猪假attp位点及其用途制作方法

刘欢, 张楚新, 张欢欢, 李勇, 杜玉涛, 杨焕明, 汪建, 王俊

2012年7月4日

2011年12月9日

2011年12月9日

深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司

C12N15/85GK102533741SQ20111040945

猪假 attp 位点 用途

1.一种分离的可被OC31整合酶识别的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQID NO 2所示的核苷酸序列3.—种适于转化猪细胞的载体，其特征在于，包括第一核酸序列，所述第一核酸序列适于在OC31整合酶的介导下与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组；以及目的基因，任选地，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列， 任选地，进一步包括编码筛选标记的核酸序列，所述筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自GFP和EGFP的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种，任选地，进一步包括启动子，所述启动子与所述目的基因可操作地连接，所述启动子优选为真核细胞启动子，所述真核细胞启动子优选为CAG启动子，可选地所述真核细胞启动子为组织特异性启动子，任选地，进一步包括增强子序列，所述增强子序列与所述目的基因可操作地连接4.一组适于转化猪细胞的载体，其特征在于，包括 第一载体，所述第一载体包括第一核酸序列，所述第一核酸序列适于在OC31整合酶的介导下与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组；以及目的基因，第二载体，所述第二载体包括编码OC31整合酶或其功能等同体的核酸序列， 任选地，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列， 任选地，所述第一载体进一步包括编码第一筛选标记的核酸序列，所述筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自GFP和 EGFP的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种；任选地，所述第二载体进一步包括编码第二筛选标记的核酸序列，所述第二筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自GFP 和EGFP的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种，任选地，所述第一筛选标记与所述第二筛选标记不同，任选地，所述第一载体进一步包括第一启动子，所述第一启动子与所述目的基因可操作地连接，所述第一启动子优选为真核细胞启动子，所述真核细胞启动子优选为CAG启动子，可选地所述真核细胞启动子为组织特异性启动子，任选地，所述第一载体进一步包括第一增强子序列，所述第一增强子序列与所述目的基因可操作地连接，任选地，所述第二载体包括如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列， 任选地，所述第二载体进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述编码OC31整合酶或其功能等同体的核酸序列可操作地连接，所述第二启动子优选为真核细胞启动子， 所述真核细胞启动子优选为CAG启动子，可选地所述真核细胞启动子为组织特异性启动子，任选地，所述第二载体进一步包括第二增强子序列，所述第二增强子序列与所述目的基因可操作地连接5.一种转基因猪细胞或其培养物，其特征在于，在所述转基因猪细胞的1号染色体上包含表达外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1号染色体的假attp位点中6.根据权利要求5所述的转基因猪细胞或其培养物，其特征在于，所述假attp位点的核心区具有如SEQ ID NO 3所示的寡核苷酸序列7.一种制备权利要求5或6所述的转基因猪细胞的方法，其特征在于，包括下列 使用权利要求3所述的一组适于转化猪细胞的载体转化猪细胞，以便获得转基因猪细胞，优选利用所述第一载体和所述第二载体共转化所述猪细胞，任选地通过脂质体法进行所述共转化；以及分离转基因猪细胞8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一载体与所述第二载体的质量比为1 1 5，优选1 19.一种确定猪基因组中假attp位点序列的方法，其特征在于，包括下列步骤 根据权利要求7或8所述的方法制备转基因猪细胞；分离所述转基因猪细胞的基因组DNA ；使用限制性内切酶对所述基因组DNA进行酶切消化，以便获得具有粘性末端的DNA片段；将所述DNA片段与相应的接头相连，以便获得连接产物；使用第一 PCR引物组，对所述连接产物进行第一 PCR扩增，以便获得第一扩增产物，其中，第一 PCR引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物特异性识别接头，所述第二引物特异性识别所述第一核酸序列；使用第二 PCR引物组，对所述第一扩增产物进行第二 PCR扩增，以便获得第二扩增产物，其中，第二 PCR引物组包括第三引物和第四引物，所述第三引物特异性识别接头，所述第四引物特异性识别所述第一核酸序列；对所述第二扩增产物进行测序，以便获得测序结果，其中，所述测序结果中包含所述假 attp位点的部分序列；基于所述测序结果，确定所述假attp位点的序列， 任选地，所述限制性内切酶为BamH I和Bgl II的组合，任选地，所述接头由第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链构成，其中，所述第一寡核苷酸链具有如SEQ ID NO 6所示的寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸链具有如SEQ ID NO 7所示的寡核苷酸序列，任选地，所述第一引物具有如SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列， 任选地，所述第三引物具有如SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列；以及所述第四引物具有如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列CN 102533741 A_10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述假attp位点的序列进一步包括基于所述测序结果，确定所述假attp位点在猪基因组中的位置；以及基于噬菌体attp位点序列以及所述假attp位点在猪基因组中的位置，确定所述假 attp位点的序列

本发明涉及生物工程技术领域具体地，本发明涉及猪假attp位点及其用途更具体地，本发明涉及一种分离的可被OC31整合酶识别的寡核苷酸，一种适于转化猪细胞的载体，一组适于转化猪细胞的载体，一种转基因猪细胞或其培养物，一种制备转基因猪细胞的方法，以及一种确定猪基因组中假attp位点序列

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制如果没有特别说明，在本文中所使用的术语均是本领域技术人员通常所理解的含义在本发明中所使用的术语“第一”、“第二”仅仅是为了方便区分不同的成分，而不能以任何方式理解为重要性或其他方面的区别1、猪假attp位点根据本发明的实施例，提出了一种分离的寡核苷酸，其包含核苷酸序列CAACCCCACAGGTGCTGGTGCTCTTCCAGAGGGGGAAGA(SEQ ID NO 3)发明人发现该分离的寡核苷酸能够被链霉菌噬菌体Φ031(在本文中也称为“噬菌体Φ031”)整合酶识别，从而可以作为假attp位点的核心区，介导将外源DNA有效地整合到猪基因组中，有效地实现在猪细胞中持续、高效地表达外源基因根据本发明的实施例，在上述作为attp核心区的寡核苷酸序列的两侧，还可以进一步包括侧翼区，即根据本发明的实施例的可以作为假attp位点的分离的寡核苷酸可以具有下列核苷酸序列CCAAAATGATCAGTGTGGTCCTTTGTGTTCAAAAGGTGAGGGACTCCTCACAAGAACTTATTCCCGATC CAAATACAGAGAGGTTGGAGGAGGGGCGGTGTAGAACTCAGGGCTTTTGACTCCTCCGCAAAAGCCTCTCACCAAAA AAAGAGGGTGTTAATTTGTCCTTCCATTCAACAAACAGTGACTGAGTGCTTATTAGAGGTCCAATGAGTAGAAAATG GGAGACACAGGGACTCACAGCTGAGCAGGAAGACAGCCACATCGCTCAACAGAAAGTGACTCAGGTGAGCAACCCCA CAGGTGCTGGTGCTCTTCCAGAGGGGGAAGAGGGTTTGGGGGGGAACCTCATAAACCTTACAGTTCTTGCTTTTATG GACTATTTATTTAATGCCTATGTGTTATACTTACAAAATGTGCTTACTTTATGTTTATTTGTGTCTTTCAACTTAGG GTATTAAATTTCTCTACAATCAGCCCTTTCACTACTTTCAAACCTCTTACACCACAGCATCATTTCCCCTAGCTTGA CGGTACTCAAGAAATATTTCTTTGATAATAATGACAGGTGGTTTGTACTTTTTCCACTTAGATGACAATCTCATCAT AAATCCCTATTGGATTTCATTTCG(SEQ ID NO 2)其中，下划线部分中所标出的序列是attp核心区的核苷酸序列，即SEQ ID NO 3 发明人发现，借助该寡核苷酸序列，能够更有效地介导将外源DNA有效地整合到猪基因组中，有效地实现在猪细胞中持续、高效地表达外源基因另外，发明人发现借助该寡核苷酸和噬菌体φ031整合酶，能够将外源DNA整合到猪基因组第1号染色体的特定位点中，并且惊奇地发现，在将外源DNA引入到该特定位点后，对于猪基因组中的其他基因表达并不会造成不利的影响，从而不会影响猪细胞的正常生理活动，便于对猪进行遗传改造，进行相关的研究2、适于转化猪细胞的载体在分离猪基因组的attp位点之后，发明人提出了一种适于转化猪细胞的载体利用该载体，能够借助猪基因组的attp位点以及噬菌体Φ031整合酶，有效地将外源DNA即目的基因，引入到猪细胞中，并且有效地实现将外源DNA与猪基因组的整合需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作根据本发明的实施例，适于转化猪细胞的载体包括第一核酸序列和目的基因该第一核酸序列适于在OC31整合酶的介导下与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组由此，利用该载体，能够在OC31整合酶的介导下通过与猪假attp位点发生重组，从而，可以有效地将目的基因引入到猪细胞中在本文中所使用的术语“载体”应作广义理解，其可以是任何能够将核酸序列引入猪细胞内的媒介，包括但不限于质粒、粘粒、病毒、人工染色体，既可以是环形的载体，也可以是线状的，既可以是单链的，也可以是双链的根据本发明的实施例，优选的载体类型是质粒根据本发明的实施例，第一核酸序列的具体序列并不受特别限制，只要其能够在 Φ〇31整合酶的介导下与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的序列发生重组即可根据本发明的一个实施例，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列发明人发现，SEQ ID NO 4所示的序列，能够有效地与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组由此，可以有效地提高第一核酸序列与猪假attp位点发生重组的效率，从而提高将目的基因引入到猪细胞中的效率根据本发明的实施例，该载体还可以进一步包括附加元件，从而可以获得，以赋予其附加的功能和效果根据本发明的一个实施例，该实施例可以进一步包括编码筛选标记的核酸序列 由此，可以有效地筛选转入该载体的猪细胞，由此，可以提高制备转基因细胞的效率根据本发明的示例，筛选标记的类型并不受特别限制根据本发明的一些示例，筛选标记可以为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种由此，可以非常容易地筛选已经引入载体的猪细胞，例如通过检测发光强度和在培养基中添加相应的药物根据本发明的具体示例，发光蛋白可以为选自GFP和EGFP的至少一种由此，可以通过检测所发出的绿色荧光，来筛选和验证载体已经成功地被引入到猪细胞中根据本发明的具体示例，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种由此，可以通过在培养基中添加相应的抗生素，在培养后存活下来的细胞即为含有载体的猪细胞由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率根据本发明的一个实施例，该载体可以进一步包含启动子，启动子可以与目的基因可操作地连接这里所使用的术语“连接”应作广义理解，可以为直接相连，也可以为通过媒介间接相连“可操作的连接”的意思是指，启动子能够发挥其正常生物学功能，从而影响目的基因的表达根据本发明的实施例，可以采用的启动子的类型不受特别限制根据本发明的一些示例，所述启动子可以为真核细胞启动子根据本发明的具体示例，更优选所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种根据本发明的一个具体示例，最优选所述真核细胞启动子为CAG启动子由此，可以提高目的基因在猪细胞中的表达效率发明人惊奇地发现，当采用CAG启动子时，能够显著地提高目的基因在猪细胞中的表达根据本发明的其他实施例，所述真核细胞启动子为组织特异性启动子由此，可以根据猪细胞的类型，选择适当的启动子，从而获得能够实现目的基因的组织特异性表达根据本发明的一个实施例，该载体可以进一步包含内含子(Intron)序列，其中， 内含子htron序列与目的基因可操作地连接由此，可以进一步提高目的基因在猪细胞中的表达效率根据本发明的实施例，内含子的类型不受特别限制3、一组适于转化猪细胞的载体为了能够提高转化猪细胞，表达目的基因的效率，本发明还提出了一组适于转化猪细胞的载体根据本发明的实施例，该一组适于转化猪细胞的载体包括第一载体和第二载体根据本发明的实施例，第一载体包括第一核酸序列，所述第一核酸序列适于在 Φ〇31整合酶的介导下与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组；以及目的基因根据本发明的实施例，第二载体包括编码OC31整合酶或其功能等同体的核酸序列由此，在将第一载体和第二载体都引入到猪细胞后，第二载体能够在细胞中表达OC31整合酶或其功能等同体，从而可以介导第一载体中所包含的第一核酸序列与猪基因组的假attp位点发生重组，从而将第一载体所携带的目的基因引入到猪细胞中，并且与猪基因组发生整合，实现在猪细胞基因组中的特定位点引入外源DNA即目的基因在本文中所使用的“功能等同体” 指的是能够与OC31整合酶发挥类似的功能，介导目的第一核酸序列与猪基因组假attp位点(在本文中，有时也将猪基因组假attp位点简称为“猪假attp位点”)重组的蛋白质下面对第一载体和第二载体进行详细描述根据本发明的实施例，第一核酸序列的具体序列并不受特别限制，只要其能够在 Φ〇31整合酶的介导下与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的序列发生重组即可根据本发明的一个实施例，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列发明人发现，SEQ ID NO 4所示的序列，能够有效地与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列发生重组由此，可以有效地提高第一核酸序列与猪假attp位点发生重组的效率，从而提高将目的基因引入到猪细胞中的效率根据本发明的实施例，编码Φ031整合酶或其功能等同体的核酸序列的具体序列并不受特别限制，只要其编码产物能够介导第一核酸序列与猪假attp位点发生重组即可 根据本发明的一个实施例，所述第二载体包括如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列发明人发现，这可以显著提高将目的基因引入猪基因组中的效率为了便于利用这些载体转化猪细胞，第一载体和第二载体还可以分别具有其他的元件，以赋予其附加的功能和效果根据本发明的一个实施例，所述第一载体进一步包括编码第一筛选标记的核酸序列根据本发明的实施例，所述筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种根据本发明的具体示例，所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种根据本发明的一个实施例，所述第二载体进一步包括编码第二筛选标记的核酸序列根据本发明的实施例，所述第二筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种根据本发明的具体示例，所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种关于筛选标记的效果，在前面已经进行了详细描述，不再赘述根据本发明的实施例，第一筛选标记可以与第二筛选标记不同由此，可以实现对同时接受第一载体和第二载体的有效检验根据本发明的一个实施例，第一载体可以进一步包括第一启动子该第一启动子与目的基因可操作地连接根据本发明的实施例，第一启动子可以为真核细胞启动子根据本发明的一些示例，真核细胞启动子可以为CAG启动子根据本发明的具体示例，真核细胞启动子可以为组织特异性启动子根据本发明的一个实施例，第一载体可以进一步包括第一增强子序列，所述第一增强子序列与所述目的基因可操作地连接根据本发明的一个实施例，第二载体可以进一步包括第二启动子该第二启动子与编码OC31整合酶或其功能等同体的核酸序列可操作地连接根据本发明的实施例，第二启动子可以为真核细胞启动子根据本发明的一些示例，真核细胞启动子为CAG启动子根据本发明的具体示例，真核细胞启动子为组织特异性启动子由此，可以有效地提高OC31整合酶或其功能等同体在猪细胞中的表达效率，从而进一步提高将目的基因引入猪基因组中的效率根据本发明的一个实施例，第二载体可以进一步包括第二增强子序列该第二增强子序列与所述目的基因可操作地连接由此，可以进一步提高OC31整合酶或其功能等同体在猪细胞中的表达效率，从而进一步提高将目的基因引入猪基因组中的效率关于启动子和增强子，前面已经进行了详细描述，不再赘述4、转基因猪细胞或其培养物及其制备方法根据本发明的实施例，本发明提出了一种转基因猪细胞或其培养物，其特征在于， 在所述转基因猪细胞的1号染色体上包含表达外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1号染色体的假attp位点中由此，可以有效地利用猪细胞或其培养物，表达外源基因， 并且不会影响猪细胞的正常生理活动根据本发明的实施例，猪1号染色体的假attp位点具有如SEQ ID NO 3所示的寡核苷酸序列作为核心区根据本发明的具体实施例，该转基因猪细胞是通过借助猪基因组假attp位点和噬菌体Φ031整合酶，将外源DNA整合到猪基因组第1号染色体的特定位点中即假attp位点而获得的，并且惊奇地发现，在将外源DNA 引入到该特定位点后，对于猪基因组中的其他基因表达并不会造成不利的影响，从而不会影响猪细胞的正常生理活动，便于对猪进行遗传改造，进行相关的研究在本文中所使用的术语“培养物”应做广义理解，其可以是指将转基因细胞在适于存活的状态下维持一定时间后所得到的产物，期间也可以进行实验操作，例如培养物可以是将转基因细胞进行扩大培养后所得到的产物，也可以是通过手工克隆方法得到的转基因猪，也可以是从该转基因细胞分化或者去分化得到的细胞、组织、器官或者个体另外，根据本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前述转基因猪细胞的方法包括下列使用前面所述的一组适于转化猪细胞的载体转化猪细胞，以便获得转基因猪细胞；以及分离转基因猪细胞关于所述的一组适于转化猪细胞的载体，即前面所述的第一载体和第二载体，在前面已经进行了详细描述，不再赘述发明人发现，利用该方法，能够有效地获得在1号染色体上包含外源基因的转基因猪细胞并且惊奇地发现，通过该方法，将外源DNA引入到猪基因组的1号染色体后，对于猪基因组中的其他基因表达并不会造成不利的影响，从而不会影响猪细胞的正常生理活动，便于对猪进行遗传改造，进行相关的研究在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作根据本发明的实施例，第一载体和第二载体被引入到细胞中的顺序不受特别限制，可以是同时被引入到细胞中，也可以是依次引入到细胞中，既可以先引入第一载体，也可以先引入第二载体根据本发明的实施例，利用第一载体和第二载体共转化所述猪细胞即同时将第一载体和第二载体引入到猪细胞中根据本发明的实施例，实现利用第一载体和第二载体共转化的方法并不受特别限制根据本发明的具体实施例，可以通过脂质体法进行所述共转化由此，可以提高转化利用第一载体和第二载体转化猪细胞的效率另外，用于转化猪细胞的第一载体和第二载体的量的比例并不受特别限制根据本发明的实施例，第一载体与第二载体的质量比为1 1 5，优选1 1由此，可以实现较高的共转化效率，并且能够进一步提高将目的基因整合到猪基因组第1号染色体上， 从而实现目的基因在猪细胞中的稳定持续的表达5、确定猪基因组中假attp位点序列的方法根据本发明的又一方面，本发明提出了一种确定猪基因组中假attp位点序列的方法根据本发明的实施例，参考图1，该方法包括下列步骤SlOO 根据前面所述的方法制备转基因猪细胞，即通过将包含能够与attp位点重组的核酸序列的载体，以及包含编码噬菌体6C31整合酶的核苷酸的载体共转化猪细胞， 得到转基因猪细胞，关于如何利用两种载体转化猪细胞，得到转基因猪细胞，前面已经进行了详细描述，不再赘述S200 在得到转基因猪细胞之后，从转基因猪细胞中分离转基因猪细胞的基因组 DNA0根据本发明的实施例，从细胞中分离基因组DNA的方法，并不受特别限制，可以使用商业化的试剂盒进行基因组DNA的提取S300在分离转基因猪细胞的基因组DNA后，使用限制性内切酶对所得到的基因组DNA进行酶切消化，以便获得具有粘性末端的DNA片段通过利用限制性内切酶对所得到的基因组DNA进行酶切消化，可以将基因组DNA进行片段化，从而可以得到包含发生重组的片段并且在所得到的DNA片段的末端具有限制性内切酶酶切处理所形成的粘性末端根据本发明的实施例，用于进行酶切处理的限制性内切酶的类型和数量并不受特别限制根据本发明的一个实施例，所述限制性内切酶为BamH I和Bgl II的组合由此，可以有效地从猪基因组中分离出含有attp位点的片段，另外，发明人惊奇地发现，当采用BamH I和Bgl II的组合进行酶切消化时，所得到的DNA片段的长度适于后续的操作，不会过长或者过短而无法进行分析S400 在获得DNA片段后，可以将所得到的DNA片段与相应的接头相连，以便获得连接产物由于在使用限制性内切酶进行酶切消化之后，所得到的DNA片段，其具有粘性末端，因而可以通过使用具有与粘性末端相应的接头与该DNA片段进行连接这里所使用的术语“相应的接头”指的是该接头具有与DNA片段的粘性末端相匹配的突出端，从而，可以利用常规的手段，将该接头与所得到的DNA片段进行连接，以便于后续的操作根据本发明的实施例，接头的序列并不受特别限制，可以根据限制性内切酶消化处理所形成的粘性末端来选择相应的接头例如，当采用BamH I和Bgl II的组合进行酶切消化时，可以采用这样的一种接头该接头由第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链构成，其中，第一寡核苷酸链具有如SEQ ID NO 6所示的寡核苷酸序列，第二寡核苷酸链具有如SEQ ID NO 7所示的寡核苷酸序列由此，可以进一步提高接头与DNA片段的连接效率，从而进一步提高确定假attp 位点序列的效率该接头，可以通过分别合成第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链之后，进行退火处理，而形成S500在获得连接产物后，通过使用第一 PCR引物组，对所述连接产物进行第一 PCR扩增，以便获得第一扩增产物其中，第一PCR引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物特异性识别接头，所述第二引物特异性识别第一核酸序列由此，可以有效地获得含有部分假attp序列的扩增产物根据本发明的具体示例，当采用由SEQ ID NO 6和7所示的寡核苷酸序列构成的接头，并且采用包括如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的第一核酸序列时，所述第一引物具有如SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如 SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列发明人发现，采用该组PCR引物，可以更有效地对连接产物进行扩增S600 在进行第一PCR扩增，得到第一扩增产物之后，使用第二PCR引物组，对所述第一扩增产物进行第二 PCR扩增，以便获得第二扩增产物，其中，第二 PCR引物组包括第三引物和第四引物，所述第三引物特异性识别接头，所述第四引物特异性识别所述第一核酸序列由此，可以进一步提高PCR扩增的特异性当，所述第一引物具有如SEQ ID N08所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列时，优选所述第三引物具有如SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列；所述第四引物具有如SEQ ID N011所示的核苷酸序列S700 在得到第二扩增产物之后，对第二扩增产物进行测序，以便获得测序结果 由于第二扩增产物中包含猪基因组假attp位点的部分序列，因而测序结果中包含所述假 attp位点的部分序列对于扩增产物进行测序的方法，并不受特别限制根据本发明的实施例，可以通过将扩增产物与质粒连接，并通过质粒的测序引物进行测序由此，可以方便快捷地获得扩增产物的序列信息