专利名称：用于气溶胶传递的聚乙烯亚胺:dna制剂的制作方法发明领域本发明一般涉及基因治疗和药物学上的药物传递领域。更具体的，本发明涉及治疗基因的气溶胶化聚乙烯亚胺传递。相关领域的描述与对肺进行基因(裸露DNA形式，病毒或脂质体)的气溶胶传递相关的一种严重问题是与体外转染获得的数据相比，随着喷雾过程效力显著下降(Crook等，1996；Schwartz等，1996；Eastman等，1997 a，b，1998)。另外，已知肺表面活性脂质体和蛋白质抑制阳离子性脂质体介导的转染(Duncan等，1997；Tsan等，1997)。这些效果可能引起已报道的脂类基底的气溶胶化制剂的体内基因转染少，并已减慢了将DNA有效传递给肺的系统的开发。近来，报道含有一种特定阳离子性脂质体(二-鈲-三(氨乙基)胺-胆碱；BGTC)的制剂在喷雾过程中比一些先前测试过的脂质体更稳定。尽管该改进是在气溶胶的体内转染中，这些治疗的临床引用可能需要更有效的传递载体。近年来，已报道聚阳离子在体外和体内都有效转染细胞。一种具有显著活性的衍生物是聚乙烯亚胺(PEI)(Boussif等，1995，1996)。本文报道不仅PEI-DNA制剂抵抗喷雾器引起的转染效力降低，而且制剂在体内转染肺组织中还比脂类基底的制剂更有效，即当用喷射喷雾器体内传递时，聚乙烯亚胺基底的制剂比先前优化的脂类基底的制剂效力约高10倍。这些聚乙烯亚胺基底的制剂在转染肺中更有效，但在小鼠鼻部通道中产生的转染水平较低。聚乙烯亚胺基底的制剂看来是气溶胶传递用于治疗各种遗传性肺部疾病，包括肺肿瘤的基因的良好候选载体，并且能作为遗传免疫的无侵袭性工具。现有技术缺乏气溶胶传递的、用于通过呼吸道进行靶向基因治疗的DNA或治疗性基因的非脂类载体和制剂。本发明填补了本领域这项长期存在的需要和要求。发明简述将质粒DNA用气溶胶传递到肺提供了治疗各种遗传性肺部疾病的无侵袭性方法。然而，喷雾过程常常导致许多载体DNA制剂转染效力迅速丧失。联合适用于DNA传递的气溶胶传递系统的设计，本文报道了用聚乙烯亚胺和大分子(如DNA)，导致高水平肺部转染的制剂，而且这些制剂在喷雾过程中是稳定的。PEI-DNA制剂还显示了对肺的高度专一性，并且是无毒的。已在体外和体内转染中测定了最佳PEI-DNA比和浓度。一种血清因子似乎可增强PEI介导的转染，其中表面活性剂具有轻微抑制效果。本发明的一个目的是提供阳离子性、非-脂类载体和制剂，用于气溶胶传递通过呼吸道靶向基因治疗的DNA或治疗基因。在本发明的一个实施例中，提供了一种通过呼吸道靶向基因治疗的方法，包括步骤通过需要治疗的病人的呼吸道传递由治疗基因与聚乙烯亚胺复合的小颗粒气溶胶形成的水相分散体。在本发明的另一个实施例中，提供了用于通过小颗粒气溶胶传递治疗基因的聚阳离子-DNA，含有聚乙烯亚胺和编码治疗基因的DNA。在本发明的另一个实施例中，提供了通过小颗粒气溶胶传递治疗基因的聚乙烯亚胺-DNA组合物，它是用包括下列步骤的方法制备的将编码治疗基因的DNA溶于合适的溶液；将聚乙烯亚胺溶于合适的溶液；将溶解的DNA与溶解的聚乙烯亚胺混合，制成聚乙烯亚胺-DNA组合物；将聚乙烯亚胺-DNA组合物置于能喷雾化的装置中，从而产生通过小颗粒气溶胶传递治疗基因的聚乙烯亚胺-DNA组合物。
本发明的其他和另外的方面，特征和优点从本发明的优选例的下列描述中将变得清楚。提供这些实施例是为了公开。
附图简述本文包括的附图使本发明上述特征、优点和目的变得清楚，并能被详细理解。这些图构成了说明书的一部分。应注意，尽管


了本发明的优选例，不应被视为限制本发明的范围。
图1显示了用PEI-DNA以不同N∶P比在不存在血清的情况下转染A549细胞。如所述制备了N∶P比递增的PEI-pCMVβ和PEI-荧光素酶制剂。在整个实验中使用相同的DNA浓度，除了“0”不转染，但受其他相同培养液变化的影响。转染A549细胞6小时，在开始转染48小时后抽提β-半乳糖苷酶或荧光素酶活性。图1A说明在各条件下检测到的β-半乳糖苷酶水平，图1B说明了各条件下检测到的荧光素酶水平。图1C说明了用PEI-pCMVβ(来自图1A中说明的同一实验)转染的细胞测定的蛋白质水平(细胞密度和细胞毒性的近似量度)。所有组N＝3。条代表标准误差。
图2显示了在血清存在下用不同N∶P比的递增浓度的PEI-DNA转染A549细胞。制备了所示N∶P比的递增浓度的PEI-荧光素酶制剂。转染A549细胞6小时，开始转染后24小时抽提荧光素酶活性。所有组N＝3。
图3显示了血清对PEI-pCMVβ体外转染效力的影响。用稳定浓度的DNA(1微克/孔)和聚乙烯亚胺(15纳摩尔/孔)以稳定的N∶P比20转染A549细胞，保温加入物6小时，然后在开始转染48小时抽提β-半乳糖苷酶。所有组N＝3。条代表标准误差。
图4显示了表面活性剂和BAL液对于体外PEI-pCMVβ转染效力的影响。用稳定浓度的DNA(1微克/孔)和聚乙烯亚胺(15纳摩尔/孔)以稳定的N∶P比20转染A549细胞，保温加入物6小时，然后在开始转染48小时检测β-半乳糖苷酶。所有组N＝3。条表示标准误差。
图5显示了聚乙烯亚胺和阳离子脂类在喷雾过程中对于转染稳定性的影响。在样品从喷雾器储器中取出之前，使PEI-pCMVβ和脂类-pCMVβ制剂喷雾化所示的一段时间，并在体外转染(CPRG)试验中用所述培养物中的A549细胞定量监测。所有组N＝3。
图6显示了Balb/c小鼠的体外鼻内处理。在该试验中，在小鼠鼻内施用用聚乙烯亚胺或阳离子脂类BGTC∶DOPE配制的pCMVHi-CAT质粒(含有CAT基因)(图6A)。对所有动物施用等量的DNA(24微克)。首先麻醉动物，在鼻内施用DNA-载体溶液。输液后48小时杀死动物，取出肺，抽提组织并分析(用ELISA)CAT活性的表达。用聚乙烯亚胺或BGTC∶DOPE配制的荧光素酶表达质粒(pGL3)进行相同实验(图6B)。输液后48小时杀死动物，取出肺和鼻组织抽提并如说明的分析荧光素酶表达。各处理组包括6只动物。条表示标准误差。
图7显示了Balb/c小鼠的体内气溶胶处理。在该实验中，使动物间断的以气溶胶形式接触PEI-DNA(氯霉素乙酰转移酶基因)、脂质体-DNA(相同质粒，相同DNA浓度)或无气溶胶接触(对照)。通过将动物置于密封室中，该密封室与PuritanBennett 1600单喷射喷雾器连接，并提供1分钟气溶胶处理，然后延迟9分钟，让动物在重新开始循环前呼吸气溶胶。重复直到喷雾剂液(总共40毫升)用完(约16小时)。气溶胶处理48小时后杀死动物，取下肺，抽提组织，分析(用ELISA)CAT活性的表达。各处理组由6只动物组成。条表示标准误差。
图8显示用PEI-pCMV-hGH遗传免疫的抗体诱导。5只小鼠组通过气溶胶或通过鼻内滴注接触制备的PEI-pCMV-hGH制备物，与用裸露DNA肌肉内注射获得的结果比较。每2周取得血清样品，用ELISA测量抗-hGH抗体的存在。以1∶500的稀释度显示了各组的平均光密度和标准偏差。来自未免疫小鼠的血清背景OD在该试验中是0.1。条表示标准误差。
图9显示了用空气和含有5％CO2的空气产生的PEI-DNA气溶胶在肺部CAT表达作比较。将1毫克CAT质粒与PEI以N∶P10∶1的比例混合，将得到的混合物对小鼠喷雾30分钟。24小时后收集肺，如所述进行CAT试验。值是平均值±SD(n＝每组6只小鼠，p＝0.001)。
图10显示了PEI-DNA气溶胶在肺部的基因表达是剂量依赖性的。用含5％CO2的空气气溶胶化递增剂量的CAT质粒，N∶P比固定为10∶1。传递的DNA总量和传递的PEI-DNA浓度都有增加。24小时后杀死小鼠，收集肺，分析CAT蛋白。值是平均值±SD(n＝每组5只小鼠)。
图11显示了N∶P比对PEI-DNA通过气溶胶传递到肺的效力的影响。用不同的PEI-DNA(N∶P)比和固定量的CAT质粒(2毫克)。用含5％CO2的空气气溶胶化复合物。24小时后杀死小鼠，收集肺，分析CAT蛋白。值是平均值±SD(n＝每组5只小鼠)。
图12显示了N∶P比对肺部荧光素酶基因表达的影响。以不同N∶P比传递固定量的荧光素酶质粒(2毫克)。用含5％CO2的空气气溶胶化复合物。气溶胶化传递24小时后杀死小鼠，收集肺，测定荧光素酶活性。值是平均值±SD(n＝每组5只小鼠)。
图13显示了单次PEI-DNA气溶胶接触后转基因表达的时间过程。图13A用5％CO2-空气以N∶P比15∶1，用2毫克CAT质粒对小鼠喷雾。在不同时间点杀死小鼠，收集肺，立即冷冻。在最后时间点进行CAT试验。值是平均值±SD(n＝每时间点5只小鼠)。图13B用两种不同N∶P比的CAT表达的持续。用5％CO2-空气，以15∶1或10∶1的N∶P比传递给两组小鼠(n＝每组各时间点5只小鼠)2毫克CAT质粒。N∶P比10∶1的时间点是气溶胶接触后1，2，3和6日，15∶1是气溶胶接触后1，3，7和10日。
图14显示了单次PEI-DNA气溶胶接触后转基因的组织分布。用图13中的同一组小鼠(来自10∶1组)。收集不同组织，立即冷冻。在最后时间点分析CAT蛋白。值是平均值±SD(n＝每个时间点5只小鼠)。
图15显示了B16-F10黑素瘤气溶胶基因治疗的肿瘤指标。在0日注射肿瘤细胞，治疗在1日开始。用气溶胶每周两次传递PEI-p53和PEI-RB三周。肿瘤注射后24日，杀死小鼠，对肺称重。以1-4分的标准对肺转移分级。考虑转移和肺重量(p53和Rb组对于对照p＜0.01)计算肿瘤指标。
图16显示了M109腺癌的气溶胶联合治疗的效果。在0日注射肿瘤细胞，处理于1日开始。每周两次传递PEI-p53，还每周两次传递药物9NC四周。四周后，杀死小鼠，称重肺并计算肿瘤病灶。考虑肺重量、肿瘤病灶数目和肿瘤病灶大小，计算肿瘤指标(对于p53和p53+9NC组，对于对照都是p＜0.0001)。
图17显示了在人骨肉瘤肺转移的裸鼠模型中PEI和p53基因的组合物对于肿瘤生长的作用。
发明详述对肺气溶胶传递质粒DNA提供了对肺表面直接施用基因制备物，作为治疗各种遗传性肺部异常的方法的可能性。然而，喷射喷雾的过程迅速降解裸露DNA、病毒载体和许多基于脂质体的制剂。虽然已显示将DNA与阳离子脂类混合能显著稳定质粒DNA，但在喷雾过程中发生活性丧失，严重限制了许多这样的复合物气溶胶传递的效力。联合适用于DNA传递的气溶胶传递系统的设计，已开发了用聚乙烯亚胺(PEI，一种聚阳离子聚合物)和高分子(如DNA)的制剂，得到高水平的肺部转染(比阳离子脂类高10-100倍)，并在气溶胶化过程中显示高度稳定性。另外，这些基于聚乙基亚胺的制剂与DNA-脂质体复合物相比，显示了高度的肺专一性，而且是无毒的。已同时在体外和体内转染中测定了最佳聚乙烯亚胺制剂和聚乙烯亚胺-DNA比和浓度。已调查了聚乙烯亚胺基底的制剂的特性使其能经受喷雾，并且是肺部位点的有效的DNA传递载体。血清中的热-不安定因子似乎增强了聚乙烯亚胺介导的转染，而表面活性剂有轻微的抑制作用。该技术的潜在应用包括遗传免疫的气溶胶化聚乙烯亚胺-DNA的用途。
本发明将通过喷雾器传递。许多喷射喷雾器可用于单剂或低剂量传递水相悬液。本发明的聚乙烯亚胺DNA制剂还可通过超声喷雾传递。因此，还可通过“定量吸入器”的压缩空气或气体分配聚乙烯亚胺和DNA的混合物。
特别是，本发明针对一种靶向治疗(如通过呼吸道基因治疗)的方法，包括步骤将遗传大分子(如治疗基因)与聚乙烯亚胺混合的水相分散体以小颗粒气溶胶传递通过需要该治疗的个体的呼吸道。遗传大分子的代表性实施例包括DNA、RNA、催化活性核酸如核酶、反义寡核苷酸与其他类型的修饰的核酸。本发明的该方法可用于治疗患有囊性纤维变性、哮喘、肺癌、食道癌、结肠癌、白血病、乳腺癌、肉瘤或黑素瘤等疾病的个体。另外，在水相分散体中与聚乙烯亚胺混合的遗传大分子可在含有达10％二氧化碳的空气混合物中施用，从而如下文详述的增强聚乙烯亚胺的作用。
本发明还针对聚阳离子-遗传大分子组合物，用于通过小颗粒气溶胶传递遗传大分子，如治疗基因，该组合物含有聚乙烯亚胺；和遗传大分子。本发明中这些组合物可含有的遗传大分子的代表性实施例包括DNA、RNA、催化活性核酸，如核酶，反义寡核苷酸以及其他种类的修饰核酸。
本发明还针对含有聚阳离子-遗传大分子的组合物，用于通过小颗粒气溶胶传递治疗基因，其中用下列方法制备了组合物，该方法包括步骤将遗传高分子溶于合适溶液；将聚乙烯亚胺溶于合适溶液；混合溶解的遗传大分子和溶解的聚乙烯亚胺，从而产生聚乙烯亚胺-遗传大分子组合物；将聚乙烯亚胺遗传大分子组合物置于能喷雾的装置中，从而产生通过小颗粒气溶胶传递遗传大分子的聚乙烯亚胺-遗传大分子组合物。可包含在本发明的这些组合物中的遗传大分子的代表性实施例包括DNA、RNA、催化活性核酸(如核酶)、反应寡核苷酸和其他类型的修改的核酸。
上述方法和组合物的传递方法包括通过面罩或口腔管和儿童中的氧气罩(另用于分散氧)口腔吸入和鼻部吸入。通常通过喷雾过程形成小颗粒气溶胶。优选的，用喷射喷雾器进行喷雾过程。另外，需要治疗基因含有表达所需的可操作连接元件，代表性治疗基因包括囊性纤维变性跨膜电导调节蛋白基因，编码肿瘤抑制蛋白的基因如p53或成视网膜细胞瘤，或这些基因经基因工程的变体，白细胞介素-2或白细胞介素-12的细胞因子基因，和用作DNA疫苗，将刺激针对肿瘤或其他感染性因子的直接免疫应答的基因。另一种代表性治疗基因是HSV胸腺嘧啶核苷激酶基因。典型的，治疗基因在聚乙烯亚胺中的最终浓度不大于约10微克DNA/50纳摩尔聚乙烯亚胺氮/毫升，不小于约0.1微克DNA/50纳摩尔聚乙烯亚胺氮/毫升。另外，可在上述组合物中加入血清。还可让细胞特异性的配体与聚乙烯亚胺共价偶联，代表性的细胞特异性配体是转铁蛋白。
根据本发明，可使用本领域技术人员能力范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。文献中全面的解释了这些技术。见例如Sambrook，Fritsch&Maniatis，“Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；＂DNACloningA Practical Approach，＂卷I和II(D.N.Glover编，1985)；＂Oligonucleotide Synthesis＂(M.J.Gait编，1984)；＂Nucleic AcidHybridization＂[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；＂Transcription andTranslation＂[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；＂Animal Cell Culture＂[R.I.Freshney，编(1986)]；＂Immobilized Cells And Enzymes＂[IRLPress，(1986)]；B.Perbal，＂A Practical Guide To Molecular Cloning＂(1984)。因此，如果在本文中出现，下列术语将具有下文列出的定义。
“DNA分子”指脱氧核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式，不论是单链或双链螺旋。该术语仅指分子的一级或二级结构，不限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括发现的双链DNA，包括线状DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体。
“遗传大分子”应包括DNA，包括治疗性基因、RNA、催化活性核酸(如核酶)、反义寡核苷酸以及其他类型的修饰核酸。
“启动子序列”是DNA调控区域，能与RNA聚合酶在细胞中结合并引发下游(3’方向)编码序列转录。为了限定本发明，启动子序列的3’末端与转录起始位点结合，并向上游(5’方向)延伸，以包含引发高于背景的可检测水平的转录所必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列内可发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合功能域(共有序列)。真核启动子常常，但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列还含有Shine-Dalgarno序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，它在体内合适调节序列的控制下被转录和翻译成多肽。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于原核序列，真核mRNA的cDNA，来自真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，在宿主细胞中提供编码序列的表达。“顺式元件”是核苷酸序列，也称为“共有序列”或“基序”，它与其他蛋白质相互作用，能上调或下调特定基因座位的表达。“信号序列”还能包括在编码序列中。该序列编码信号肽，在多肽的N-末端，与宿主细胞联系，指导多肽到合适的细胞位点。发现信号序列与各种原核动物和真核动物的天然蛋白有关。聚腺苷酸化信号和转录终止序列常常位于编码序列3’。
“表达控制序列”是控制和调节另一种DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，然后翻译成编码序列编码的蛋白质时，编码序列与转录和翻译控制序列在细胞内“可操纵性连接”，“受其控制”。
“基因”可包括完整基因，如天然存在的基因，即由启动子和/或天然发现的其他序列驱动的编码序列。另外，基因可包含编码序列和异源启动子(有或没有异源转录和/或翻译控制序列)来驱动编码序列的表达。如本文所用的“治疗性基因”通常是具有其天然启动子或异源的驱动表达的启动子的基因，编码具有治疗作用的蛋白质，如编码一种需要的酶基因，该酶本来不存在于细胞中。
通常，与宿主联合使用含有启动子序列的表达载体，该载体促使有效转录和翻译插入的DNA片段。该表达载体通常含有复制起始位点、启动子、终止予以及能在转化的细胞中提供表型选择的特定基因。可根据本领域已知的方法发酵并培养转化的宿主，实现最佳细胞生长。
DNA构建物的“异源”区是在更大的DNA分子中可鉴定的DNA片段，它在天然情况下与该较大的分子无关。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因通常旁侧是在来源生物的基因组中不在该哺乳动物基因组DNA旁侧的DNA。在另一实施例中，编码序列是一种其本身天然并不存在的构建物(如基因组编码序列含有内含子的cDNA或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位突变或天然存在的突变事件不产生本文限定的异源区。
“载体”是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一条DNA片段与其结合，从而引起结合片段的复制。“复制子”是任何在体内作为DNA复制的自主单元起作用；即能在其自身控制下复制的遗传元件(如质粒、染色体、病毒)。“复制起始点”指那些参与DNA合成的DNA序列。
本文所用的术语“气溶胶”指分散在空气中粒径足够细，因而沉降速度足够低，具有相对空气携带稳定性的固体或液体颗粒分散体(Kninght，V.，呼吸道病毒和支原体感染，1973，Lea and Febiger，Phila，PA，pp2)。
本文所用的术语“喷雾”或“喷雾过程”指来自液态来源的细气溶胶产物，即回流、挡板喷雾产云装置的产物(1973年5月)。
本文所用的术语“喷射喷雾器”指一种装置，其中压缩空气膨胀入喷嘴，使静压减小，通过结合的管道从喷雾器储器吸收液体。通过空气喷射将液体打碎成各种各样粒径大小的液体分散体。大部分液滴(约99.92％)撞在密封盒的壁上，流回储器。剩下的小百分比(约0.02％)逃过了冲撞，由压缩气流携带流出喷雾器。这些组成了细液滴气溶胶。
本文所用的“鼻内滴注”是一过程，其中液体被施用于麻醉动物的鼻部，该动物被动鼻部呼吸，从而该动物将液体吸入肺气道。
特别考虑可制备本发明的聚乙烯亚胺(PEI)DNA药物组合物，用于将水相分散体气溶胶传递给个人或动物的呼吸道。本领域普通技术人员可轻易的不经过度实验确定气溶胶制剂的合适剂量。当用于体内靶向基因治疗时，以治疗有效量，即有效表达治疗基因并从而消除或缓解该疾病的量，将本发明的聚乙烯亚胺DNA组合物施给病人或动物。剂量和剂量方案将依赖于疾病性质、特定聚乙烯亚胺DNA组合物的性质(如它的治疗指标)、病人、病人的历史和其他因素。施用的聚乙烯亚胺DNA组合物的量通常在约0.01-1.0毫克/公斤病人体重范围内。时间表将持续到在与治疗的副作用平衡时的最佳效果。见Remington’s PharmaceuticalScience，17版(1990)Mark Publishing Co.，Easton，Penn.；和Goodman andGilman’sThe Pharmaceutical Basis of Therapeutics 8版(1990)PergamonPress；在此引入以供参考。组合物或制剂可含有少量添加剂，如能增强等渗性和化学稳定性的物质，如缓冲液和防腐剂。聚乙烯亚胺DNA组合物通常可以约0.1微克DNA/20纳摩尔PEI氮/毫升-10微克DNA/150纳摩尔PEI氮/毫升的浓度配制。
提供下列实施例是为了说明各种本发明的实施例，不意味着以任何形式限制本发明实施例lPEI-DNA制剂从Aldrich Chemical(Mi lwaukee，WI)获得了PEI(25kD)。以4.3毫克/毫升(氮0.1M)磷酸缓冲液(PBS)制备了PEI储藏原液。DNA每微克含有3纳摩尔磷，在PBS中制备成合适浓度。通过缓慢在PEI中加入DNA，一边剧烈旋转溶液，将PBS中所需量的DNA与PEI混合。然后使溶液在室温下保温15-20分钟，然后使用。得到的配料比表示成PEI氮DNA磷(N∶P)。
实施例2质粒DNA用巨细胞病毒启动子(CMV)和大肠杆菌β-半乳糖苷酶报道子基因(pCMVβ；CLONTECH，Palo Alto，CA)和水母绿色荧光蛋白基因(pEGFP；CLONTECH)评估体外哺乳动物细胞表达。用氯霉素乙酰转移酶基因(pCMVHiCAT)(Genzyme，Inc.，Framingham，MA赠)评估体内转染。插入CMV启动子/增强子修饰荧光素酶质粒(pGL3，Promega，Madison，WJ)，用人生长激素聚腺苷酸化序列(来自MichaelA.Barry at Baylor)作为体外和体内转染的报道基因。用作免疫研究的质粒pCMV-hGH表达人生长激素，获自Michael A.Barry。用上述质粒转化细菌培养物，产生大量质粒DNA，用对于无内毒素的DNA的试剂和柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，然后在无内毒素的水中溶解到所需浓度。
实施例3阳离子脂类的合成阳离子脂类是合成或赠与的。根据Gao和Huang(1991)的方法合成了DC-胆固醇(3(-[N-[(N’，N’-二甲基-氨基)乙烷]氨基甲酰基]胆固醇)。根据Vigneron等(1996)的方法合成了胆固醇鈲(二-鈲-三(氨乙基)胺-胆固醇；BGTC)。从Vical(San Diego，CA)获得了N-(2-羟基乙基)-N，N-二甲基-2，-二(tetradecytoxy)-1-丙铵溴化物(DMRIE)。
实施例4阳离子脂类的制备中性共-脂类-DNA复合物首先通过将阳离子脂类(5毫克/毫升氯仿)与合适体积的二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE；Avanti Polar Lipids；5毫克/毫升氯仿)或胆固醇(5毫克/毫升氯仿；Sigma)混合，并在氮气下干燥，制备所有阳离子脂类DOPE制剂。37℃将脂类混合物溶于叔丁醇中，在-80℃冷冻，冻干至少24小时。-20℃储藏脂类直到使用，此时将它们温至室温并重新悬浮在无菌水(Water forIrrigantion(WFI；Braxter，Deerfield，IL))至少30分钟，然后与DNA混合。冻干的BGTCDOPE制剂在-20℃储藏，在6-8个月或更长时间内是稳定的。
实施例5组织培养从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)购得A549人肺癌细胞系。将细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和50微克/毫升庆大霉素(除非另外标出)的Dulbecco改良必需培养基(D-MEM)或含有10％FBS的RPMI1640(Gibco)中培养。37℃在5％CO2存在下细胞培养箱中培养细胞。仅使用开始8个传代的A549。
实施例6体内转染对于无血清转染，在转染前一日(除非另外标明)将细胞以1.5×l05细胞/孔铺在12孔培养板中。约80％细胞在转染时汇合。PEI-DNA或脂类-DNA复合完成后，将PEI-DNA或脂质体-DNA制剂置于Opti-mem I还原的血清培养基(Opti-mem；Gibco-BRL，Grand Island，NY)中，最终DNA浓度是1微克/毫升。就在转染前，用Opti-Mem漂洗细胞，在每孔中注入1毫升转染溶液(各时间点或条件下通常转染3孔)。以不同氮和磷比(N∶P)，基于PEI(分子量25000；每摩尔581纳摩尔氮)和DNA(每微克3纳摩尔磷)制备了质粒-PEI复合物。24小时后(除了标明更短的转染时间)，除去转染溶液，漂洗细胞，加入1毫升补充的DMEM培养液。然后再培养细胞24小时，用磷酸缓冲盐(PBS)漂洗两次，用裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.5％Triton X-100(Sigma，St.Loui s，MO))裂解，评估β-半乳糖苷酶或荧光素酶表达。
为了确定对于在血清存在下的体外应用中的最佳的聚乙烯亚胺氮DNA磷(N∶P)比和聚乙烯亚胺氮最佳浓度，开发了下列方案1)制备了一定范围的N∶P比的PEI-DNA复合物，使用前在室温下培育15-20分钟；2)将细胞以l05细胞/孔置于24孔板中，在1毫升补充了10％FBS的RPMI1640培养液中37℃培育过夜；3)然后调节各孔中培养基体积，得到所需的最终PEI氮浓度；4)对于各具体N∶P比，在各孔中加入等体积的PEI-DNA溶液；5)37℃培养平板过夜，观察GFP表达或测定荧光素酶表达。
实施例7血清、表面活性剂和支气管肺泡灌洗液对体外PEI转染的作用如上所述将A549细胞铺在平板上并转染。除了不在转染前用Opti-mem混合物制剂稀释，而用含有感兴趣试剂(血清、表面活性剂、或支气管肺泡灌洗液)的Opti-mem稀释。从HyClone Laboratories，Inc.(Logan，UT)得到胎牛血清(FBS)，从Gibco-BRL获得了小鼠和人血清，并从Burroughs WelcomeCo.(Research Triangle，N.C.)获得了合成的表面活性剂(Exoserf，主要含有81毫克/毫升colfasceril棕榈酸酯)。从用甲氧氟烷麻醉并通过腹主动脉放血杀死的未处理小鼠获得了支气管肺泡灌洗液(BAL)。手术暴露气管，并插入PE50导管(外径0.965毫米，Clay Adams)。用总体积为2.0毫升的生理盐水，用1.0毫升体积灌洗肺5次(用附着的装有2毫升盐水的3毫升针筒将体积为1.0毫升的同一液体泵入泵出肺5次)。产率通常是2毫升灌洗液的85％。然后冻干从几只小鼠得到的BAL液，以不同浓度重建，用于转染分析。
实施例8体外转染效力的定量分析细胞裂解后，用来自Pierce(Rockford，IL)的BCA Protein Assay确定裂解液的蛋白质浓度。用氯苯酚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(CPRG。BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)试剂在96孔培养板中定量测定β-半乳糖苷酶活性，并在Dynatech MR500微量滴定培养板读数仪(DynatechLaboratories，Inc.Chantilly，VA)上读数。
用商品试剂根据厂商指导(Promega，Madison，NJ)进行了荧光素酶试验。为了在细胞培养物中进行荧光素酶表达，除去培养基并在各孔中加入1毫升裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)。在旋转振荡器上室温培养平板20分钟后，通过将1-10微升裂解液与50微升底物混合，在TD-20C Luminometer(TurnerDesigns，Sunnyvale，CA)中测量光输出15秒，分析裂解液。
实施例9喷雾化PEI-DNA和脂质体-DNA复合物的功能稳定性将DNA在2.5毫升WFL中稀释到80微克/毫升，制备了PEI-DNA和脂质体-DNA制剂。将适量的脂的2.5毫升WFI溶液加到DNA中或将适量DNA加到PEI的PBS溶液中，室温培养15-30分钟，然后喷雾化。在指定的时间间隔，从喷雾器储器中取出50-70微升等份，制备用于体外转染。在所有研究中用pCMV-β作为报道基因，用12孔培养板中的A549细胞如上所述分析质粒DNA的功能稳定性。应注意要喷射喷雾器产生小颗粒的气溶胶，必须使喷雾器液体持续循环，因为每次仅极小部分喷雾器液(小于1％)作为气溶胶通过喷射喷雾器喷出。大脂质体-DNA颗粒(＞400纳米)在短时间内迅速被处理成更小的颗粒，喷雾器储器内的脂质体-DNA粒径与从All Glass Impringer(AGI-4，AceGlass Co.，Vineland，NJ)回收到的气溶胶颗粒的粒径变得非常相似。
通过除去双喷嘴中的一根修改了Puritan Bennett1600双喷嘴喷射喷雾器(Carlsbad，CA)，称为Puritan Bennett 1600单喷嘴(PB sj)。除非另外说明，PB sj以15L/分钟的流速流动。
实施例10滴注PEI-DNA和脂质体-DNA体内转染如本文所述制备了PEI-DNA和脂质体-DNA制剂，除了将DNA浓度提高到每滴注剂量每40微升6微克(加入合适浓度的脂质体或加入合适浓度的聚乙烯亚胺)。为了减少偶然不完整滴注的变异性(动物有时排出部分已滴注的物质)，每只动物总共滴注4次用同样量在连续2天的上午和下午各滴注1次。在施给制剂前用甲氧氟烷轻微麻醉动物。将动物垂直向上通过后颈背固定，同时缓慢将40微升滴到吸入液体的一个鼻孔中。动物保持向上位置一小段时间，让滴注液到达两肺。已用放射标记脂质体制备物证实了用该方法肺部传递的效力，几分钟后在肺中发现了大部分物质。作为治疗结果，动物不显示明显的生理损伤或抑郁的症状，全面检查肺和其他器官后找不到明显的生理学后果。由于之前的工作已显示表达滴注的报道基因的最佳时间是滴注后1-2日，第一次滴注48小时后杀死动物。
实施例11用PEI-DNA和脂质体-DNA气溶胶体内转染如本文所述制备了PEI-DNA和脂类-DNA制剂，除了将DNA浓度提高到每喷雾器剂量每20毫升2微克(加入合适浓度的脂质体或加入合适浓度的聚乙烯亚胺后)。除非另外说明，PB sj喷雾器以8升/分钟的流速工作。喷雾器流出液通过装有小鼠(通常6-8只)的密封的塑料笼(13×17×30厘米)。气流通过HEPA滤膜从该室中流出，整套仪器置于层流罩下，与外界用HEPA滤膜隔开。为了减少气溶胶的使用，喷雾器在自动控制下每10分钟下工作仅1分钟。当前20毫升悬液消耗完后，在喷雾器中重新补充相同浓度的20毫升。接触需要约12小时，期间提供小鼠食物和水，并允许在室中自由活动。
实施例12体内基因表达的定量分析发现CAT表达测量体内转染效力比用于体外研究的β-半乳糖苷酶更灵敏。在合适的时间点(除非另外说明，48小时)杀死接触气溶胶化制剂的动物，取下肺和气管，冷冻在液氮中。然后将组织在裂解缓冲液中切碎，用Wig-L-Bug玻珠匀浆器(Crescent Dental Mfg.，Luons，IL)匀浆。对于鼻内转染的测定，从头上切下小鼠头部的鼻部分，冷冻在液氮中。研磨冷冻的鼻部分，然后用Wig-L-Bug玻珠匀浆器在裂解缓冲液中匀浆。用商品购得的CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim Gmbh，Germany)分析组织抽提物的CAT含量。ELISA试验获得的结果与用常规TLC法和有机相分离法获得的结果相当或比它们更好。由于事实上在几乎所有体内气溶胶研究中发现了可变性，实验和对照组通常由6-8只动物组成。
为了在滴注或气溶胶传递后体内分析荧光素酶表达，用致死麻醉杀死动物，截断腹主动脉放血，收集肺和气管。在一些研究中，还收集了鼻组织。用锥形底的玻璃组织匀浆器(Kontes Duall 23)在1毫升荧光素酶试验裂解缓冲液中匀浆组织。将10微升的该匀浆液加到50微升底物中，测量光输出。
实施例13
遗传免疫接种使5只一组的小鼠通过气溶胶或鼻内质粒方式接触与PEI混合的pCMV-hGH(N∶P比为10)。作为阳性对照组，5只小鼠在胫前动脉肌肉内通过肌肉内注射接受裸露的质粒(50微升PBS中的50微克)。每隔两周获得顺次的血清样品，用ELISA测定对人生长激素的(纯化的hGH蛋白质来自Cal-Biochem，Sandiego，CA)的总特异性抗体。将未免疫的小鼠血清在各ELISA中作为阴性对照。
实施例14PEI-DNA配料比和浓度的体外优化由于配料比对大部分聚阳离子-DNA制剂的转染效率很重要，在体外用A549细胞在不存在血清的情况下检测了PEI-DNA比和转染之间的关系。如图1A所示，约5的聚乙烯亚胺氮对DNA磷(N∶P)之比对于体外用pCMVβ质粒转染是最佳的，如用β-半乳糖苷酶表达确定的。比例在4以下，转染迅速下降，随着比例提高到5以上也下降。用PEI-荧光素酶制剂获得了非常相似的结果(图1B)。当检测这些比例对来自同一实验细胞抽提物的蛋白质水平(粗略的与细胞密度相关)的作用时，在比例8以下几乎或没有毒性(图1C)。降低用更高比例处理的组的蛋白质水平可能表明了细胞毒性。
由于体内转染必须在胞外液蛋白质的存在下发生，并且由于上述的毒性，用A549细胞在含有10％胎牛血清的培养液中测定了聚乙烯亚胺和N∶P比对转染效力的作用。图2显示了N∶P比为16和PEI浓度50-60纳摩尔/毫升得到的最高度的转染，表明在血清蛋白质存在下，聚乙烯亚胺浓度和聚乙烯亚胺对DNA之比强烈的影响转染效力。特别感兴趣的是最佳N∶P比在血清存在下比无血清存在时高(图1B)。在最佳条件下，总转染效率事实上要高于无血清存在时的效率。在其他细胞中使用相同的优化方案，表明该相对简单的技术对定制具体用途的PEI转染条件是有用的。
实施例15血清和表面活性剂对PEI-DNA体外转染效率的影响虽然先前的报道已显示血清蛋白质会抑制各种阳离子脂类和聚阳离子介导的转染，本文在最佳聚乙烯亚胺浓度和N∶P比条件下观察到的增强引起了血清对聚乙烯亚胺转染效力影响的调查。当检测了0-50％的胎牛血清浓度时，5％-20％的浓度明显增强了体外转染，而更高的浓度(50％)导致转染降低(图3)。与高浓度血清有关的抑制可部分的用提高PEI∶DNA浓度来克服。血清的作用有物种特异性，胎牛和人血清都导致相似的转染增加，而小鼠血清无作用。家兔血清也导致PEI-介导的转染增强。血清的作用看来是热不稳定的，在95℃加热10分钟完全丧失增强作用，虽然在随后的实验中56℃加热30分钟不消除增强作用。
还调查了肺表面活性剂对PEI-介导的转染的影响。用小鼠的支气管肺泡灌洗液(冻干并以递增浓度重新水合)和递增浓度的合成表面活性剂(Exosurf)进行。细胞与相当于6.25％-125％的未冻干BAL液的BAL浓缩液(加到各孔中的浓缩BAL液分别等于各孔中液体总体积0.5-10％)接触。细胞接触Exosurf浓缩液(相当于4.05-81微克/毫升Exosurf中的活性成分colfascerilpalmitate)。如图4所示，较高浓度的BAL液和Exosurf导致转染水平下降，和血清的作用相反，而较低浓度的表面活性剂看来几乎无效。
实施例16喷雾化对脂质体-DNA和PEI-DNA复合物体内转染效力的影响测试了N∶P比为5和10的PEI-DNA制备物在10分钟喷雾过程后的转染效力。在一实验中，使用PEI-DNA制剂(N∶P＝10)导致在用A549人肺肿瘤细胞的体外试验中对照(非喷雾化)物质转染活力平均保持了96％、94％和89.6％。每隔3分钟，从喷雾器储器中取出喷雾器循环物质的等份(起始体积为5毫升)。为了比较，将PEI-DNA制剂、DC-胆固醇∶DOPE∶pCMVβ(2∶2∶1)的制剂喷洒至干(约12分钟)(图5)。本文所用的DC-胆固醇∶DOPE和DMRIE∶DOPE为了A549细胞的体外转染进行了优化，所用的DC-胆固醇∶DOPE比与其他文献中报道的最佳细胞培养物转染的浓度相似(Gao&Huang，1991)。在喷雾器流速为8升时，PEI-pCMVβ(N∶P＝10)制备物的β-半乳糖苷酶活性仅轻微丧失，而DC-胆固醇∶DOPE∶pCMVβ制备物的活性在3分钟内丧失了60％，此后基本无活性。DMRIE∶DOPE∶pCMVβ的活性在3分钟后下降了70％以上，6分钟后下降了约90％。在更高的喷雾器流速，用其他阳离子脂类的制剂(Schwartz等，1996)转染效力丧失更大。有趣的是，PEI-pCMVβ的N∶P＝5制剂随着喷雾增加，转染效力显著增加，可能反映了DNA部分降解，从而有效增加了N∶P比。
实施例17鼻内滴注后脂质体-DNA和PEI-DNA复合物体内转染效力的比较当通过Balb/c小鼠鼻内滴注测试体内PEI∶pCMV-HiCAT制剂(图6A)时，发现PEI-DNA导致的CAT表达在肺中比用BGTC∶DOPE∶pCMV-HiCAT(迄今最稳定和有效的用于体内转染的阳离子脂制剂)高10-20倍。PEI-介导的表达似乎对肺更有效，其中转染比在鼻内高20倍。相反，滴注阳离子脂基底的制剂介导的表达在鼻内比在肺中高。当用PEI-荧光素酶或BGTC∶DOPE-荧光素酶滴注动物时，获得相似的数据(图6B)。
还用鼻内滴注比较了PEI-pCMV-HiCAT不同制剂的体内转染效力。当检测5-20的N∶P比时，发现10-20的比例导致可比水平的CAT体内表达。然而，当PEI-DNA(N∶P为10)的浓度增加数倍，使得在同一滴注体积内传递的DNA剂量高3倍时，未观察到体内报道基因表达的进一步增加。
实施例18脂质体-DNA和PEI-DNA复合物在气溶胶传递后体内转染效力的比较当喷雾传递PEI-pCMV-HiCAT和BGTC∶DOPE-pCMV-HiCAT制剂时(用相同浓度的DNA)，作为肺内的表达载体，聚乙烯亚胺比脂类好10倍(图7)，肯定了滴注获得的上述发现。与滴注发现一致的还有观察到气溶胶传递PEI-基底的制剂导致肺中的转染比鼻内高20倍，而气溶胶化的BGTC∶DOPE-pCMVβ导致鼻内和肺内表达相当的水平。荧光素酶PEI基底的制剂的气溶胶传递还导致有关它们在肺和鼻内的相对效能的类似发现。
实施例19PEI-DNA疫苗气溶胶和滴注给药的遗传接种表达载体气溶胶给药的一种潜在的有价值用途是传递DNA疫苗。为了确定是否能通过该方法实现免疫，通过气溶胶和鼻内滴注施用pCMV-hGH质粒-PEI制备物(N∶P比为10)，而且作为阳性对照，用裸露DNA肌肉内注射。如图8中所示，处理在所有组中引起针对人生长激素的高水平血清抗体。2周时出现充分的抗体应答，在4-8周达到平台。图8中显示了与未免疫动物中0.1的背景OD相比，在1∶500稀释的血清处的最佳密度。在8周时，这些血清的平均滴度分别是对于气溶胶组1∶4,000，鼻内1∶8,000，而肌肉内组1∶16,000。然而如图8所示，所有组都有较大的标准偏差，与之前用肌肉内注射的结果相似。因此，虽然各小鼠的反应高度可变，单剂施用质粒-PEI制备物导致抗体持续8周提示了该接种方法通过鼻内或气溶胶途径使用时具有重要应用性。
遗传物质对肺和气道的有效传递代表了治疗广泛的肺部疾病的具有针对性和非侵袭性的方法。然而，当使用非病毒DNA传递载体来减少与病毒传递有关的病理和免疫学担忧时，肺部位点的转染一般是无效的。这部分是由于基因制备物的传递难于达到肺部环境。另外，与喷射有关的活性丧失限制了该方法对肺部目标传递DNA的价值(Crook等，1996；Schwartz等，1996)。目前的研究发现，当用喷射喷雾传递时，DNA与聚阳离子聚合物聚乙烯亚胺的复合物具有充分的功能稳定性，从而提供了对肺基因传递的可能方法。
已用作DNA传递载体的其他非脂类聚阳离子聚合物包括聚-L-赖氨酸(它仅介导低程度的转染，但通过缀合或掺入促进细胞摄取的药物，获得了显著改进(Wu&Wu，1988；Tang&Szoka，1997))和聚酰氨基胺树枝聚物(dendrimer)(Haensler&Szoka，1993)。另外，与配体(如转铁蛋白(Kircheis等，1997；Ogris等，1998；Ogris等，1999))共价偶联的PEI的修饰形式已显示靶向一些高度特异性的细胞型。甚至报道了当制剂全身施用时，肺中PEI-介导的转染(Goula等，1998)，但是迄今，对于使用非脂类聚合物作为DNA载体传递气溶胶几乎没有注意。本文的发现显示基于PEI的制剂在喷射喷雾的过程中赋予质粒DNA可观的稳定性。就某些PEI基底的制剂而言，转染甚至通过喷雾过程获得了增强。因此看来用气溶胶比阳离子脂类传递到肺后是更有效的转染介导物，而且还具有相对无毒的额外优点。事实上，聚乙烯亚胺易于与位点专一性的配体偶联，这增强了气溶胶传递的PEI-基底制剂的通用性。
通过热不稳定血清因子增强PEI-介导的转染是令人好奇的，虽然目前尚不知道体内基因传递涉及的机制或后果。事实上，当加热血清到100℃以上，作用丧失，驳斥了与小的热稳定因子(如类固醇)有关的可能性。在56℃增强未受影响驳斥了对完整系统的作用。该转染-增强因子将最终证明在改善体内基因转染的整体效力。
当使用两种不同报道基因时，注意到聚乙烯亚胺和阳离子脂(BGTC∶DOPE)的不同区域特异性(肺对鼻)是一种未料到的发现。假定从同一喷雾器中传递的粒径是相似的，观察到的差异可能是由于两种颗粒对粘膜纤维作用的反应差异或鼻和肺部位置的细胞反应的差异。该发现对于传递基因的鼻部表达可导致不良后果的应用是重要的。另一方面，这些不同的传递载体可适用于不同临床用途。在遗传免疫领域，本文报道的发现提示，持续高水平的抗体应答可通过使用将PEI-DNA复合物传递到肺部组织的技术单一施用质粒实现。
由于PEI-DNA制剂可通过气溶胶有效沉淀在肺周围(Weibel生成17-23)，体内呼吸道表皮PEI-介导的转染需要质粒DNA和PEI与肺泡腔的内源表面活性剂脂类和蛋白质接触。用合成表面活性剂(Exosurf)和来自未处理小鼠的支气管灌洗液在体外检测了表面活性剂对PEI-介导的转染的影响。虽然这些物质都导致PEI-介导的转染浓度依赖性的抑制，但是表面活性剂的影响比阳离子脂质体介导的基因转移要低得多(Duncan等，1997；Tsan等，1997)。这些报道说明质粒DNA和质粒DNA-阳离子脂质体复合物的气管吹入导致肺中相似量的基因表达。用PEI-pCMV-HiCAT通过滴注实现了比单用质粒-DNA高得多的肺部表达水平，提供了证据说明肺表面活性剂中和聚乙烯亚胺的基因转移性质的程度未达到它们作用于某些阳离子脂类或阳离子脂类共-脂类制剂的程度。因此，PEI-基底的制剂是相对效力较小的阳离子脂类的有前途的替代品，作为无病毒携带用于气溶胶治疗各种肺部异常。本文提供的结果也显示了传递遗传疫苗的希望。
实施例20动物在下列实验中使用了雌性Balb/C小鼠(5-7周龄)。
实施例21质粒DNA主要用细菌氯霉素乙酰转移酶基因(p4119，ref.15)作为测量转基因表达的报道基因。CAT基因在人巨细胞病毒(CMV)早启动子/增强子元件的控制下。插入CMV启动子/增强子元件和人生长技术聚腺苷酸化序列修饰的荧光素酶质粒(pGL3，Promega，Madison，WI)来自Dr.Michael Barry(Center for Cell andGene Thrapy，Baylor)。所有质粒在Qiagen柱(Qiagen，Valencia，CA)上层析并且无内毒素。用260纳米处的紫外吸光度定量质粒。琼脂糖凝胶分析揭示质粒是主要为超螺旋质粒和少量缺口质粒的混合物。
实施例22PEI-DNA复合物的制备从Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)购得PEI(25kDa，分枝)。以浓度为4.3毫克/毫升(0.1M氮)在PBS，pH7-7.5溶液中制备了聚乙烯亚胺储液。PEI和DNA分别与5毫升水以所需浓度混合。缓慢x旋转PEI溶液，加入DNA溶液，得到最终体积为10毫升。使混合物在室温下放置约15-20分钟，然后喷雾。得到的充填比表达成PEI氮∶DNA磷(N∶P)，可考虑DNA每微克具有3纳摩尔，1微升0.1M PEI溶液具有100纳摩尔胺氮计算。10∶1的N∶P比相当于1.29∶1PEI∶DNA重量比。
实施例23PEI-DNA复合物的气溶胶传递将小鼠置于塑料笼内，用胶带密封，然后气溶胶传递(16)。这是非限制性的，全身气溶胶接触系统。用Aerotech II喷雾器(AT-II)(CIS-US，Inc.，Bedford，MA)以空气或含有5％CO2的空气在10升/分钟流速下气溶胶化PEI-DNA复合物。AT-II是一种高通量、有效的喷雾器，证明产生周围肺传递最佳范围在1-2微米质量中位空气动力直径(MMAD)的气溶胶(17，18)。用Anderson Cascade Impactor(Anderson Instrument s，At lanta，GA)，通过前述方法(18)计算PEI-DNA气溶胶粒径是1.6微米MMAD，几何标准偏差(GSD)为2.9。将干燥空气源(Aridyne 3500，Timeter，Lancaster，PA)传递给与空气压缩器和CO2罐结合的Bird 3M气体混合器(Palm Springs，CA)。将得到的空气和CO2的混合物传递给喷雾器。用Fyrite溶液(bacharach，Pittsburgh，PA)确定了5％CO2在空气中的最终浓度。10毫升溶液的喷雾化用了约30分钟。
实施例24CAT试验在各时间点后麻醉并杀死小鼠，收集肺和其他组织并立即冻干。用CATELISA试验试剂盒(Boehringer Mannheim Gmbh，Mannheim，Germany)测量了体内表达。用Wig-L-Bug玻珠匀浆器(Crescent Dental Mfg.，Lyons，IL)在700微升CAT试验裂解缓冲液中匀浆组织。离心匀浆液后，用200微升抽提物在96孔板形式中进行CAT ELISA试验。用微量滴定板阅读仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)读取吸光度。用新生小鼠作为对照。用纯化CAT酶制作的标准曲线将CAT活性表达成纳克CAT/毫升组织抽提液。根据厂商的提示，可进一步提高该试验的灵敏度，从而可检测低至0.1-0.3皮克/孔的CAT蛋白质水平。
实施例25荧光素酶试验麻醉并杀死小鼠，收集肺。用荧光素酶试验试剂盒(Promega，Madison，WI)测量了荧光素酶表达。用Wig-L-Bug玻珠匀浆器在1毫升荧光素酶试验裂解缓冲液中匀浆组织。离心匀浆液后，在50微升荧光素酶底物中加入10微升抽提物，在光度计(Microlumat LB96 P，EG&G Berthold，Germany)上的96孔板中读数10分钟。用新生小鼠作为对照。荧光素酶活性表示成PLU/10秒/毫升抽提物。在该系统中，107RLU相当于1纳克荧光素酶(使用Promega的纯化荧光素酶)。
实施例26组织切片的组织学分析用异氟烷麻醉小鼠，通过腹主动脉放血杀死。分离肺，插管并通过灌入10％中性缓冲的福尔马林固定，包埋在石蜡中，处理用于组织学分析。切成4微米薄片，用于显微镜观察，用苏木精和伊红染色寻找任何炎症或毒性症状。进行单向方差分析比较均值后，进行双尾不成对Student’s t-检验。如果p≤0.05，认为差异是显著的。
实施例27用5％CO2喷雾化PEI-DNA复合物用5％CO2与正常空气相比喷雾化PEI-DNA复合物增强了肺中的转基因表达呼吸空气中的5％CO2与和小鼠与人中的潮气量和呼吸频率增加有关(19，20，21)。呼吸含有5％CO2的气溶胶导致与空气传递气溶胶相比，吸入更多气溶胶颗粒，并相应的更高的转基因表达。为了调查这一点，用正常空气或含有5％CO2的空气将PEI-DNA复合物气溶胶传递给Balb/C小鼠。将固定量的CAT质粒(1毫克/10毫升溶液)以10∶1的N∶P比如指明的气溶胶化30分钟。24小时后收集肺，进行CAT试验来确定转染程度。含5％CO2的空气导致检测到的CAT水平比单独用空气喷雾化的气溶胶高3倍(图9)。
实施例28DNA通过PEI转移是剂量依赖性的为了进一步优化转基因表达，保持N∶P比为10∶1，DNA量从250微克-4毫克/10毫升气溶胶溶液变化。这导致储器浓度和气溶胶输出中喷雾的总DNA量增加。用含5％CO2的空气和2毫克DNA气溶胶化复合物，得到最高水平的肺CAT表达(图10)。用250微克DNA测量的CAT水平与对照肺无显著差异(p＝0.34)。另外，当将4毫克DNA溶于10∶1的N∶P比的10毫升时，导致可见的DNA沉淀，这可能导致在肺中检测的CAT水平与2毫克(p＝0.51)相比无进一步提高。
实施例29PEI-DNA比的优化为了测定体内气溶胶传递的理想负荷比，评估了PEI-DNA(N∶P)比转染肺的能力。DNA量保持稳定在2毫克，改变聚乙烯亚胺浓度获得5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1和20∶1的比。选择这些比例是基于先前的体外和体内(滴注)研究。用含有5％CO2的空气气溶胶化复合物。15∶1的N∶P比得到肺中最高的CAT表达水平，而5∶1得到非常低的CAT表达水平(图11)。在10∶1、12.5∶1、17.5∶1和20∶1比之间没有统计学上的差异(p＞0.1)，但是在15∶1和20∶1(p＝0.05)之间和10∶1和15∶1(p＝0.014)之间有显著的差异。
为了确定除了CAT以外的质粒的最佳比例，测试了不同N∶P在肺中荧光素酶基因的表达。评估的比例是5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1和40∶1。与CAT相比，荧光素酶的最佳曲线向右漂移，最高表达为20∶1(与其他比例相比，p＜0.05)(图12)。这提示不同质粒可能需要不同的N∶P比。
实施例30单剂气溶胶传递后的CAT表达时间过程下文分析了单剂气溶胶传递后的CAT表达的持续时间。这是计划用于治疗研究的治疗方案的重要信息。用含5％CO2的空气气溶胶化2毫克CAT质粒，以两种不同N∶P比-15∶1和10∶1施给小鼠。对于10∶1组检测的不同时间点是接触气溶胶后1、2、3和6日。在不同时间点收集肺和其他组织，立即冷冻。在最后时间点(第6日)后同时分析所有组织。对于15∶1组，气溶胶处理后在1、3、7和10日杀死小鼠。收集肺，在各时间点后冷冻，在最后时间点(第10日)分析CAT蛋白质。
对于两种检测的N∶P比，CAT表达在24小时时最高，并稳定达3日(在第1日和第3日之间无统计学差异，15∶1比p＝0.4，对于10∶1比，p＝0.12)(图13A和13B)。一周后CAT水平下降到约峰值的50％，并在10日后检测到显著水平(与对照相比p＝0.001)。
实施例31转基因的组织分布静脉内或腹膜内传递DNA载体通常导致在各种组织中的表达。为了确定气溶胶传递PEI-DNA是否也导致全身性基因传递，从上述实验(从10∶1组)的同一组小鼠收集不同组织，在最后时间点后进行CAT试验。检测的组织是肺、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、脑和血液。在非肺组织中检测到的CAT水平非常低，与对照组织相比没有显著差异(对于所有组织p＞0.1)(图14)，表明气溶胶传递PEI-DNA复合物导致高度特异性的肺基因表达，而没有全身性传递。
实施例32组织学分析不显示炎症症状为了测定气溶胶传递PEI-DNA复合物是否在该系统中导致任何毒性或急性炎症，将2毫克CAT质粒与PEI以15∶1的N∶P比混合，使小鼠与气溶胶用含5％CO2的空气接触30分钟。24小时后杀死小鼠，将肺固定在福尔马林中，用苏木精和伊红染色。如图15所示，肺不显示任何组织学异常的证据。用含5％CO2的空气通过PEI-DNA气溶胶优化肺部基因传递看来对于肺是安全而高度特异性的。
实施例33动物研究中PEI-抗肿瘤基因组合物的作用图15和16显示了PEI-抗肿瘤基因组合物在动物研究中的影响。图15显示当用气溶胶每周施用2次，施用4周时，PEI和p53基因、PEI和成视网膜细胞瘤基因的组合物显著降低了黑素瘤动物模型中的肿瘤生长。图16显示当气溶胶每周施用2次，施用4周时，PEI和p53基因的组合物和PEI、p53基因和抗癌药9-硝基喜树碱(9-NC)的组合物显著减少了腺癌动物模型中的肿瘤生长。图17显示了当用气溶胶传递每周2次，共4周时，PEI和p53基因的组合物显著减少了人骨肉瘤肺扩散裸鼠模型(SAOS-LM6)中肿瘤的生长。肿瘤细胞移植动物8周后开始气溶胶治疗。在同一实验中，单用PEI，PEI与CAT或IL-12基因(非特异性对照)未得到比未处理对照更低的抑制。
在该研究中，用含5％CO2的空气喷雾PEI-DNA导致肺中基因表达水平比在喷雾中使用常规空气提高。这可能是因为5％CO2存在下气流和每分呼吸量增加。在气溶胶中使用5％CO2使啮齿类肺中药物-脂质体颗粒沉积大了4-5倍。当用含5％CO2的空气传递PEI-DNA气溶胶时，可以看到小鼠呼吸得更深，更迅速，提示肺中提高的转基因表达可能是由于提高的潮流体积和呼吸频率，以及相应的气溶胶颗粒沉积的增加。然而可能增强CO2通过改变一些其他生理参数对PEI-DNA复合物的转染效力有影响。基于这些观察，含5％CO2的空气能用于其他聚合物-DNA或阳离子脂类-DNA复合物的气溶胶传递，并得到相似结果。人可以很好的适应5％CO2，并显示增加每分呼吸量，因此该策略也可能用于患肺部疾病的病人。
还优化了用PEI作为载体气溶胶基因传递的其他参数。任何阳离子载体和带负电的DNA之间的电荷相互作用是确定复合物转染效力的重要因素。气溶胶基因传递可能需要不同条件。在该系统中15∶1的N∶P比得到最高的CAT表达水平，而5∶1的N∶P比与其他比例相比导致非常低的表达水平。
相反，N∶P20∶1时获得了荧光素酶的最高表达。这可能是因为荧光素酶质粒的不同大小，导致和CAT质粒相比，与PEI形成结构不同的复合物。也可能是由于质粒纯度和超螺旋结构比例的差异。但是在两种质粒的最佳N∶P比中还是有相当的重叠。不同质粒的最佳比例可能是不同的。考虑实验变异性，10∶1和20∶1之间的比例应该是适用的。低于10∶1的比例可能在肺中得不到非常高的转染。
CAT表达的剂量反应显示每10毫升气溶胶溶液2毫克与PEI复合的DNA将在该CO2增强传递系统中获得最佳表达。当250微克DNA/10毫升溶液被喷雾给小鼠时，表达急剧下降到不显著水平。4毫克DNA与PEI复合(不同比例)导致一些DNA沉淀，这可能是转染下降的原因。应注意传递的DNA浓度和量都提高。
计算AerotechII喷雾器的喷雾输出是大约80％。用全玻璃冲击器(AGI)如前所述将约72％储器中的DNA如估计传递到吸入室。剩余的DNA被T-接头和管线捕获。基于小鼠被动鼻部呼吸、肺部生理学(每分呼吸量和沉积组分)和气溶胶的输出浓度(4.8微克/L)，估计沉积在小鼠肺中的DNA量在30分钟气溶胶接触中是约4-5微克(起始储器浓度是2毫克DNA/10毫升溶液)。
这些计算基于正常空气呼吸，在存在5％CO2时由于潮流体积和呼吸频率增加，沉积可能更高。
还用CAT表达监测基因表达的时间过程。在单剂气溶胶接触后，肺中的CAT表达在24小时时达到最高，然后在一周后跌至峰值水平的50％。甚至在10日后仍有非常显著的表达量(峰值水平的30％)。这提示聚乙烯亚胺气溶胶传递后基因表达的持续可以多于各种临床应用充分量。在该研究中直到10日基因表达仍存在，与其他用阳离子脂类滴注或气溶胶传递基因的研究中报答的相似或更大。
组织分离数据显示该系统中气溶胶传递的基因表达限于肺，表明极限全身性传递。与肺相反，肝脏、脾脏和肾脏等组织当通过静脉或腹膜内施用传递基因时，通常显示可检测表达水平，当用PEI-DNA气溶胶传递时显示不显著或不可检测的CAT表达。如果感兴趣的基因表达要限于肺部，这是重要的。气溶胶传递帮助将颗粒非侵袭性和均匀的分散在肺中。
最后也是非常重要的，肺部不显示任何炎症症状。当检测薄切片时，没有发炎细胞浸润或对肺的损伤。虽然甚至在一周后仍检测到高水平的表达，某些治疗仍需要重复和频繁的传递基因。
当气溶胶传递基因时，含5％CO2的空气可提高基因表达水平。表达在肺中占优势，甚至在气溶胶传递一周后仍然检测到高度显著的水平。PEI看来在体内表达的最佳浓度是无毒的。分枝PEI-DNA复合物的气溶胶传递代表了病毒和阳离子脂类载体介导的基因传递的价格低廉的替代方法，应对囊性纤维变性和肺癌等疾病有用。
本文引用了下列文献Boussif，O.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7297-7301。
Boussif，O.等(1996)Gene Therapy 3，1074-1080。
Crook，K.等(1996)Gene Therapy 3，834-839。
Duncan，J.E.等(1997)Human Gene Therapy 8，431-438。
Eastman S.J.等(1997)Human Gene Therapy 8，765-773。
Eastman S.J.等(1997)Human Gene Therapy 9，43-52。
Eastman SJ等(1997)Human Gene Therapy 8，313-322。
Gao，X.&Huang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179，280-285。
Goula，D.等(1998)Gene Therapy 5，1291-1295。
Haensler，J.& Szoka，F.C.(1993)Bioconj Chem.4372-379。
Kircheis，R.等(1997)Gene Therapy 4，409-418。
Ogris，M.等(1999)Gene Therapy 6，595-605。
Ogris，M.等(1999)Gene Therapy 5，1425-1433。
Schwarz，L.A.等(1996)Human Gene Therapy 7，731-741。
Tang，M.X.，& Szoka，F.C.(1997)Gene Therapy 4，823-832。
Tsan，M.-F.等(1997)Human Gene Therapy 8，817-825。
Vigneron等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93，9682-9686。
Wu，G.Y.& Wu，C.H.(1988)Biochemi stry 27，887-892。
本说明书中提到的任何专利表明了本发明涉及的领域的技术人员的水平。另外，这些专利和出版物在此引入以供参考，其程度如同各独立出版物特别并分别表明引入以供参考。
本领域技术人员将不难理解本发明适合实施目的并获得提到的结果和优点，以及那些本文中提到的目的、结果和优点。本文的实施例以及方法、程序、疗法、分子和本文所述的具体化合物是优选例的代表，是示范性的，不意味着限制本发明的范围。对于本领域技术人员可进行改变和其他用途，这些在权利要求限定的本发明的精神内。


本发明显示聚阳离子非脂类:DNA制剂能抵抗喷雾器引起的降解,并且