincytoplasmic sequestrat1n in multidrug-resistant MCF-7cells using fluorescencemicroscopy image analysis.Cytometry.2000 ；39(1): 16-25.
[0143]5.Cleary I, Doherty G，Moran E and Clynes M.The multi drug-resistanthuman lung tumour cell line，DLKP—A10，expresses novel drug accumulat1n andsequestrat1n systems.B1chem Pharmacol.1997 ；53 (10):1493-502.
[0144]6.Geran RIj Greenberg NHj Macdonald MMj Shumacher AM and AbbotBJ.Protocols for screening chmical agents and natural products against animaltumors and natural other b1logical systems.Cancer Chemother.Rep.1972 ；3:1-88.
[0145]7.Gottesman MM and Pastan 1.B1chemistry of multidrug resistancemediated by the multidrug transporter.Annu.Rev.B1chem.1993 ；62:385-427.
[0146]8.Gottlieb RA, Giesing HAj Zhu JY，Engler RLj Bab1r BM.Cell acidificat1nin apoptosis:granulocyte colony-stimulating factor delays programmed celldeath in neutrophils by up-regulating the vacuolar H+-ATPase.Proc Natl Acad SciUSA1995 ；92:5965-8.
[0147]9.Graber ML and Devine P.0meprazole and SCH28080inhibit acid secret1nby the turtle urinary bladder.Ren.Phys1l.B1chem.1993 ；16:257-267.
[0148]10.Helmlinger G，Yuan F，Dellian M，Jain RK.1nterstitial pH andp02gradients in solid tumors in vivo:high_resolut1n measurements reveal a lackof correlat1n.Nat Medl997 ;3:177-82.
[0149]11.Horn J.The proton-pump inhibitors !similarities and differences.Clin.Ther.2000 ；22(3):266-280.
[0150]12.Hurwitz SJ，Terashima Mj Mizunuma N and Slapak CA.Vesicularanthracycline accumulat1n in doxorubicin-selected U937cells !participat1n oflysosomes.Blood.1997 ；89 (19):3745-3754.
[0151]13.1zumi H，Torigoe T，Ishiguchu H，Uramoto H，Yoshida Y，Tanabe M，IseT，Murakami T，Yoshida T，Nomoto M and Kohno K.Cellular pH regulators !potentiallypromising molecular targets for cancer chemotherapy.Cancer Treat.Rev.2003 ；29:541-549.
[0152]14.Larsen AK，Escargueil AE and Skladanowski A.Resistance mechanismsassociated with altered intracellular distribut1n of anticancer agents.Pharmacol.Therap.2000 ；85:217-229.
[0153]15.Larsson H，Mattson H，Sundell G and Carlsson E.Animal pharmacodynamicsof omeprasole.A survey of its pharmacological properties in viv0.Scand.J.Gastroenterol.1985 ；20 (suppl.108):23-35.
[0154]16.Lozupone F，Luciani F，Lugini L，Federici F，Ramoni Cj RivoltiniL，Parmiani G，Belardelli Fj Rivera P，Marcenaro S，Moretta L and Fais S.Effect ofhuman NK and gamma/delta T cells on the growth of human autologous melanomaxenografts in SCID mice.Cancer Res.200464:378-385.
[0155]17.Lozupone F，Luciani Fj Venditti Mj Rivoltini L，Pupa S，ParmianiG，Belardelli F and Fais S.Murine granulocytes control human tumor growth inSCID mice.1ht J Cancer.2000 ；87:569-573.
[0156]18.Lozupone F，Pcnde D，Bug1 VLj Castelli C，Spada Mj Venditti M，Luciani F，Lozupone, F.，Rivoltinij L，Luginij L，Covaj A.，Squarcinaj P.，Parmianij G.，BelardelIij F.and FAIS S.Adoptive transfer of an ant1-MART_l27—35_specific CD8+T cell cloneleads to immnnoselecf1n of human melanoma antigen-loss variants in SCID mice.Eur J.1mmunol.2003 ；33:556-566.
[0157]19.Lugini Lj Lozupone F，Matarrese P，Funaro C，Luciani F，MalorniWj Rivoltini L，Castelli C，Tinari A，Piris A，Parmiani G and Fais S.PotentPhagocytic Activity Discriminates Metastatic and Primary Human MalignantMelanomas:A Key Role of Ezrin.Lab.1nv.2003 ；83: 1555-1567.
[0158]20.Mahoney BP，Raghunand N，Bagget B and Gillies RJ.Tumor acidity, 1ntrapping and chemotherapentics 1.Acid pH affects the distribut1n ofchemotherapeutic agents in vitr0.B1chem.Pharmacol.2003 ；66:1207-1218.
[0159]21.Marquardt D and Center MS.1nvolvement of vacuolar H+-adenosinetriphosphatase activity in multidrug resistance in HL60cells.J.Natl.CncerInst.1991 ；83:1098-1102.
[0160]22.Martinez-Zagui Ian Rj Lynch RMj Mart inez GM and GilliesRJ.Vacuolar-type H+ATPases are funct1nally expressed in the plasma membranesof human tumor cells.Am.J.Phys1l.1993 ；265:C1015_C1029.
[0161]23.Martinez-Zaguilan Rj Martinez GMj Gomez A, Hendrix MJ，GilliesRJ.Distinct regulat1n of pHin and[Ca21]in in human melanoma cells withdifferent metastatic potential.J Cell Phys1ll998 ；176:196-205.
[0162]24.Martinez-Zaguilan R，Raghunand Nj Lynch RMj Bellamy Wj MartinezGMj Rojas B，Smith D，Dalton WS and Gillies RJ.pH and drug resistance.1.Funct1nalexpress1n of Plasmalemmal V-type H+_ATPase in drug resistant human breastcarcinoma cell lines.B1chem.Pharmacol.1999 ；57: 1037-1046.
[0163]25.Mizunashi Kj Furukawa Y，Katano K and Abe K.Effect of omeprazole, aninhibitor of H+, K (+)-ATPasej on bone resorpt1n in humans.Calcif.TissueInt.1993 ；53:21-25.
[0164]26.Molinari A，Calcabrini A，Meschini S，Stringaro A，Crateri P，ToccacieliL，Marra M，Colone M，Cianfriglia M，Arancia G.Subcellular detect1n andlocalizat1n of the drug transporter P-glycoprotein in cultured tumor cells.Curr Protein Pept Sc1.2002 ；3:653-670.
[0165]27.Molinari A，Calcabrini A，Meschini S，Stringaro A, Del BufaloDj Cianfriglia Mj Arancia G.Detect1n of P-glycoprotein in the Golgi apparatus ofdrug-untreated human melanoma cells.1ht J Cancer.1998 ；75:885-893.
[0166]28.Molinari A，Toccacieli L，Calcabrini A，D1ciaiuti M，CianfrigliaM，Arancia G.1nduct1n of P-glycoprotein express1n on the plasma membrane ofhuman melanoma cells.Anticancer Res.2000 ；20:2691-2696.
[0167]29.Montcourrier P，Mangeat PHj Valembois Cj Salazar G，SahunquetA, Duperray C and Rochefort H.Characterizat1n of very acidic phagosomes inbreast cancer cells and their associat1n with invas1n.J.Cell Sc1.1994 ； 107:2381-2391.
[0168]30.Moriyama Y.Membrane energizat1n by proton pumps is important forcompartmentalizat1n of drugs and toxins:a new type of active transport.J ExpB1l.1996 ；199:1447-54.
[0169]31.Murakami Tj Shibuya I，Ise T，Chen ZSj Akiyama Sj Nakagawa Mj IzumiH，Nakamura T，Matsuo K，Yamada Y and Kohno K.Elevated express1n of vacuolarproton pump genes and cellular PH in cisplatin resistance.1nt J Cancer.2001 ；93:869-74.
[0170]32.Nishi T and Forgac M.The vacuolar(H+)-ATPases-Nature，smostversatile proton pumps.Nat.Rev.Mol.Cell B1l.2002 ;3:94-103.
[0171]33.0uar Z，Bens Mj Vignes C，Paulais Mj Pringel Cj Fleury Jj CluzeaudFj Lacave R and VandewalIe A.1nhibitors of vacuolar H+_ATPase impair thepreferential accumulat1n of daunomycin in lysosomes and reverse the resistanceto anthracyclines in drug-resistant renal epithelial cells.B1chem J.2003 ；370(1):185-193.
[0172]34.0uar Zj Lacave R，Bens M and Vandewalle A.Mechanisms of alteredsequestrat1n and efflux of chemotherapeutic drugs by multidrug resistantcells.Cell B1l.Toxicol.1999 ；15:91-100.
[0173]35.Paul1-Magnus C，Rekersbrink S，.Klotz U and Fromm MF.1nteract1nof omeprazole,lansoprazole and pantoprazole with P-glycoprotein.ArchPharmacol.2001 ；364:551-557.
[0174]36.Perona R，Serrano R.1ncreased pH and tumorigenicity of fibroblastsexpressing a yeast proton pump.Nature 1988 ；334:438-40.
[0175]37.Puscas I，Coltau M，Baican M and Domuta G.0meprazole Has a DualMechanism of Act1n:It Inhibits BothH+K+ATPase and Gastric Mucosa CarbonicAnhydrase Enzyme in Humans(In Vitro and In Vivo Experiments).J.Pharmacol.Exp.Ther.1999 ；290(2):530-534.
[0176]38.Raghunand N，He X，van Sluis Rj Mahoney BP，Bagget Bj TayloeCWj Paine-Murrieta G，Roe Dj Bhujwalla ZM and Gillies RJ.Enhancement ofchemotherapy by manipulat1n of tumor pH.Br.J.Cancer.1999 ；80 (7):1005-1011.
[0177]39.Raghunand Nj Mahoney BP and Gillies RJ.Tumor acidity, 1n trapping andchemotherapeutics H.PH-dependent partit1n coefficients predict importance of1n trapping on pharmacokinetics of weakly basic therapeutic agents.B1chem.Pharmacol.2003 ；66:1219-1229.
[0178]40.Raghunand Nj Martinez-Zaguilan Rj Wright SH and Gillies RJ.pH anddrug resistance.11.Turnover of acidic vesicles and resistance to weakly basicchemotherapeutiv drugs.B1chem.Pharmacol.1999 ；57:1047-1058.
[0179]41.Sabolic I, Brown Dj Verbavatz JM and Kleinman J.H(+)-ATPases of renalcortical and medullary endosomes are differentially sensitive to Sch_28080andomeprazole.Am.J.Phys1l.1994 ；266:F868_877.
[0180]42.Schindler Mj Grabski Sj Hoff E，Simon SM.Defective pH regulat1nof acidic compartments in human breast cancer cells (MCF-7)is normalized inadriamycin-resistant cells(MCF-7adr).B1chemistry.1996 ；35 (9):2811-7.
[0181]43.Schlappack OKj Zimmermann A, Hill RP.Glucose starvat1n and acidosis:effect on experimental metastatic potential, DNA content and MTX resistance ofmurine tumour cells.Br J Cancerl991 ；64:663-70.
[0182]44.Simon Sj Roy D and Schindler M.1ntracellular pH and the control ofmulti drug resistance.Proc.Natl.Acad.USA.1994 ；91:1128-1132.
[0183]45.Son K and Huang L.Exposure of human ovarian carcinoma to cisplatintransiently sensitizes the tumor cells for liposome mediated gene transfer.Proc.Natl.Acad.USA.1994 ；91:12669-12672.
[0184]46.Tannock IF and Rotin D.Acid pH in tumors and its potential fortherapeutic exploitat1n.Cancer Res.1989 ；49 (16):4373-4384.
[0185]47.Torigoe Tj Izumi H，Ishiguchi H，Uramoto H，Murakami T，Ise T，YoshidaY，Tanabe M，Nomoto M，Itoh H and Kohno K.Enhanced express1n of the humanvacuolar H+_ATPase c subunit gene (ATP6L)in response to anticancer agents.J.B1l.Chem.2002 ；277 (39):36534-36543.
[0186]48.Vaananen HK，Karhukorpi EK，Sunquist Kj Wallmark B，Roinine I，HentuneTjTuukkanen J and Lakkakorpi P.Evidence of the presence of H+_ATPase types inthe ruffled borders of osteoclasts.J.Cell B1l.1990 ；111:1305-1311.
[0187]49.Wallmark B，Larsson H and Humble LThe Relat1nship between GastricAcid Secret1n and Gastric H+，K+_ATPase Activity.J.B1l.Chem.1985 ；260 (25):13681-13684.
[0188]50.Wal lmark Bj Lorentzon P and Larsson H.The mechanism ofact1n of omeprazole —a survey of its inhibitory act1n in viv0.Scand.J.Gastroenterol.1985 ；20 (suppl.108):37-51.
[0189]51.Watson SA and Smith AM.Hypergastrinaemia promotesadenomaprogress1n in the APCMin7/+mouse model of familial adenomatouspolyposis.Cancer Res.2001 ；61:625-631.