灰树花大规模液体深层发酵工艺制作方法

李宝健, 徐志祥

2002年3月13日

2001年9月29日

2001年9月29日

李宝健, 徐志祥

C12N1/14GK1339581SQ0112971

树花 深层 发酵 液体 工艺 大规模

1.一种灰树花大规模液体深层发酵工艺，依次包括以下步骤(1)将灰树花斜面菌种接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，25～28℃温度培养144～168小时；(2)将步骤1中所得的菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中再进行扩大培养，25～28℃温度培养96～120小时；(3)将步骤2中所得的菌种转接入一个装有发酵培养基的一级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压30～40kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.2～0.4，发酵72～96小时(4)将一级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的二级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.3～0.5，发酵72～84小时；(5)将二级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的三级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.4～0.6，发酵80～96小时；(6)将三级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的大型发酵罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率120～140r/min，通气量为1∶0.5～0.6，发酵96～120小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中50～60℃烘干至含水量低于8％2.根据权利要求1所述的灰树花大规模液体深层发酵工艺，其中步骤1中摇瓶培养基与摇瓶的容积比为1∶5～1∶10；步骤2中摇瓶培养基与摇瓶的容积比为1∶2～1∶53.根据权利要求1所述的灰树花大规模液体深层发酵工艺，其中步骤3中一级种子罐的容积为150L～300L，在该一级种子罐中装有的发酵培养基相应为100L～250L；步骤4和步骤5中的二级、三级种子罐指的是1.5吨～5吨的发酵罐，在该二级、三级种子罐中装有的发酵培养基相应为1吨～4吨4.根据权利要求1所述的灰树花大规模液体深层发酵工艺，其中步骤6中大型发酵罐指的是10吨～30吨发酵罐，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为7.5吨～24吨5.根据权利要求1或2所述的灰树花大规模液体深层发酵工艺，其中所述的摇瓶培养基的成份及其重量体积比(g/100ml)为马铃薯15％～20％，葡萄糖1％～2％，硫酸镁0.04％～0.08％，磷酸二氢钾0.1％～0.7％，维生素B1为10ppm～20ppm，加水定容至所需体积，PH值为5.5～6.06.根据权利要求1、3或4所述的姬松茸大规模液体深层发酵工艺，其中所述的发酵培养基的成份及其重量体积比(g/100ml)为玉米粉2％～3％，豆饼粉1％～2％，葡萄糖1.5％～2％，硫酸镁0.03％～0.05％，磷酸二氢钾0.1％～0.15％，维生素B1为10～20ppm，加水定容至所需体积，PH值为5.5～6.07.根据权利要求1所述的灰树花大规模液体深层发酵工艺，其中步骤6中放罐的标准为发酵液变得较为粘稠，镜检有大量菌丝体，PH值降至3.5～3.8左右，取样离心称湿菌丝体重量，较4小时前无明显增加即可放罐

本发明涉及一种灰树花10吨罐及10吨罐以上大规模液体深层发酵工艺灰树花(Grifola frondosa)，隶属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花菌属，又名贝叶多孔菌、栗子蘑、莲花菌，日本俗称舞茸灰树花是亚热带至温带森林中的大型真菌，具有独特的芳香味，营养丰富，口味鲜美，且含有丰富的生物活性物质近20年来，国内外深入开展了作为生物反应调节剂的真菌多糖的研究，灰树花多糖显著的疗效也逐渐被人们所认识经过大量的化学和药理分析发现，灰树花多糖具有明显的抗肿瘤、抗HIV病毒、改善免疫系统功能、调节血糖、血脂及胆固醇水平、降血压等作用，对防止癌细胞的生成和转移、艾滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能的紊乱都有一定的疗效，且无任何毒副作用因此，灰树花是一种极具开发价值的珍贵食、药用真菌最近，美国食品和药物管理局(FDA)证实了灰树花提取物治疗晚期乳腺癌和前列腺癌的研究结果，并允许灰树花提取物作为癌症的有效抑制剂，直接进行二期临床试验灰树花野生资源较少，目前主要通过人工栽培获得，但人工栽培具有周期长、占地面积大、产量及质量均不稳定等缺点菌丝体发酵则周期较短、产量高且质量稳定，适合工业化生产液体深层发酵上到一定规模时，各种参数的控制对整个发酵的质量起着相当重要的作用如果将小试(摇瓶或小发酵罐)工艺直接套用到大规模发酵中往往会出现参数控制失调，进而导致发酵产量质量下降因此到目前为止，尚未见到灰树花大规模工业发酵技术方面的报道，仅有一些小试方面的研究本发明的目的在于提供了一种大规模的灰树花液体深层发酵工艺，并且通过对工艺参数的研究和培养基配方的优化，使产量质量都有明显提高，从而解决了已有技术存在的各种问题为实现上述目的，本发明灰树花大规模液体深层发酵工艺依次包括以下步骤(1)将灰树花斜面菌种接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，25～28℃温度培养144～168小时；(2)将步骤1中所得的菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中再进行扩大培养，25～28℃温度培养96～120小时；(3)将步骤2中所得的菌种转接入一个装有发酵培养基的一级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压30～40kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.2～0.4，发酵72～96小时；(4)将一级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的二级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.3～0.5，发酵72～84小时；(5)将二级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的三级种子罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率100～120r/min，通气量1∶0.4～0.6，发酵80～96小时；(6)将三级种子罐中的菌种转接到一个装有发酵培养基的大型发酵罐中，保持罐温25～28℃，罐压40～50kPa，搅拌速率120～140r/min，通气量为1∶0.5～0.7，发酵96～120小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中50～60℃烘干至含水量低于8％本发明步骤1中摇瓶培养基与摇瓶的容积比为1∶5～1∶10；步骤2中摇瓶培养基与摇瓶的容积比为1∶2～1∶5本发明步骤3中一级种子罐的容积为150L～300L，在该一级种子罐中装有的发酵培养基相应为100L～250L；步骤4和步骤5中所述的二级、三级种子罐指的是1.5吨～5吨的发酵罐，在该二级、三级种子罐中装有的发酵培养基相应为1吨～4吨本发明步骤6中大型发酵罐指的是10吨～30吨发酵罐，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为7.5吨～24吨本发明中所述的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯15％～20％，葡萄糖1％～2％，硫酸镁0.04％～0.08％，磷酸二氢钾0.1％～0.7％，维生素B1为10ppm～20ppm，加水定容至所需体积，PH值为5.5～6.0本发明中所述的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉2％～3％，豆饼粉1％～2％，葡萄糖1.5％～2％，硫酸镁0.03％～0.05％，磷酸二氢钾0.1％～0.15％，维生素B1为10～20ppm，加水定容至所需体积，PH值为5.5～6.0本发明步骤6中放罐的标准为发酵液变得较为粘稠，镜检有大量菌丝体，PH值降至3.5～3.8左右，取样离心称湿菌丝体重量，较4小时前无明显增加即可放罐本发明适用于各种灰树花菌种10吨罐及10吨罐以上大规模液体深层发酵，解决了灰树花尚不能大规模生产的局限，这对灰树花工业化生产及灰树花相关应用产业的发展具有重要的意义本发明工艺发酵规模达到10吨及10吨以上，干粉得率达到0.8％～1.2％，大大提高了灰树花的产量，且100克菌丝体干粉多糖含量达到4～6克灰树花深层培养菌丝体的多糖含量在9％-12％之间而灰树花子实体中多糖含量约为5％～7％，可见灰树花深层培养菌丝体中的多糖含量明显高于子实体而且发酵液中亦含有一定量的灰树花多糖，因此发酵液也具有一定的应用价值与子实体相比，菌丝体中所含18种氨基酸明显高于子实体，其中8种人体必需氨基酸Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Val在氨基酸总量中含量较高另外深层培养灰树花菌丝体微量元素的含量总体上接近于灰树花子实体下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明实施例1将新鲜的斜面菌种接入十个装有100mL摇瓶培养基的500mL三角摇瓶中，26℃摇床培养144小时然后把两个500ml摇瓶种转接入装有1000mL摇瓶培养基的2000mL三角瓶中，26℃摇床培养100小时然后将5瓶2000mL三角瓶中扩大培养的种子转接入一个装有100L发酵培养基的总容积为150L的一级种子罐，保持罐温26℃，罐压30kPa，搅拌速率100r/min，通气量1∶0.2，发酵72小时将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温26℃，罐压40kPa，搅拌速率110r/min，通气量1∶0.3，发酵80小时将二级种子罐中菌种转接到一个装有10吨发酵培养基的15吨发酵罐中，保持罐温26℃，罐压40kPa，搅拌速率120r/min，通气量为1∶0.5，发酵110小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中60℃烘干，干粉得率为0.95％，用苯酚-硫酸法测总多糖含量为4.76克/100克干粉本实施例1中的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯15％，葡萄糖1％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，维生素B1为10ppm，加水定容至100mL、1000mL，摇瓶培养基的PH值为5.5～6.0本实施例1中的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉2％，豆饼粉1％，葡萄糖1.5％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.1％，维生素B1为10ppm，加水定容至100L、1吨、10吨，发酵培养基的PH值为5.5～6.0本实施例1步骤5中放罐的标准为发酵液变得较为粘稠，镜检有大量菌丝体，PH值降至3.5～3.8左右，取样离心称湿菌丝体重量，较4小时前无明显增加即可放罐实施例2将新鲜的斜面菌种接入十个装有80mL摇瓶培养基的500mL三角摇瓶中，25℃摇床培养168小时然后把两个500mL摇瓶种转接入装有1000mL摇瓶培养基的3000mL三角瓶中，25℃摇床培养110小时，然后将5瓶3000mL三角瓶中扩大培养的种子转接入一个装有100L发酵培养基的总容积为150L的一级种子罐，保持罐温25℃，罐压30kPa，搅拌速率100r/min，通气量1∶0.3，发酵78小时将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温25℃，罐压40kPa，搅拌速率120r/min，通气量1∶0.4，发酵88小时将二级种子罐中菌种转接到一个装有10吨发酵培养基的15吨发酵罐中，保持罐温25℃，罐压45kPa，搅拌速率130r/min，通气量为1∶0.5，发酵115小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中55℃烘干，干粉得率为1.04％，用苯酚-硫酸法测总多糖含量为5.14克/100克干粉本实施例2中的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯16％，葡萄糖1.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.5％，维生素B1为18ppm，加水定容至80mL、1000mL，摇瓶培养基的PH值为5.5～6.0本实施例2中的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉2％，豆饼粉1.5％，葡萄糖1.8％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.15％，维生素B1为16ppm，加水定容至100L、1吨、10吨，发酵培养基的PH值为5.5～6.0本实施例2步骤5中放罐的标准与实施例1相同实施例3将新鲜的斜面菌种接入十个装有100mL摇瓶培养基的500mL三角摇瓶中，27℃摇床培养150小时然后把两个500mL摇瓶种转接入装有1000mL摇瓶培养基的2500mL三角瓶中，27℃摇床培养96小时，然后将5瓶2500mL三角瓶中扩大培养的种子转接入一个装有100L发酵培养基的总容积为150L的一级种子罐，保持罐温27℃，罐压40kPa，搅拌速率100r/min，通气量1∶0.35，发酵84小时将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温27℃，罐压45kPa，搅拌速率110r/min，通气量1∶0.45，发酵78小时将二级种子罐中菌种转接到一个装有10吨发酵培养基的15吨发酵罐中，保持罐温27℃，罐压50kPa，搅拌速率135r/min，通气量为1∶0.6，发酵112小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中58℃烘干，干粉得率为1.17％，用苯酚-硫酸法测总多糖含量为5.78克/100克干粉本实施例3中的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯15％，葡萄糖1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.5％，维生素B1为15ppm，加水定容至100mL、1000mL，摇瓶培养基的PH值为5.5～6.0本实施例3中的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉2％，豆饼粉1.5％，葡萄糖1.8％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.1％，维生素B1为15ppm，加水定容至100L、1吨、10吨，发酵培养基的PH值为5.5～6.0本实施例3步骤5中放罐的标准与实施例1相同实施例4将新鲜的斜面菌种接入十六个装有100mL摇瓶培养基的500mL三角摇瓶中，26℃摇床培养144小时然后把两个500mL摇瓶种转接入装有1500mL摇瓶培养基的3000mL三角瓶中，26℃摇床培养100小时，然后将8瓶3000mL三角瓶中扩大培养的种子转接入一个装有150L发酵培养基的总容积为300L的一级种子罐，保持罐温26℃，罐压30kPa，搅拌速率115r/min，通气量1∶0.35，发酵90小时将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温26℃，罐压45kPa，搅拌速率120r/min，通气量1∶0.45，发酵84小时将二级种子罐中的菌种转接到一个装有3.5吨发酵培养基的5吨三级种子罐中，保持罐温26℃，罐压45kPa，搅拌速率120r/min，通气量1∶0.5，发酵82小时；将三级种子罐中菌种转接到一个装有15吨发酵培养基的30吨发酵罐中，保持罐温25℃，罐压50kPa，搅拌速率130r/min，通气量为1∶0.6，发酵110小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中50℃烘干，干粉得率为0.92％，用苯酚-硫酸法测总多糖含量为4.73克/100克干粉本实施例4中的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯18％，葡萄糖1.5％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.6％，维生素B1为18ppm，加水定容至100mL、1500mL，摇瓶培养基的PH值为5.5～6.0本实施例4中的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉2.5％，豆饼粉1.5％，葡萄糖1.8％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.12％，维生素B1为18ppm，加水定容至150L、1吨、3.5吨、15吨，发酵培养基的PH值为5.5～6.0本实施例1步骤6中放罐的标准为发酵液变得较为粘稠，镜检有大量菌丝体，PH值降至3.5～3.8左右，取样离心称湿菌丝体重量，较4小时前无明显增加即可放罐实施例5将新鲜的斜面菌种接入十八个装有100mL摇瓶培养基的500mL三角摇瓶中，28℃摇床培养144小时然后把两个500mL摇瓶种转接入装有1500mL摇瓶培养基的4000mL三角瓶中，28℃摇床培养120小时，然后将9瓶4000mL三角瓶中扩大培养的种子转接入一个装有180L发酵培养基的总容积为300L的一级种子罐，保持罐温28℃，罐压40kPa，搅拌速率120r/min，通气量1∶0.4，发酵96小时将种子罐菌种转接到一个装有1.6吨发酵培养基的2吨二级种子罐中，保持罐温28℃，罐压45kPa，搅拌速率110r/min，通气量1∶0.4，发酵82小时将二级种子罐中的菌种转接到一个装有4吨发酵培养基的5吨三级种子罐中，保持罐温28℃，罐压45kPa，搅拌速率120r/min，通气量1∶0.5，发酵90小时；将三级种子罐中菌种转接到一个装有24吨发酵培养基的30吨发酵罐中，保持罐温28℃，罐压50kPa，搅拌速率140r/min，通气量为1∶0.6，发酵112小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得湿菌丝体，然后放入真空干燥机中60℃烘干，干粉得率为0.83％，用苯酚-硫酸法测总多糖含量为4.28克/100克干粉本实施例5中的摇瓶培养基的成份配比(重量体积比g/100ml)为马铃薯20％，葡萄糖2％，硫酸镁0.08％，磷酸二氢钾0.7％，维生素B1为20ppm，加水定容至100mL、1500mL，摇瓶培养基的PH值为5.5～6.0本实施例5中的发酵培养基的成份及配比(重量体积比g/100ml)为玉米粉3％，豆饼粉2％，葡萄糖2％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.15％，维生素B1为20ppm，加水定容至180L、1.6吨、4吨、24吨，发酵培养基的PH值为5.5～6.0本实施例5步骤6中放罐的标准与实施例4相同