专利名称：健康食品及其制造方法以及干燥物或提取物的制作方法 近年来，对以替补治疗为目的，利用来自天然的各种草药，中药，植物的花、叶、茎、根或者皮等的健康食品等的需要越来越高。这时因为现在是“营养”和“美味”均被充分满足的饱食时代，人们的关注开始转移到改善食物、饮食方法来预防生活习惯病等上来。特别是对于预防疾病，与医药品相比较，营养补充品或特定保健用食品等健康食品等副作用少，更加安全，因此可长期摄取，一般比较容易接受。另外，对于患有并发症的患者，药物的重复给予会成为危险，因而有停用一部分或者全部的药物，代而食用健康食品作为代替物的需要。健康食品中，特别将通过调节生理系统有助于预防疾病的新食品称为功能性食品，但这些健康食品与医药品不同，它是作为预防疾病、调节机体的方法，目的主要是为了让健康人长期食用。但是，夹竹桃科植物小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶中含有conophylline(克农菲林，一种长春碱类衍生物)，已知克农菲林作为抗肿瘤剂是有用的(例如，参考Drugs Exptl.Clin.Res.22，35-40，1996)。另外，已知克农菲林将胰腺腺泡瘤细胞株AR42J-B13细胞分化为胰岛素生成细胞(参考第45回日本糖尿病学会年度学术会议(東京；2002年5月18日发行的摘要集的01-21))，在该条件下分化形成的胰岛素生成细胞在细胞外不释放胰岛素。另外，还不清楚克农菲林是否可以在个体水平使血糖值降低。发明的揭示发明要解决的课题本发明的目的是提供用于预防或者改善糖尿病的含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的干燥物或者提取物以及含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为效成分的健康食品及其制造方法。解决课题的方法本发明者，使用氯仿100L，从小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶4kg中提取油状物质(约130g)，再通过硅胶柱色谱法分离·精制油状物质，得到克农菲林(约500mg)，将其投与由链脲菌素(streptozotocin)诱导的糖尿病大鼠，发现血糖值下降。另外发现了小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)的叶的提取物以及重瓣马茶花(crape jasmine，日本产的狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的提取物显示了与克农菲林相同的药效。由此提示，在这些叶的提取物中不含有抑制克农菲林作用的抑制物质。还清楚了，只要低浓度地使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶的提取物，并没有细胞毒性。这样完成了本发明。还已知Ervatamia与Tabernaemontana是同一属(参考J.of Ethnopharmacology 10，1-156，1984)。本发明最大程度地利用了从天然物中得到的克农菲林。即，本发明涉及的健康食品是用于预防或者改善糖尿病的健康食品，其特征在于，含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分。另外要指出，上述健康食品用于预防或者改善糖尿病。
并且，本发明涉及的健康食品是用于降低血糖值的健康食品，其特征在于，含有小叶狗牙(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontanadivaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分。另外要指出，上述健康食品用于降低血糖值。
另外，本发明涉及的健康食品还可含有肝细胞生长因子，还可含有烟酰胺。
本发明涉及的制造方法是为预防或者改善糖尿病的健康食品的制造方法，其特征在于，使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为原料。
另外，本发明涉及的制造方法是为降低血糖值的健康食品的制造方法，其特征在于，使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为原料。
在本发明中还含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的干燥物、上述叶或上述叶的干燥物的提取物。
另外，上述干燥物中包括使小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶直接干燥所得的干燥物、使上述叶的粉碎物干燥所得的干燥物、使上述叶直接干燥、粉碎所得的干燥物。
另外，上述提取物是指以下物质，即，向小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶或者其干燥物中加入溶剂，使叶或者其干燥物中所含有效成分(特别是克农菲林)提取到溶剂中的提取液(除去或不除去叶的残渣均可。另外浓缩、稀释均可)，或者通过除去该提取液中的溶剂而得的固形物。
相关文献的参考另外，本申请要求以2004年4月14日提交申请的日本专利特愿2004-118539号为基础的优先权。在本说明书中引用该文献。
附图的简单说明

图1是本发明的一实施例中，小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶对AR42J细胞的影响的示意图。
图2是显示本发明的一实施例中，克农菲林对投与链脲菌素的大鼠的血糖值的影响的图。
图3是显示本发明的一实施例中，研究5个馏分中所含各成分的细胞毒性的结果的图，该5个馏分是用硅胶柱色谱法处理小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)的叶的甲醇提取物而得。另外，图中“○”表示馏分1的结果、“□”表示馏分2的结果、“×”表示馏分3的结果、“△”表示馏分4的结果、“*”表示馏分5的结果。
图4是显示本发明的一实施例中，小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者重瓣马茶花(日本产的Tabernaemontana divaricata)的叶的甲醇提取物对K-ras-NRK细胞的影响的图。
实施发明的最佳方式如上述，小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶中所含的克农菲林在体内具有使诱发糖尿病的大鼠的血糖值下降的作用，小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)的叶的提取物显示了与克农菲林同样的药效，因此认为，含有克农菲林的小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分的健康食品也可使血糖值下降。另外也提示，重瓣马茶花(日本产的Tabernaemontana divaricata)的叶的提取物也具有与克农菲林相同的药效，因此认为，含有克农菲林的重瓣马茶花(日本产的Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分的健康食品也可使血糖值下降。由以上认为，含有克农菲林的小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作有效成分的健康食品对于预防或改善糖尿病(特别是2型糖尿病)、肥胖症是有用的。一般对于不需要采用医药品治疗，但如不采取措施将很可能患上糖尿病、肥胖症的人来说，运动、饮食限制等指导是非常困难的。但是，这些人通过服用含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作有效成分的健康食品，不用运动、饮食限制，就可预防或改善糖尿病、肥胖症。
另外，健康食品中，通过使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物可能有效的利用克农菲林，从小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶中制备克农菲林的过程是非常繁杂的，且得到的精制量也很少。
实施例小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontanadivaricata)的叶的干燥物可通过自然干燥、冷冻干燥、温风干燥等方法干燥小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontanadivaricata)的叶或者粉碎了的小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶来得到，小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的干燥粉末可通过粉碎该叶的干燥物得到。
另外，小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontanadivaricata)的叶的提取液可通过以下方法得到，即，向小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶或者其干燥物中添加溶剂，使其所含的有效成分提取到溶剂中。作为上述溶剂，例如可使用水、醇、醋酸乙酯、氯仿或者2种以上的混合溶剂，从安全性的方面来考虑，较好使用水、乙醇或者它们的混合物。另外，将有效成分提取到溶剂的过程中，可通过搅拌、粉碎、加热等辅助作用来达到增加有效成分的提取量以及缩短有效成分的提取时间。本实施的方式中，可以不从小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的提取液中除去叶的残渣而直接作为健康食品使用，也可使用通过过滤法或离心分离法除去了提取液中的叶的残渣的提取液。
另外，通过使溶剂蒸发，或者使其干燥除去溶剂，可从溶剂中提取了有效成分的提取液得到固形物。另外，提取液的干燥中，可采用例如自然干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等方法。
作为本发明涉及的健康食品的使用方式，可例举如茶这样的将干燥叶浸泡在热水中提取的饮料、如果汁(日文青汁)这样的加水用粉碎机粉碎的饮料、如中药这样煎煮干燥叶的饮料制成胶囊、片剂、颗粒等形状的营养补充品、口香糖、糖块(糖果、水果糖等)、撒在饭上的粉状食品等，但不限于此。
另外，本发明涉及的健康食品的形式是含有小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分的食品，也可含有诱导胰内分泌细胞的前体细胞向胰内分泌细胞分化的肝细胞生长因子(HGFHepatocyte Growth Factor)、烟酰胺等其它物质，除此之外，还可含有不妨碍预防或改善糖尿病、肥胖症和血糖值下降的物质，从安全性方面来考虑，特好为天然物或者来自天然的物质，可例举如脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin)、锌、镁、铬、吡啶甲酸铬以及抗氧化物质等。脱氧野尻霉素在桑叶或茶叶中含有较多，可抑制将淀粉或蔗糖分解成葡萄糖的α-糖苷酶，可抑制小肠对葡萄糖的摄取，可抑制餐后血糖值的上升。另外，锌有助于胰细胞生成、分泌胰岛素，镁、铬、吡啶甲酸铬等可提高胰岛素的敏感性，激活胰岛素的作用。另外，作为抗氧化物质，例如可使用维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、多酚等。
另外，本发明涉及的健康食品最终可以是固形物、粉末、液状、流体状、奶油状、凝胶状等任意形状。另外，本发明涉及的健康食品基本上是以让健康人服用为目的，但是患有该健康食品有效的疾病的患者，也可以服用该健康食品。
实施例以下，通过实施例和图来详细说明。
将小叶狗牙花(Ervatamia microphylla；采自泰国的坤敬市)的叶在60℃干燥2小时，用氯仿100L从该干燥物4kg中提取油状物质，将该油状物质(约130g)通过硅胶柱色谱法(在充填有约500g硅胶的柱上进行5次回流，依次用氯仿∶甲醇为40∶1，20∶1的溶液洗脱吸着物)分离，回收诱导K-Ras-NRK细胞产生形态变化的活性馏分。接着，通过使用n-己烷∶醋酸乙酯为1∶2的溶液以及醋酸乙酯溶液的硅胶柱色谱法(使用约500g的硅胶)和使用n-己烷∶醋酸乙酯∶氯仿为9∶3∶1、6∶3∶1的溶液的硅胶柱色谱法(使用约150g的硅胶)分离该回收的活性馏分，通过浓缩活性馏分来精制克农菲林(500mg)。
本发明者发现了，如在添加了克农菲林的培养液中培养AR42J细胞(ATCCCRL 1492)，则会诱导该细胞分化成胰岛素生成细胞。在此，研究了Ervatamiamicrophylla的提取物是否可以诱导AR42J细胞分化成胰岛素生成细胞。另外，为观察胰岛素生成细胞的分化诱导中的特征的细胞的形态变化，在本实施例研究了作为分化诱导指标的AR42J细胞的形态变化。另外，AR42J细胞的培养是在如下的培养液中进行的，即，在20mM HEPES-NaOH的存在下，调整Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；日水制药株式会社)的pH为7.4，之后进行过滤灭菌，再加入0.6g/l谷氨酰胺(关东化学株式会社Tokyo，Japan)、0.2g/l卡那霉素(Sigma Chemical Science；SigmaSt.Louis，MO，USA)、100unit/ml青霉素G(Sigma)、5mM NaHCO3、10％胎牛血清(FBS；Sigma)。
24孔塑料板(Corning)中接种AR42J细胞的悬浮液(4.0×105cells/ml培养液)，每孔500μl(2×105cells/well)，在37℃、5％ CO2的条件下进行培养。次日，向培养液中添加用甲醇稀释由实施例1精制的克农菲林而得的稀释溶液(最终浓度为0.1μg(与Ervatamia microphylla的叶的干燥物800μg相当)/ml)、Ervatamia microphylla的叶的干燥物的悬浮液(最终浓度30μg/ml)，在5％ CO2的条件下，于37℃培养3天。另外，Ervatamiamicrophylla的叶的干燥物的悬浮液(浆状的液体)是使用向Ervatamiamicrophylla的叶的干燥物4.01g中添加水60ml，再用食品粉碎机(粉碎机；岩谷产业株式会社，Tokyo，Japan)粉碎所得的悬浮液。
3天之后，将培养液转移到彭道夫管(微量离心管)中，用PBS-(不含Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液；8.0g/l NaCl，0.2g/l KCl，0.916g/l Na2HPO4，0.2g/lKH2PO4)200μl洗涤细胞1次后，加入新鲜的PBS-200μl，观察存活的细胞的形态，用与显微镜相连的照相机以150倍的倍率拍照。另外，用在没有添加克农菲林及Ervatamia microphylla的叶的提取物的培养液中培养的细胞作为对照。结果示于图1(对照图1A、克农菲林溶液图1的B、Ervatamiamicrophylla的叶的干燥物的悬浮液图1的C)。
如图1所示可知，添加Ervatamia microphylla的叶的干燥物的悬浮液，与添加克农菲林溶液同样，可使AR42J细胞的形状从小的球形变平且有一部分突起的形态，即，诱导AR42J细胞向胰岛素生成细胞分化。由此可知，即使不精制克农菲林，使用Ervatamia microphylla的叶也可诱导细胞向胰岛素生成细胞分化。
另外可知，与使用从小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶精制的克农菲林相比，使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶能在叶使用量少的情况下，进行向胰岛素生成细胞的分化诱导。因此可知，即使不精制克农菲林，直接使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶也不阻碍向胰岛素生成细胞的分化诱导。
对出生一日龄的Wister大鼠(由静冈市的SLC公司购入)10只，分别以85μg/g体重的剂量腹腔注射破坏胰β细胞、使胰岛素产生下降从而诱发糖尿病的链脲菌素(由和光纯药购入，溶于0.05mM枸橼酸缓冲液(pH4.5)中)。另外，给予链脲菌素的日期定为第0日。从次日(第1日)开始，对5只大鼠以5μg/g体重的剂量，连续7日皮下注射由实施例1所得的克农菲林的溶液(乙醇)，并每日测定预定时间的血糖值。另外，对照组的大鼠5只给予等量的溶剂(对照)。结果如图2所示，对于任一大鼠给予链脲菌素后血糖值均显著上升，然而给予克农菲林的大鼠(●)与对照(○)相比，血糖值明显降低，提示克农菲林具有降低血糖值的作用(*P＜0.05，**P＜0.01，均与对照相比较)。
这样，在大鼠体内确认了克农菲林的降低血糖值的作用。因此，认为，直接使用含有克农菲林的小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶或者其干燥物，也可使机体的血糖值下降。这种情况时，认为，直接使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶或者其干燥物，能以较少的叶的使用量使血糖值下降。
接着，研究将含有克农菲林的叶或提取物用于食品、饮料中时Ervatamia叶的细胞毒性。
用粉碎机粉碎小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶5.0g，作为溶剂添加甲醇，搅拌2小时，制造使叶中所含的有效成分提取到溶剂中的提取液。之后，抽滤提取液除去固形物，再浓缩、干燥，得到提取物962.7mg。使所得的提取物溶于甲醇，将甲醇溶液通过硅胶柱，用丙酮/甲苯(1∶8)洗脱，同时并加大丙酮的比率，之后将溶剂变为甲醇/氯仿(1∶4)进行洗脱，同时并提高甲醇的比率(最终比率甲醇100％)，得到5个馏分。之后，浓缩、干燥5个馏分的溶液，回收各馏分的溶液中所含有的成分。使各馏分中的成分分别溶解于甲醇后，分别以1、10、100、1000μg/ml的浓度，添加到K-ras-NRK细胞(4×105个)培养液中，经过24小时培养之后，进行台盼蓝排除试验，评价Ervatamia叶中各馏分的细胞毒性。结果示于图3。
如图3所示，可知使用馏分3及馏分4以高浓度(1000μg/ml)处理K-ras-NRK细胞，会显著引起细胞死亡。因此，明确了只要低浓度使用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶的提取物就没有细胞毒性。另外，其它馏分(1、2及5)没有发现细胞毒性。

已知克农菲林诱导K-ras-NRK细胞的形态变化。在此，研究小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶的提取物是否诱导K-ras-NRK细胞的形态变化。另外也知道，在马来西亚产的Tabernaemontana divaricata的叶中也含有克农菲林(Org.Biomol.Chem.11292-1297，2003)。因此，也研究了日本产Tabernaemontana divaricata的重瓣马茶花的叶的提取物是否诱导K-ras-NRK细胞的形态变化。另外，与实施例4中记载的方法相同，各叶的提取物通过以下的方法调制，即，使叶中所含的有效成分用甲醇提取到溶剂中，之后，抽滤除去固形物，浓缩、干燥，将得到的粉末溶解在甲醇中。
24孔塑料板中添加K-Ras NRK细胞的悬浮液(2.0×104cells/ml培养液(在含有5％ FBS的DMEM中添加谷氨酰胺0.6g/l、卡那霉素0.2g/l、NaHCO32.25g/l))，每孔500μl(2.0×104cells/well)，在37℃、5％ CO2的条件下培养。次日，向培养液中添加克农菲林(最终浓度0.1μg/ml)、小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶的提取物(最终浓度10μg/ml)、重瓣马茶花的叶的提取物(最终浓度10μg/ml)，在5％ CO2的条件下，于37℃培养3日。另外，使用在没有添加克农菲林、Ervatamia microphylla的叶的提取物以及重瓣马茶花的叶的提取物的培养液中培养的细胞作为对照。结果示于图4。
如图4所示可知，用小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)的叶的提取物、重瓣马茶花的叶的提取物处理的细胞显示了与用克农菲林处理的细胞相同的形态变化。这提示，这些叶的提取物中不含有阻碍克农菲林的作用的抑制物质。因此可知，即使不精制克农菲林，通过这些叶的提取物等也可获得与克农菲林相同的药效。
产业上利用的可能性通过本发明可提供，为预防或者改善糖尿病的小叶狗牙花(Ervatamiamicrophylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶的干燥物或者提取物以及含有小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶、上述叶的干燥物或者上述叶或上述叶的干燥物的提取物作为有效成分的健康食品及其制造方法。


小叶狗牙花(Ervatamia microphylla)或者狗牙花(Tabernaemontana divaricata)的叶中含有的克农菲林(conophylline)诱导非肿瘤细胞向胰岛素生成细胞分化，可使胰岛素生成，并使血糖值下降。因此，在本发明中，将含有克农菲林的小叶狗牙花或者狗牙花的叶的干燥物以及提取物作为预防、改善糖尿病、肥胖症的健康食品，以及使血糖值下降的健康食品使用。