专利名称：人对氧磷酶2基因148位点g/a多态检测试剂盒的制作方法SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。SNP现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析、关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。聚合酶链式反应-限制性片断长度多态 (PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本检测SNP基因型的经典方法。该方法原理是限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4 6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法主要优点在于操作简便，快速，终点判断准确。主要缺点在于酶切位点的选择，并不是所有的SNP 位点都可以使用该方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵。对氧磷酶(paraoxonase，PON)是由肝脏合成的一类与高密度脂蛋白结合的芳香醇。早在1953年就被发现，因其能水解神经毒杀虫剂对氧磷(paraoxon)而被命名为对氧磷酶。目前发现哺乳动物对氧磷酶基因家族有3个成员P0N1、P0N2和P0N3，它们具有结构同源性和相似的酶活性。这三个基因具有高度结构同源性，在氨基酸水平和核苷酸的水平上分别有大约65%和70%的同一性。人P0N2基因位于7号染色体，该基因第5外显子多态即C/G碱基变异可引起第 148位氨基酸变异(Gly/Ala)，常记为G148A多态，该多态可能影响P0N2的功能。美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)可查阅 P0N2基因及其多态序列和相关信息，该多态在SNP数据库中编号为rsl2026。因此，通常该多态在人群中存在三种P0N2基因的基因型GG型(人体基因组rsl2(^6多态位点的两个等位基因碱基均为G)，CG型(人体基因组rsl2026多态位点的两个等位基因碱基分别为C 和G)和CC型(人体基因组rsl2(^6多态位点的两个等位基因碱基均为C)。目前人P0N2基因多态rsl2026的鉴定常采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人P0N2 基因多态rsl2(^6时常使用内切酶i^u4H I进行鉴定，，该内切酶的价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可以参考后面的表1)，影响了实验的费用，难以在实验室中普及使用。并且由于传统PCR-RFLP方法的固有缺陷，本领域技术人员通常难以选择其他限制性内切酶对人P0N2基因多态rsl2(^6进行鉴定。 因此，本领域存在对操作简单，成本低，使用范围广的新型检测SNP的方法的需求。
本发明提供了一种操作简单，成本低，使用范围广的鉴定人P0N2基因多态性 rsl2026的方法，其包括以下步骤a)提供待测人基因组DNA ；b)使用扩增人P0N2基因多态性rsl2(^6位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；以及d)对所述酶切产物进行电泳，以鉴定人P0N2基因多态性rsl2026，其中，所述反向引物3’末端与多态位点相邻，反向引物中与多态位点下游第四个碱基A相配的碱基由原始序列中的T更改为错配后的碱基G，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成GAGAC结构，错配后原序列CAGAA 或GAGAA更改为CAGAC或GAGAC (其中第一个碱基为rsl2(^6多态，第五个碱基为引物中错配碱基G所配对的碱基C)，其中当多态等位基因为G时形成GAGAC序列(与GTCTC互补) 可被识别该序列的内切酶BsmAI或Alw26I识别，进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型，更具体地，经序列分析和文献查阅可知，原有检测该C/G多态的方法可使用表1中前四种内切酶，如通过碱基错配PCR将多态位点后面第四位碱基A替换为C，则该多态可由 BsmAI内切酶及其同裂酶(isoschizomer，来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶)识别，即G等位基因可被BsmAI内切酶及其同裂酶识别并切开，而C等位基因不能切开。下表1中提供了 NEB公司内切酶价格信息(从http://WWW. neb-china, com获取) 作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。表1 NEB公司几种内切酶识别序列及其价格人对氧磷酶2基因148位点G/A多态检测试剂盒，包含扩增人PON2基因多态性rs12026位点附近序列的正向引物和反向引物以及限制性内切酶，所述正向引物如SEQ ID NO12所示，所述反向引物如SEQ ID NO13所示，所述限制性内切酶是BsmAI。本发明操作简单，成本低，使用范围广。